Name: השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: למד עריכת גנום CRISPR/Cas9 בדגים חשמליים חלשים ממשפחות Gymnotiformes ו-Mormyridae. הפרוטוקול כולל טכניקות מיקרו-הזרקה להפקת עוברים מוטנטיים F0 לחקר פונקציית גנים והשפעתן על התנהגות ופיזיולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים את המאמצים ההרואיים של מוניקה לוקאס, קת'רין שאו, ריאן טיילור, ג'ארד תומפסון, ניקול רוביצ'ד, ותקווה הילי לעזרה עם גידול דגים, איסוף נתונים, ופיתוח פרוטוקולים מוקדם. כמו כן, אנו רוצים להודות לשלושת הבודקים על הצעותיהם לכתב היד. אנו מאמינים שהמוצר הסופי יהיה באיכות טובה יותר לאחר התייחסות לערותיהם. עבודה זו ממומנת על ידי תמיכה של הקרן הלאומית למדע #1644965 ו#1455405 ל-JRG, ואת מדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה DG מעניקים VLS.

. למחברים אין מה לגלות

העושר פנוטילי של דג חשמלי חלש, יחד עם התפשטות האחרונות של משאבי גנומיקה, מניע צורך חזק עבור כלים גנוטים פונקציונלי במודל של דגים חשמליים חלש. מערכת זו היא אטרקטיבית במיוחד בשל האבולוציה מתכנסת של תכונות פנויואיות רבות בתוך ליננים מקבילים של דגים, אשר נשמרים בקלות במעבדה.
הפרוטוקול המתואר כאן ממחיש את היעילות של טכניקת CRISPR/Cas9 בזמן שורה של דג חשמלי חלש שפיתח אלקטרוגנזה והתפשלות חשמלית במקביל, ולכן מייצג צעד משמעותי עבור ההבטחה של המודל הזה עבודה עתידית בגנומיקה השוואתית של אבולוציה פנוטימית...

הגשלות האלקטורלוגיה ואלקטרוגנזה השתנו בהיסטוריה האבולוציונית של החוליות. שני מדורות של דגי teleost, אוסטוריאים וסילאואים, התפתחו התפשלות חשמלית במקביל, וחמש שנות שילוח (ממוראים, מוררידים, וכללי אסטרוסקופוס, מאלאפטראורוס וסינודונטיס) התפתחו אלקטרוגנזה במקביל. יש מידה מרשימה של התכנסות אלה פנוטיפים נגזר באופן עצמאי, אשר חולקים ארכיטקטורה גנטית משותפת1,2,3.
זה אולי הטוב ביותר לידי ביטוי על ידי התכונות הרבות מתכנסת של טפסי ממורשים ו mormyrids, שני מינים עשירים teleost clades, אשר לייצר ולזהות שדות חשמליים חלשים והם נקראים דגים חשמליים חלש. בשנים 50 מאז גילוי כי הדגים החשמליים חלש להשתמש בחשמל כדי לחוש את סביבתם ולתקשר4, קהילה גוברת של מדענים צברה תובנות עצומות לתוך האבולוציה של פיתוח1,5 ,6, מערכות ומעגלים מדעי המוח7,8,9,10, פיזיולוגיה הסלולר11,12, אקולוגיה ו energetics13 ,14,15,16,17, התנהגות18,19, ומאקרואבולוציה3,20,21 .
לאחרונה, יש התפשטות של גנומית, טראנסקריפט, ו פרוטאומית משאבים עבור דגים חשמליים1,22,23,24,25,26, 27,28. השימוש במשאבים אלה כבר הפיק תובנות חשובות בנוגע לקשר בין גנוטיפ לפנוטיפ במינים אלה1,2,3,28,29 ,30. מכשול גדול כדי לשלב נתונים גנומיקה עם נתונים פנוטימית של דגים חשמליים חלש הוא חוסר הנוכחי של כלים גנומיקה תפקודית31.
אחד כלי כזה הוא שפותחה לאחרונה באשכולות באופן קבוע במרווחים של Palindromic קצר לזווג עם Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR) טכניקה. Crispr/Cas9 הוא כלי עריכת הגנום כי נכנס לשימוש נרחב בשני דגם32,33,34 ו אורגניזמיםשאינם מודל 35,36, 37 כאחד . CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה התקדמה לנקודה שבה מעבדה המסוגלת ביולוגיה מולקולרית בסיסי יכול בקלות ליצור גנים ספציפיים המכונה RNAs מדריך קצר (sgRNAs), בעלות נמוכה באמצעות שיטה שאינה שיבוט38. Crispr יש יתרונות על אחרים הסתרה/מיקוד אסטרטגיות, כגון activator olinos39,40, תמלול שעתוק כמו הנוקלאוסים (talens), ו אבץ האצבעות הנוקלאוטיות (zfns), אשר יקרים ו זמן רב להפיק. עבור כל גן מטרה
מערכת CRISPR/Cas9 פונקציות כדי ליצור הסתרה גנים על ידי התמקדות באזור ספציפי של הגנום, בבימויו של רצף sgRNA, וגרימת הפסקה כפולה תקוע. הפסקה כפולה נתקע מזוהה על ידי התא ומפעילה מנגנוני תיקון DNA אנדוגניים המועדפת באמצעות הסוף הלא הומוולוגי להצטרף (NHEJ) המסלול. מסלול זה הוא מאוד מועדת לטעויות: במהלך תהליך התיקון, מולקולת ה-DNA כוללים לעתים קרובות הוספות או מחיקות (indels) באתר הפריצה כפול תקוע. Indels אלה יכולים לגרום לאובדן של הפונקציה בשל אחד (1) משמרות במסגרת הקריאה הפתוחה, (2) החדרת codon עצירה מוקדמת, או (3) משמרות במבנה העיקרי הקריטי של המוצר הגן. בפרוטוקול זה, אנו מנצלים CRISPR/Cas9 עריכה כדי מוטציות נקודת היעד בגנים היעד באמצעות NHEJ ב מינים של דגים חשמליים חלש. בעוד ששיטה זו פשוטה ויעילה יותר מטכניקות אחרות, צפויה שיטה זו של מוטגנזה לגרום למגוון של התסופנותולים ב-F0, המיוחס לפסיפס גנטי41,42,43 ,44
מבחר של אורגניזמים לצורך הקלה על מחקרים עתידיים על הגנומיקה השוואתית של דג חשמלי חלש, מינים מייצגים עבור הטפסים ומורמירידים לפיתוח פרוטוקולים הדרושים כדי להיבחר. בעקבות דיונים במהלך הפגישה 2016 דג חשמלי במונטווידאו, אורוגוואי, היה קונצנזוס הקהילה לנצל מינים שכבר יכול להיות מתרבה במעבדה, כי היו משאבים גנומית זמין. והמורמיטיוס של ברימאסיוס . נבחרו כמינים המתאימים לקריטריונים הללו... בשני המינים, רמזים טבעיים כדי לגרום ולשמור על תנאי הרבייה קל לחקות בשבי. ב. gauderio, מינים בצורת מיני מדרום אמריקה, יש את היתרון של דרישות גידול נמוכות: ניתן לשמור על הדגים בצפיפות גבוהה יחסית בטנקים קטנים יחסית (4 ל). ב. gauderio גם יש מחזור דורי מהיר בתנאים שבויים. בתנאי מעבדה, B. gauderio יכול להתפתח ביצה למבוגר בתוך כ 4 חודשים.
ב. ברכסיטיוס, זן של דג מורמי ממערב אפריקה, מוליד בקלות בשבי. ב. ברכסיטיוס הוא זמין באמצעות הסחר באקווריום, נעשה שימוש נרחב במחקרים רבים, וכעת יש מספר משאבים גנומית זמין. מחזור חייהם משתרע על פני 1-3 שנים, תלוי בתנאי מעבדה. דרישות הגידול מאינטנסיביות מעט יותר עבור מין זה, הדורשות מיכלים בגודל בינוני (50 ל-100 ליטר) בשל התוקפנות שלהם במהלך הרבייה.
מעבדות לימוד מינים אחרים של דגים חשמליים צריך להיות מסוגל להתאים בקלות את הפרוטוקול הזה כל עוד המינים יכולים להיות מתרבה, ועוברי תא בודד ניתן לאסוף והתרומם לתוך בבגרות. הדיור, גידול הזחל, ו הפריה חוץ גופית (IVF) התעריפים עשויים להשתנות עם מינים אחרים; עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת התחלה עבור ניסיונות רבייה של דגים חשמליים חלש אחרים.
יעד הגן האידיאלי עבור הוכחת המושג: scn4aa מורגמיל חשמלי חלש ודגים מיוחדים יוצרים שדות חשמליים (אלקטרוגנזה) על ידי הפעלת איבר מיוחד, שנקרא עוגב חשמלי. מקלעת לאיברים חשמליים (EODs) נובעת מייצור סימולטני של פוטנציאל פעולה בתאי איבר חשמלי הנקרא אלקטרוציטים. EODs מזוהים על ידי מערך של אלקטורים חשמליים בעור כדי ליצור תמונות חשמל ברזולוציה גבוהה של הסביבה של הדג45. דגים חשמליים חלש הם גם מסוגלים לזהות תכונות של הפרטים שלהם ' EOD גל טפסים18 , כמו גם את שיעורי השחרור שלהם46, המאפשר eod לתפקד בנוסף כאות תקשורת חברתית האנלוגית לשיר ציפורים או צפרדע ברירתמ47.
המרכיב העיקרי של הדור הפוטנציאלי לפעולה באלקטרוציטים של מורגמיל הן והוא בצורה מאוד לא ברור דגים חשמליים חלש הוא ערוץ הנתרן מגודרת מתח 1.42. טלאוסטים שאינם חשמליים מבטאים שני עותקי גנים paralogous, scn4aa ו scn4ab, קידוד עבור ערוץ הנתרן מגודרת מתח 1.430. בשני הצדדים האלה ומורייפטור מפני הscn4aa דגים חשמליים חלש, התפתחו במהירות ועברו החלפות חומצות אמינו רבות המשפיעות על המאפיינים הקינטית שלה48. והכי חשוב, scn4aa הפכה להיות ממדר בשני הצדדים לעוגב חשמלי2,3. הביטוי המוגבל יחסית של scn4aa לאיבר החשמלי, כמו גם התפקיד העיקרי שלה בדור של eods, הופך אותו יעד אידיאלי עבור הניסויים CRISPR/Cas9, כפי שיש לו אפקטים מינימליים מינימלית pleiotropic. בגלל הדגים החשמליים חלש להתחיל לפתוח את הזחל שלהם האיברים החשמליים 6-8 ימים הפריה פוסט (DPF), פילוח של scn4aa הוא אידיאלי מתאים לפנוטיפים מהירים לאחר העובר מיקרוהזרקה.

<table><tbody><tr><td>20 מ"ג/מ"ל RNA כיתה גליקוגן</td><td>תרמו מדעי</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>50 bp סולם DNA</td><td>NEB</td><td>N3236L</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה</td><td>מכשיר סאטר</td><td>BF100-58-10</td> <td>(OD 1.0 מ"מ, מזהה 0.58 מ"מ, אורך 10 ס"מ)</td></tr> <tr><td>חלבון Cas9 עם NLS; 1 מ"ג/מ"ל</td><td>PNA ביולוגיה</td><td>CP01</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy דם & ערכת רקמות</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5252000021</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-654</td><td>המכונה "מזרק זכוכית מדויק" בפרוטוקול</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>מכונה "ניגוב משימות עדין" בפרוטוקול</td></tr><tr><td>ערכת תמלול MEGAscript T7</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3</td><td>NEB</td><td>B7003S</td><td>המשמש לבדיקת מחשוף במבחנה</td></tr><tr><td>OneTaq ערכת DNA</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Ovaprim</td><td>Syndel ארה"</td>ב <td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td><td>מכונה "חומר השרצה" בפרוטוקול</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>המכונה "תרמופלסטי" בפרוטוקול</td></tr><tr><td>חולץ פיפטה</td><td>WPI</td><td>SU-P97</td><td>מותג סאטר</td></tr><tr><td>QIAquick PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>מחט לשימוש חוזר - דורש התאמה אישית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>7803-02</td><td>התאמה אישית לאורך 0.7 אינץ'; סגנון נקודה 4 וזווית 25</td></tr><tr><td>T4 DNA פולימראז</td><td>NEB</td><td>M0203L</td><td>השתמש עם מאגר NEB 10x הכלול</td></tr><tr><td>בכלים מצופים טפלון</td><td>bonefolder.com</td><td>T-SPATULA4PIECE</td><td>המכונה "פוליטטרפלואורואתן" בפרוטוקול</td></tr></tbody></table>

השתקה הניצוץ: crispr/cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

הגשלות האלקטורלוגיה ואלקטרוגנזה השתנו בהיסטוריה האבולוציונית של החוליות. יש מידה מרשימה של התכנסות אלה פנוטיפים נגזר באופן עצמאי, אשר חולקים ארכיטקטורה גנטית משותפת. זה אולי הטוב ביותר לידי ביטוי על ידי התכונות הרבות מתכנסת של צורות הג ו mormyrids, שני מינים עשירים teleost clades כי לייצר ולזהות שדות חשמליים חלשים והם נקראים דגים חשמליים חלש. בשנים 50 מאז התגלית כי הדגים החשמליים חלש להשתמש בחשמל כדי לחוש את סביבתם ולתקשר, קהילה גוברת של מדענים צברה תובנות עצומות להתפתחות של פיתוח, מערכות ומעגלים מדעי המוח, פיזיולוגיה של הסלולר, אקולוגיה, ביולוגיה אבולוציונית והתנהגות. לאחרונה, יש התפשטות של משאבים גנומית עבור דגים חשמליים. השימוש במשאבים אלה כבר הנחה תובנות חשובות לגבי הקשר בין הגנוטיפ לבין הפנוטיפים במינים אלה. מכשול גדול לשילוב נתונים גנומיקה עם נתונים פנוטים של דגים חשמליים חלש הוא העדר הנוכחי של כלי גנומיקה תפקודית. אנו מדווחים כאן פרוטוקול מלא לביצוע CRISPR/Cas9 מוטגנזה אשר מנצל מנגנוני תיקון DNA אנדוגניים בדגים חשמליים חלש. אנו מדגימים כי פרוטוקול זה הוא יעיל באותה מידה הן מיני מורגמיל ברינורוס ברכימיטיוס ואת הטופס המסוןברכימוטציות gauderio באמצעות Crispr/Cas9 כדי למקד את indels ואת הנקודה המוטציות באקסון הראשון של ערוץ הנתרן גן scn4aa. באמצעות פרוטוקול זה, עוברים משני המינים הושגו והוקלדה על מנת לאשר כי המוטציות החזוי ב הראשון של ערוץ הנתרן scn4aa היו נוכחים. הצלחת להוריד את ההצלחה פנוטיפ היה אישר עם הקלטות מראה מופחת החוצה איבר חשמלי הפחתת המוני כאשר לעומת שולטת בגודל לא מוזרק התאמה.

אתרי היעד sgrna זוהו בתוך אקסון 1 של scn4aa בשני ב. gauderio ו -b. ברכסינטיוס כפי שמתואר בסעיף 1. SgRNAs נוצרו כמתואר בסעיף 2. בעקבות בחירה מוצלחת sgRNA וסינתזה (איור 1), במחשוף מבחנה נבדק (איור 2). SgRNAs הפגינו חיתוך מחוץ לכאן נבחרו לאחר מכן עבור מיקרוזריקות תא בודד.
דגים מבוגרים היו ממוזגים עבור רבייה (סעיף 4.1), ולאחר מכן הוזרק עם סוכן השאיפה (סעיף 4.2) ולאחר מכן לחצה (ב. gauderio) עבור IVF כמתו...

כאן, פרוטוקול מוצג לייצר והאחורי CRISPR/Cas9 הגנום מנוקאאוט דגים חשמליים. מפורטים בפירוט הינם דרישות הביולוגיה המולקולרית, הרבייה והטיפול בשני הצדדים, ובטכניקות הזרקה ושיטות הזרקת הCas9 המושרה ביותר.

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

עריכת גנים CRISPR/Cas9 בדגים חשמליים חלשים, במיוחד בהקשר השוואתי, תאפשר לחוקרים לבדוק השערות לגבי האופן שבו גנים ספציפיים ושונות גנטית תורמים לשינויים פנוטיפיים. CRISPR/Cas9 היא שיטה יעילה ליצירת עוברי F-Zero מוטנטים. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבצע מניפולציות CRISPR-Cas9 בשני מינים מפותחים של דגים חשמליים חלשים.המפתח לשימוש בגישה זו עם כמה שינויים בדגים חשמליים אחרים או מיני דגים אחרים הוא הזמינות של משאבים תעתיקים או גנומיים כדי להפוך sgRNAs. ביצוע microinjections ו לדמיין את התאים במיקום 3D בתוך מישור 2D יכול להיות קשה. השג מושבת זברה קטנה לביצים כדי לתרגל טכניקות מיקרו-ג'ינג'יות כלליות.מדגים את ההליך עם Savvas קונסטנטינו יהיה ג'ארד תומפסון, טכנאי מהמעבדה שלי. לאחר דיור מיני הדגים של עניין בתנאי הרבייה המתאימים, לזהות דגים נקבה המופיעים gravid. בB.gauderio, הנקבה תהיה גונדות נפוחות רק caudal לאוורור.ב B.brachyistius נקבות יהיו בטן נפוחה ולהופיע עמוק גוף. לאחר ניהול הרדמה, להוסיף סוכן להשריץ ארבע פעמים את נפח DPBS בצינור PCR עם ערבוב יסודי. הפתרון יהיה מעונן.השתמש פיפטה כדי למדוד את המינון המחושב ולחלק את הסוכן מדולל אל חתיכת תרמופלסטי לפני ציור הפתרון לתוך מזרק זכוכית מדויק מצויד 28-מד 19 כדי 25 מיליליטר אורך משופע מחט. להזריק את הפתרון לתוך שריר תא המטען הגבי בקצב חלק ולתת את המ

silencing-the-spark-crisprcas9-genome-editing-in-weakly-electric-fish

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר טכניקת הפלת גנים באמצעות חסימת מורפולינוס תרגומית המוזרקת במיקרו בשלב התא האחד של דג המערות. מורפולינוסים הם אוליגונוקלאוטידים של DNA הנקשרים לרצף המשלים של mRNA המטרה וחוסמים את תרגומו לחלבון. כתוצאה מכך, מורפולינוסים משמשים ככלים מולקולריים כדי לעצור או להפחית את ביטוי הגן באופן זמני.

Morpholino Mediated Gene Editing: טכניקת הפלת גנים באמצעות חסימת מורפולינו אוליגונוקלאוטידים בביצי דגי מערות חד-תאיים

מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

ג'ין-מיקוד mutagenesis ניתן כיום במגוון רחב של אורגניזמים באמצעות טכניקות עריכה הגנום. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול mutagenesis גן ממוקד באמצעות מפעיל שעתוק כמו nucleases המפעיל (TALENs) ב Astyanax mexicanus, זן של דגים הכולל דגי שטח cavefish.

הגנום עריכה<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; שימוש תמלול Activator דמוי מפעיל nucleases (TALENs)

פרוטוקול microinjection פשוטה ויעילה לעריכה ג'ין ב ערוץ שפמנון עוברי באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 מוצג. ב פרוטוקול זה, מדריך RNAs, חלבון Cas9 היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. פרוטוקול זה אומתה על ידי לדפוק שני גנים הקשורים החיסון ערוץ שפמנון.

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

אנו מתארים גישות על המניפולציה של גנים במערכת המודל האבולוציוני Astyanax mexicanus. שלוש טכניקות שונות מתוארים: בתיווך Tol2 transgenesis, יישוב מניפולציה של הגנום באמצעות CRISPR/Cas9, ואת נוקאאוט של הביטוי תוך שימוש morpholinos. כלים אלה צריך לאפשר חקירה ישירה של גנים שבבסיס וריאציית בין פני השטח - ואת מערת המגורים טפסים.

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

כאן, אנו מתארים כלי לעריכת גנום המבוסס על ייצוב זמני ומותנה של מקובצים באופן קבוע בין-חללים קצרים פלינדרומיים חוזרים- (CRISPR-) חלבון הקשורים 9 (Cas9) תחת המולקולה הקטנה, Shield-1. השיטה יכולה לשמש לתאים בתרבית ומודלים של בעלי חיים.

ערכת כלים חדשה להערכת פונקציות גנים באמצעות ייצוב מותנה של Cas9

פרוטוקול זה מתאר גישה המאפשרת עריכות מדויקות של דגי זברה באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. צינור פנוטיפ מוצג כדי להדגים את הישימות של טכניקות אלה כדי לדגום וריאנט גן הקשור לתסמונת QT ארוכה.

CRISPR-Cas9-עריכות מדויקות בתיווך בלבבות דגי זברה

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע עריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM כדי לבנות מודל מדויק של מחלת דגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e.

עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

למד עריכת גנום CRISPR/Cas9 בדגים חשמליים חלשים ממשפחות Gymnotiformes ו-Mormyridae. הפרוטוקול כולל טכניקות מיקרו-הזרקה להפקת עוברים מוטנטיים F0 לחקר פונקציית גנים והשפעתן על התנהגות ופיזיולוגיה.

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

גלה סרטונים נוספים