Name: הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: חקור דינמיקת מיטוזה וצורת המטאפזה באמצעות הדמיית תאים חיים. השיטה מאפשרת הערכת פגמים מיטוטיים וניתוח השפעת תרופות אנטי-מיטוטיות על חלוקת תאים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DLM נתמך על-ידי NSF GRFP. ALM נתמך על ידי מימון פרס משפחת סמית ' למצוינות במחקר ביו-רפואי.

1. הדור של hTERT-RPE-1 תאים באופן בלתי נשכח RPE-Histone 2B (RPE-H2B) ו-α-טובולין-EGFP (אמבטיה-EGFP)
הערה: כל השלבים לעקוב אחר טכניקות אספטי ולהתקיים ברמת בטיחות II + (BSL2 +) בטיחות ארון.
<ol><li>ליצור רטרו וירוס נושאת את הגנים של עניין (α-טובולין-EGFP ו-RFP-H2B) על ידי העברת הקשר של תאים 293T עם הפלסטיק המתאים הפלגידים על פי הוראות היצרן של המערכת המבוססת על מערכת העברת שומנים.<ol>
<li>יום 1: השימוש זכוכית חד פעמית פסטר הצינורות כדי לטפי את המדיום תרבות התא מלוח של תת-confluent 293T תאים ולשטוף את המדיום שיורית עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) על ידי הוספת 5 מ ל של PBS. מערבולת כדי לפזר את ה-PBS בתחתית הצלחת, ולאחר מכן לבשל את ה-PBS עם משקה מזכוכית סטרילי חד פעמית של פסטר.</li>
		<li>להוסיף 2 מ ל 0.05% טריפסין שכבר מחומם מראש ל 37 ° c ולהחזיר את הצלחת לתוך החממה מחולל לחות ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 2 כדי 5 דקות כדי לאפשר לתאים חסיד להשתחרר ממשטח הכלים של התרבות התא.</li>
		<li>הוסף 8 מ ל של מדיום הנשר החדש של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום בפרה העובר (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין לצלחת המכילה טריפסין.</li>
		<li>השהה את התאים מחדש על ידי ליטוף בעדינות והעבר את ההשעיה לצינורית חרועה בעלת 15 מ"ל. מניחים את צינור חרוט בצנטריפוגה מאוזנת ספין ב 161 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנקז בעדינות את התאים.</li>
		<li>משלחים את התמיסה המדיום/טריפסין מתאי הפלטד ומשהה מחדש את התאים ב-10 מ ל בתוספת של 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. השתמש הומוציטוטומטר כדי לספור את ההשעיה של התא 293T ואת צלחת 2 x 106 293t תאים לכל באר של 6 צלחת הבאר.</li>
		<li>תאים התרבות בנפח כולל של 2 מ ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין ולתחזק החממה לחות בתוך 37 ° c עם 5% CO2.</li>
		<li>יום 2: פיפטה 7 μL של משלוח השומנים המבוסס על מסירה מגיב ו-100 μL של בינוני סרום מופחת לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולאפשר את זה כדי דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות (צינור #1).</li>
		<li>במבחנה נפרדת 1.5 mL, פיפטה 1 μg של RFP-H2B ביטוי וקטור (או 1 μg של α-טובולין-EGFP ביטוי וקטור), יחד עם 5 משפר μL מגיב (כנדרש לכל יצרן של הנחיות), 0.5 μg pMD2. G, ו 1 μg psPAX2 ו 100 μL של מופחת סרום בינוני (צינור #2).</li>
		<li>לשלב את התוכן של צעד 1.1.7 ו1.1.8 צעד על ידי שפופרת ליטוף בזהירות #2 לתוך צינור ה#1 ו-דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: ניתן לשנות את התגובה בהתאם לצורך העברה של תאים בבארות נוספות.</li>
		<li>פיפטה התגובה הטרנספופית לתוך הטוב הרצוי המכיל תאים 293T 2 מ ל של בינוני ולהחזיר את הצלחת לתוך החממה לחות ב 37 ° c עם 5% CO2. הערה: כדי ליצור תאים המבטאים הן RFP-H2B ו-α-טובולין-EGFP, ליצור וירוס נפרד עבור כל ביטוי לבנות (שלבים 1.1.7-1.1.9).</li>
		<li>יום 3: מנושף ומחליף את המדיום עם 2 מ ל של Dמאמ טרי שיושלם עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. להחזיר את הצלחת לתוך החממה לחות ב 37 ° c עם 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 4: לאסוף את המדיום המכיל חלקיקי וירוס ביטא, להיות זהירים לא לשבש או להסיר תאים 293T. סנן את המדיום המכיל חלקיקי וירוס על-ידי העברתו דרך מסנן μM 0.45 מוצמד למזרק של 5 מ"ל. וירוס הורדה לאחסון לטווח קצר ב 4 ° c, או אחסון לטווח ארוך ב-80 ° c. הערה: חלקיקים ויראליים המתקבלים באופן זה יהיו נוכחים בטווח של ~ 1 x 107 כדי 1 x 108 התמרה יחידות/mL. כמו התאים המייצרים ויראלי תאים להיות נגועים הן מתרבות באותו בינוני, ריכוז נגיפי להחליף את המדיום הוא לא נדרש חלקיקים ויראלי מסוננים ניתן להשתמש ישירות כדי להדביק תאים.</li>
	<li>הזרע 2 x 105 htert-rpe-1 תאים לכל טוב של מאכל 6-טוב לקראת הזיהום ויראלי. התאים התרבותיים ב 2 מ ל של DMEM שיושלם עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין ולתחזק בחממה לחות ב 37 ° c עם 5% CO2.</li>
	<li>יום 5: הוספת הקסאדימראן ברומיד (לדוגמה, polybrene) אל hTERT-RPE-1 תאים לריכוז הסופי של 8 μg/mL. להדביק תאים עם תערובת של 500 μL של וירוס מדולל ב 500 μL של תרבות התא בינונית. הערה: מניות הקסאדיהמרין מוכנות לפתרון מלאי סטרילי במים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן מסוננים באמצעות פילטר 0.45 יקרומטר.</li>
	<li>יום 6: באמצעות משקה זכוכית חד פעמית פסטר, מרוב המדיום מבארות המכילות את התאים הנגועים בווירוס. החלף את מדיום תרבות התא עם 2 מ ל של DMEM המכיל 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, וריכוזים המתאים של אנטיביוטיקה כדי לבחור עבור שילוב וביטוי פלסמיד. הערה: הביטוי α-טובולין-EGFP משמש בניסויים המתוארים נושאת גן ההתנגדות הpuromycin וביטוי RFP-H2B באמצעות פלסמיד נושאת גן התנגדות בלאסיניפין. לכן, 10 μg/mL של puromycin ו 2 μg/mL של בלטות משמשים עבור הבחירה של α-טובולין-EGFP, RFP-H2B ביטוי hTERT RFP-1 תאים. ריכוזי אנטיביוטיקה המשמשים לבחירה עשויות להיות שונות עבור קווי תאים שונים המשמשים.</li>
	<li>לשמור על תאים תחת בחירה אנטיביוטי עבור 5-7 ימים, החלפת המדיום כל 3 ימים עם בינוני טרי המכיל ריאגנטים בחירה מתאים. הערה: יש לשמור על התאים במפגש המשנה במהלך הבחירה ויש להרחיב אותם לפי הצורך, כפי שמתואר בשלבים 1.1.1 to 1.1.4.</li>
	<li>השתמש בדימות immunofluorescence כדי לאשר את הביטוי של מבנים מתויגים. הערה: אם רצונך בכך, ניתן לגזור שיבוטים של תא בודד כדי לקבל רמות ביטוי אחיד בתוך אוכלוסיית התא. לאחר שיבוטים יציבים מאושרות, התאים יכולים להישמר תחת תנאי התרבות הסטנדרטיים בהעדר בחירה אנטיביוטי.</li>
</ol>2. הכנת תאים לדימות תאים חיים בעקבות mitotic ציר רטבאליות
הערה: השתמש בטכניקות אספטי ולבצע את השלבים בארון בטיחות BSL2.
<ol><li>באמצעות מכשיר זכוכית סטרילי חד פעמי, מתכלה את המדיום מלוחית התרבות המכילה את קו התא הנושא את בניית הביטויים (משלב 1.7). שוטפים בקצרה את התאים עם 10 מ ל של הערוץ הסטרילי. , מערבולת כדי לפזר את הערוץ התחתון. ולאחר מכן לבשל את הערוץ החדש</li>
	<li>הוסף 2 מ ל של 0.05% טריפסין לצלחת 10 ס מ. מודדת את הצלחת ב 37 ° c עבור 2-5 דקות או עד תאים מנותקים ממשטח הצלחת.</li>
	<li>הוסיפו 8 מ ל של בינוני טרי לצלחת המכילה טריפסין. השהה את התאים מחדש על ידי ליטוף בעדינות והעבר את ההשעיה לצינורית חרועה בעלת 15 מ"ל. מניחים את צינור חרוט בצנטריפוגה מאוזנת ספין ב 161 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנקז בעדינות את התאים.</li>
	<li>שימו לב בזהירות על הסופרנטנט והשעיה מחדש ב-10 מ ל של PBS על ידי ליטוף בעדינות עם פיפטה בגוון של 10 מ ל. מניחים את צינור חרוט בצנטריפוגה מאוזנת ספין ב 161 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנקז בעדינות את התאים.</li>
	<li>שימו לב בזהירות על הסופרנטאנט והשעיה מחדש ב-10 מ ל של המדיום הטרי על ידי ליטוף בעדינות עם פיפטה בגודל 10 מ ל.</li>
	<li>ספירת תאים, לאחר מכן לחשב את מספר התא באמצעות hemacytometer ולדלל לריכוז של 1-2 x 105 תאים/mL במדיום תרבות התא. Seed 500 μL של התא הבולם כל טוב של לוחית סטרילי 12-היטב הדמיה התמונה. מניחים את הצלחת בחממה תרבות התא ולאפשר לתאים לדבוק משטח הצלחת. הערה: הדמיה של תאים בשידור חי מחייבת הדבקה של תאים כך שיישארו משויכים למישור ההדמיה במהלך רכישת תמונה. משך הזמן הדרוש עבור תאים לדבוק בציפוי הבאה יכול להיות שונה מקו תא אחד למשנהו וצריך להיות ממוטב עבור קו התא תחת לימוד.</li>
	<li>עד 30 דקות לפני התחלת הדמיה זמן לפקיעה, להוסיף ריכוז רלוונטי של תרופה mitotic לאחת או יותר של הבארות הנזרע עם תאים. כדי להסביר את ההשפעה הפוטנציאלית של הממס האורגני על התנהגות תאית, להוסיף נפח שווה של דילול של מעכב את התאים כפקדים. לדוגמה, ודא כי התוספת של 100 ננומטר של המעכב הספציפי של mitotic קינאז אורורה A (למשל, דליארטיב) הוא וקרב עם נפח שווה של DMSO, הדילול עבור הסם הזה, בשליטה היטב של תאים. הערה: ניתוח השוואתי של שינויים דינאמיים בהתקדמות mitotic דורשים בארות של תאים להיות מוכנים בהעדר רטבאליות כדי לאפשר הדמיה של מיטוסים נורמליים במקביל לתנאים ניסיוניים.</li>
</ol>3. מיקרוסקופ להגדיר לפקיעה זמן הדמיה של RFP-H2B, α-טובולין-GFP לבטא תאים (איור 1, איור 2)
<ol><li>מקום צלחת תרבות התא המכיל rfp-H2B, α-טובולין-gfp המבטא htert rfp-1 תאים להיות מצולם לתוך שלב מתאים להוסיף על מיקרוסקופ אפידלנטית הפוכה המצויד עם מצלמה ברזולוציה גבוהה (גודל פיקסל של 0.67 יקרומטר ב 20x), מ חדר הסביבה מחומם עד 37 ° c, ומערכת משלוח עבור מחולל לחות 5% CO2. הערה: תאי הסביבה הסגורים או מוסיף טמפרטורה מבוקרת הבמה עשוי להיות מתאים סיפק מחולל שיתוף 5% CO2 ניתן להעביר ויציבה בקרת טמפרטורה שהתקבלו.</li>
	<li>השתמש במטרה האוויר 20x עם מפתח מספרי של 0.5 ומצויד בחדות גבוהה לעומת קרינה וניגודיות פאזה או הדמיה ברייטפילד. הצגת תאים עם הניגודיות פאזה או ברייטפילד וכוונן את הקורס ואת המיקוד העדין על המיקרוסקופ כדי להביא תאים לפוקוס.</li>
	<li>לזהות ולהגדיר את זמני החשיפה האופטימלי עבור ברייטפילד, GFP, ו RFP רכישת תמונה על ידי בחירת קוביית מסנן בהתאמה עם עירור המתאים ופליטה עבור fluorophores כי יהיה לדימות. לחילופין, לחץ על לחצן החשיפה האוטומטית כדי להזין זמן חשיפה שנקבע מראש. אם האות אינו אינטנסיבי במידה מספקת, בחר באפשרות פיקסלים לאפשר זמני חשיפה קצרים יותר על-ידי לחיצה על הכרטיסייה binning ובחירה באפשרות 2 x 2 פיקסלים מהתפריט הנפתח. הערה: הפוטורעילות יכול לפגוע mitotic התקדמות והכדאיות של התא. כישלון של תאים mitotic באוכלוסיות בקרה כדי להשלים mitoses נורמלי עשוי להיות אינדיקציה כי פעמים חשיפה ו/או משך הדמיה צריך להיות אופטימיזציה נוספת.</li>
	<li>השתמש בתוכנת רכישה וניתוח המאפשרת ריבוי קואורדינטות, הדמיה מרובת-היטב לרכישה בו ולהגדרת הפרמטרים עבור רכישת התמונה.<ol>
<li>בחרו וכיילו את שלב המיקרוסקופ לצלחת הרב, בהתאם להוראות היצרן. השתמש בתוכנה לרכישת תמונות כדי להדגיש או לבחור בצורה אחרת את הבארות כי יהיה לצלם על ידי לחיצה על הבארות הרלוונטיות בדיאגרמה של תבנית הלוח הנמצא בשימוש.</li>
		<li>בלוח הבקרה של נקודות הסימון (איור 2), הגדר את נקודות הציון בתוך כל באר שיוצבע על-ידי לחיצה על הכרטיסיה מיקום נקודה ובחירת מיקום קואורדינטות מוגדר מראש או אקראי מ תפריט הנפתח. בחר בכרטיסיה אזור עבודה ובחר באפשרות מוגבלת מהתפריט הנפתח כדי להגביל את אזור בחירת הקואורדינטות כדי לשלול את גבולות הבאר. לחץ על לשוניות הספירה וההפצה כדי לבחור את המספר וההתפלגות של נקודות שיילכדו בו, בהתאמה. הערה: מספר נקודות הציון שניתן להגבאם בתוך התוספת 5 דקות של נקודת הזמן הקבועה מוגבלת על-ידי מספר הבארות לדימות, כמו גם את זמן החשיפה עבור כל ערוץ. בדרך כלל, 5-8 קואורדינטות לכל טוב הם מספיק כדי להתבונן לפחות 50 תאים בכל התקדמות תנאי דרך מיטוזה בתוך 4 h.</li>
		<li>בחר והקלט את מרווח הזמן והמשך לאיסוף תמונות על-ידי לחיצה על והזנת הערכים בלוח הבקרה של Timesequence . הערה: רכישת תמונות כל 1 עד 5 דקות מתאימה לנטר את הדינמיקה של התקדמות mitotic. משך הדימות הכולל אמור לשקף את נקודת הקצה הרצויה ואת קצב ההפצה של קו התא. לדוגמה, 4 שעות מספיק כדי לראות תאים רבים התקדמות דרך mitosis, 16 שעות מספיק כדי לראות את רוב RPE-1 תאים בהתקדמות האוכלוסייה אסינכרוני דרך mitosis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. זמן התמונה ניתוח לטעות כדי לקבוע את העיתוי מטאמפאזה ואת הגורל mitotic cell בעקבות mitotic ציר רטבאליות
הערה: בצע את ניתוח התמונה באמצעות תוכנת רכישת תמונה (טבלת חומרים), imagej, או תוכנת ניתוח תמונה דומה.
<ol><li>המחש RFP-H2B שכותרתו כרומטין על ידי בחירת תמונות שנתפסו עם קוביית מסנן RFP במקום. זיהוי תא הזנת מיטוזיס כפי שמצוין על-ידי דחיסת כרומטין ראשונית (איור 2C, ראש חץ כחול) ומעטפה גרעינית להישבר (כאשר α-טובולין-egfp אינו נכלל עוד על ידי הגבול הגרעיני).</li>
	<li>לקבוע את העיתוי mitotic של יישור מטא-פאזה והתפתחות בתאים בודדים: מעקב אחר התא באמצעות נקודות זמן רצופות בסרט הנרכש כדי לקבוע את מספר נקודות הזמן/דקות מהזנת mitotic עד RFP-H2B-כרומטין מתויג משלים את היישור בתא המשווה במהלך מטא-פאזה (איור 2ג, ראש חץ צהוב).</li>
	<li>כדי לפקח על mitotic עיתוי, mitotic אמינות וגורל התאים, המשך לעקוב אחר התא באמצעות נקודות זמן רצופות כדי לזהות את קואורדינטת הזמן שבה הפרדה בין כרומוזום אנבית ברורה (איור 2ג, ראש חץ לבן) ו/או שם התרחש הרפורמציה של כרומטין ומעטפת גרעינית (כפי שמצוין על ידי טובולין הדרה מהגרעין). הערה: רטבאליות בעצרת ציר או התקדמות mitotic יכול להיות מוערך כפונקציה של הזמן הנדרש כדי להשיג ציר mitotic דו-קוטבית ולהשיג יישור כרומוזום מלא, או כדי להשלים את ההפרדה של כרומוזום אנאפיום.</li>
	<li>המחש RFP-H2B לזהות תאים בכל אוכלוסייה המוצגים פגמים mitotic כולל כרומוזומים בפיגור וגשרים כרומטין במהלך הפרדה של כרומוזום אנאפא. הערה: mitotic בסכנה עלולה גם לגרום לתאים בעלי מיקרו או בתאי מיקרורוקליום וניתן לדמיין בתאים שלאחר mitotic יציאה, כמו באיור 3.</li>
</ol>

<ol><li>Szuts, D., Krude, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+at+the+initiation+step+of+human+chromosomal+DNA+replication+causes+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).</li>
<li>Gayek, A. S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK-1+Inhibition+in+G2+Stabilizes+Kinetochore-Microtubules+in+the+following+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis.</a> PLoS One. 11, e0157491(2016).</li>
<li>Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+nuclear+pore+assembly+lead+to+activation+of+an+Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint.</a> The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).</li>
<li>Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merotelic+kinetochore+orientation+versus+chromosome+mono-orientation+in+the+origin+of+lagging+chromosomes+in+human+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).</li>
<li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?</a> Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).</li>
<li>van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimitotic+drugs+in+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Antimitotic drugs in the treatment of cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).</li>
<li>Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-targeted+anti-cancer+therapies%3A+where+they+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand.</a> Cell Death and Diseases. 3, 411(2012).</li>
<li>Martin, M., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+into+Focus%3A+Mechanisms+of+Microtubule+Minus-End+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization.</a> Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).</li>
<li>Maiato, H., Logarinho, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+multipolarity+without+centrosome+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification.</a> Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).</li>
<li>Vitre, B. D., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomes%2C+chromosome+instability+%28CIN%29+and+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).</li>
<li>Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+centrosome+abnormalities+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).</li>
<li>Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+A+inhibition+limits+centrosome+clustering+and+promotes+mitotic+catastrophe+in+cells+with+supernumerary+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes.</a> Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).</li>
<li>Conte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TACC1-chTOG-Aurora+A+protein+complex+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer.</a> Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).</li>
<li>Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+conserved+centrosomal+kinase%2C+AIR-1%2C+is+required+for+accurate+cell+cycle+progression+and+segregation+of+developmental+factors+in+Caenorhabditis+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos.</a> Development. 125, 4391-4402 (1998).</li>
<li>Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora-A+inactivation+causes+mitotic+spindle+pole+fragmentation+by+unbalancing+microtubule-generated+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces.</a> Molecular Cancer. 10, 131(2011).</li>
<li>Chan, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+overview+of+centrosome+amplification+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A clinical overview of centrosome amplification in human cancers.</a> International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).</li>
<li>Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+clustering+and+chromosomal+%28in%29stability%3A+a+matter+of+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death.</a> Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).</li>
<li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li>
<li>Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+spindle+pole+coalescence+is+a+major+source+of+kinetochore+mis-attachment+and+chromosome+mis-segregation+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells.</a> PLoS One. 4, e6564(2009).</li>
<li>Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+aberrations%3A+cause+or+consequence+of+cancer+progression%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%2C+Cancer%22%5BJournal%5D)">Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?</a> Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).</li>
<li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomes+and+cancer%3A+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).</li>
<li>Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+multipolarity+is+prevented+by+centrosomal+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering.</a> Science. 307, 127-129 (2005).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הרזולוציה הטמפורלית המסופקת על ידי הדמיה בזמן מאפשר להדמיה והערכה של אירועים סלולריים רציפים בתוך תאים בודדים. גישות העושות שימוש בסנכרון הסלולר ולאחריה האיסוף והקיבעון של תאים בנקודות זמן רציפות מוגבלות בהשוואות שבוצעו בסופו של דבר בין אוכלוסיות של תאים. בהקשרים שבהם התגובה התאית רטבאליות עשוי להיות לא אחיד, או כאשר התהליך להיות מדמיין הוא דינמי, לחיות הדמיה של זמן התמונה הוא מצויד טוב יותר לעקוב ולנתח הן את הדינמיקה של תאים בודדים, כמו גם את הטרוגניות בתוך אוכלוסיה תאית. בדרך זו, הדמיה זמן לפקיעה שימושי במיוחד בניטור ה...

ניתוח מבוסס תמונה של תאים קבועים משמש בדרך כלל להערכת השינויים ברמת האוכלוסייה התאית בתגובה לרטבאליות שונות. בשילוב עם סנכרון תאים, ואחריו אוסף והדמיה של נקודות זמן טוריות, ניתן להשתמש בגישות כאלה כדי להציע רצף אירועים תאי. עם זאת, הדמיה סלולרית קבועה מוגבלת ביחסים הזמני משתמעת לאוכלוסיה ולא הפגינו ברמה של תאים בודדים. בדרך זו, בעוד הדמיה תא קבוע ניתוח מספיק כדי לבחון פנוטיפים חזקים ושינויים במצב יציב, היכולת לזהות שינויים זמניים לאורך זמן ושינויים המשפיעים רק על אוכלוסיית התאים הוא לא מושלם. לעומת זאת, הדמיה של תאים חיים היא כלי רהוט שניתן להשתמש בו כדי להתבונן בתהליכים סלולריים ומשניים בתוך תא אחד, או באוכלוסיית הסלולר, לאורך זמן וללא סיוע של גישות סנכרון העלולות להשפיע על עצמם על התנהגות תאית מיכל בן , מיכל השני , מיכל שלוש , ד , מיכל 5 , . שישה מטרים
היווצרות של ציר דו קוטבית mitotic הוא חיוני עבור ההפרדה כרומוזום הנכון במהלך חלוקת התא, וכתוצאה מכך שתי תאים מבחינה גנטית ביתי. פגמים במבנה mitotic ציר כי מושחתים mitotic התקדמות ולהתפשר על נאמנות של הפרדה כרומוזום יכול לגרום לדיוויזיות תאים קטסטרופלי ויכולת הכדאיות של תאים מופחתת. מסיבה זו, mitotic רעלים שמשנים את היווצרות הצירים מבטיחים therapeutics להגביל את ההתפשטות המהירה של תאים סרטניים7,8,9. עם זאת, ניתוח תאים קבוע של מבנה הצירים בעקבות הוספת רעלים mitotic מוגבל ביכולתה להעריך את התהליך הדינמי של היווצרות צירים ואינו יכול לציין אם שינויים שנצפו במבנה הצירים הם קבועים או מ במקום ארעי וניתן להתגבר על מנת לאפשר חלוקת תאים מוצלחת.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים גישה כדי להעריך את הדינמיקה של מיטוזיס רטבאליות בעקבות הדמיה של תאים חיים. שימוש בשורה hTERT מונצח-1 קו התא ההונדסים לבטא RPE-מתויג Histone 2B כדי להמחיש כרומטין, יחד עם EGFP-מתויג α-טובולין כדי להמחיש microtubules, את העיתוי של יישור כרומוזום מטאפיאט, אנאפיום התחלתה, ובסופו של דבר mitotic הגורל התאים מוערך באמצעות רמזים חזותיים של תנועת כרומוזום, compaction, מורפולוגיה גרעינית.

<table><tbody><tr><td>0.05% טריפסין</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>25-510</td><td>סרין פרוטאז המשמש לשחרור תאים דבקים מכלי תרבית</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>אולימפוס פלסטיק</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>20x CFI תוכנית פלואור אובייקטיבי&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>לשימוש בהדמיית תאים חיים כדי להמחיש הן שדה בהיר והן פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>293T Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>לשימוש בטרנספקציה רטרו-ויראלית; משמש בשלב 1.1</td></tr><tr><td>a-tubulin-EGFP&nbsp;</td><td>הוסף</td><td>מספרים שונים</td><td>וקטור ביטוי עבור אלפא טובולין התמזג לתג חלבון פלואורסצנטי ירוק; לשימוש בהדמיה של טובולין בהדמיית תאים חיים: זמין מסחרית באמצעות addgene וספקים אחרים</td></tr><tr><td>Alisertib</td><td>Selleckchem</td><td>S1133</td><td>מעכב מולקולות קטנות של הקינאז המיטוטי Aurora A. ריכוז המלאי מוכן ב-10 מ"מ ב-DMSO, ומשמש בריכוז סופי של 100 ננומטר.</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>A11139-03</td><td>חומר לבחירת אנטיביוטיקה; משמש לבחירת תאים המבטאים a-tub-EGFP</td></tr><tr><td>C02</td><td>Airgas</td><td></td><td>לשימוש בתרבית תאים והדמיית תאים חיים</td></tr><tr><td>Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td>סט מסנני פס יחיד; אורך גל עירור 545 ננומטר עם רוחב פס ופליטה של 25 ננומטר באורך גל של 605 ננומטר עם רוחב פס של 70 ננומטר; להדמיה של H2B-RFP</td></tr><tr><td>Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td>סט מסנני פס יחיד; אורך גל עירור 470 ננומטר עם רוחב פס של 40 ננומטר ופליטה באורך גל של 525 ננומטר עם רוחב פס של 50 ננומטר; להדמיה של</td></tr><tr><td>צנרת פסטור חד פעמית GFP-tubulin, מעוקרת&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-6A</td><td>לשימוש בתאים שואבים&nbsp;</td></tr><tr><td>דולבקו s מדיום נשר שונה (DMEM)</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>11965-084</td><td>מדיום תרבית תאים לגידול תאי RPE-1 ו-293T</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>10438-026</td><td>תוסף מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 3000 ו-p3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000-015</td><td>מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים לטרנספקציה של פלסמידים; משמש ב-1.1.4</td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות מרובי בארות</td><td>קורנינג</td><td>שונים</td><td>לשימוש בתרבית תאים, טרנספקציה/זיהום והדמיית תאים חיים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Nikon Ti-E</td><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך של Nikon לשימוש בהדמיית תאים חיים</td><td></td> NIS Elements HC&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>גרסה 4.51</td><td>תוכנה לאיסוף וניתוח תמונות; בשימוש בסעיפים 3 ו-4</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>31985-070</td><td>מדיום סרום מופחת לטרנספקציה של תאים; משמש בשלב 1.1.3</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>15140-122</td><td>אנטיביוטיקה המשמשת בתרבית תאים</td></tr><tr><td>תמיסת מלח בינונית פוספט (PBS)</td><td>Caisson labs</td><td>PBP06-10X1LT</td><td>תמיסת מלח סטרילית לשימוש עם תרבית תאים</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Lentiviral VSV-G מבנה ביטוי מעטפת; משמש בשלב 1.1.4</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>פולימר קטיוני המשמש לשיפור יעילות הזיהום הנגיפי; משמש בשלב 1.1.10</td></tr><tr><td>psPAX</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>פלסמיד אריזות לנטי-ויראליות מהדור השני; משמש בשלב 1.1.4</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pr-1</td><td>חומר בחירת אנטיביוטיקה; משמש לבחירת תאים המבטאים RFP-H2B</td></tr><tr><td>RFP-היסטון 2B (H2B)</td> <td>הוסף</td><td>מספרים</td> <td>שוניםוקטור ביטוי עבור היסטון 2B מתויג חלבון פלואורסצנטי אדום; לשימוש בהדמיה של כרומטין בהדמיית תאים חיים: זמין מסחרית דרך Addgene וספקים אחרים</td></tr><tr><td>RNAi Max</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים לטרנספקציה של מבני siRNA תאי</td></tr><tr><td>RPE-1 ATCC</td><td></td><td>CRL-4000</td><td>קו תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושי</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 100x20 מ"מ</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>353003</td><td>לשימוש בתרבית תאים דבקים</td></tr><tr><td>מצלמת Zyla sCMOS&nbsp;</td>מצלמת <td>ניקון</td><td></td><td>מחוברת למיקרוסקופ, המשמשת לצילום תמונות של תאים</td></tr></tbody></table>

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות mitotic צירים רטבאליות

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

לחיות הדמיה בזמן התמונה התמונה הוא כלי חשוב בביולוגיה התא המספק תובנה תהליכים סלולריים שעלולים להתעלם אחרת, לא מובנת, או שלא כהלכה על ידי ניתוח תא קבוע. בעוד הדמיה תא קבוע ניתוח הוא חזק ומספיק כדי להתבונן הסלולר המצב הנייד, זה יכול להיות מוגבל בהגדרת סדר הזמן של אירועים ברמה התאית והוא חולה להעריך את האופי הארעי של תהליכים דינמיים כולל התקדמות mitotic. לעומת זאת, הדמיה של תא חי היא כלי רהוט שניתן להשתמש בו כדי להתבונן בתהליכים סלולריים ברמה של תא בודד לאורך זמן ויש לו את היכולת ללכוד את הדינמיקה של תהליכים שאחרת היו מיוצגים בצורה גרועה בהדמיית תא קבוע. כאן אנו מתארים גישה כדי ליצור תאים הנושאים מסמנים התווית של כרומטין ו microtubules ואת השימוש שלהם בגישות הדמיה של תא חי כדי לפקח על יישור כרומוזום מטאפיפאסיים ויציאה mitotic. אנו מתארים טכניקות מבוססות הדמיה כדי להעריך את הדינמיקה של היווצרות ציר והתקדמות mitotic, כולל זיהוי של תאים בשלבים שונים מיטוזיס, זיהוי ומעקב של פגמים mitotic, ניתוח הדינמיקה ציר ו mitotic הגורל התא בעקבות הטיפול עם מעכבי mitotic.

הערכת ההתקדמות הmitotic בנוכחות ציר רטבאליות הוויסות של קוטב הציר התמקדות הוא צעד חיוני במערך הציר הדו המתאים. הפרעה בתהליך זה באמצעות מרוקן חלבונים, עיכוב התרופה, או שינויים ב-centrosome מבנה הציר מושחתים ועיכוב או לעצור mitoticהתקדמות 10,11,12,13. עם זאת, כמה רטבאליות רק עיכוב היווצרות הצירים עם תאים בסופו של דבר ממשיך מיטוזיס כדי להשלים את...

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדינמיקה של היווצרות צירים והתקדמות mitotic. היישום שלנו של הדמיה זמן לפקיעה מאפשר למשתמש לזהות תאים בשלבים שונים של mitosis, לעקוב ולזהות פגמים mitotic, ולנתח את הדינמיקה הציר ואת הגורל mitotic cell בעת חשיפה לתרופות נגד mitotic.

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

הדמיית תאים חיים מאפשרת התבוננות בתהליכים תאיים דינמיים לאורך זמן בתוך תא אחד. גישות אלה הן רבות עוצמה להערכת התנאים המשפיעים על התהליך הדינמי של חלוקת התאים וחשיפת ההשפעות שיש לפגמים במיטוזיס על התפשטות תאי הבת ועל הכדאיות. פוטוטוקסיות הנבעת מחשיפה לאור במהלך ההדמיה מהווה אתגר משמעותי הקשור לפרוטוקול זה.לכן, יש למטב את זמני החשיפה ואת מרווח ההדמיה ומשך הזמן. באמצעות טכניקה אספטית וארון בטיחות ברמה 2, השתמש בזכוכית חד פעמית סטרילית פיפט פסטר כדי לשאוף את המדיום מצלחת התרבות המכילה את קו התא נושא את הביטוי של עניין. בקצרה לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של PBS סטרילי עם מערבולת ולטפל בתאים עם שני מיליליטר של 0.05% טריפסין.לאחר שתיים עד חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף שמונה מיליליטר של מדיום טרי לצלחת כדי לעצור את התגובה ולתלות מחדש את התאים המנותקים עם צינורות עדינים. להעביר את פתרון התא לצינור סטרילי 15 מיליליטר ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. תן שוב את גלולה ב 10 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגה התאים שוב.תן את גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום לספירה ולדלל את התאים לאחד עד פעמיים 10 לתאים 5 למיליליטר של ריכוז בינוני של תאים. לאחר מכן זרע 500 microliters של תאים לתוך כל באר של צלחת סטרילית 12-well הדמיה התחתונה למקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא כדי לאפשר לתאים לדבוק על פני השטח של הלוח. לא יותר מ 30 דקות לפני הדמיה, להוסיף ריכוז רלוונטי של תרופה mitotic לאחת או יותר של בארות ולהוסיף נפח שווה של המעכב diluent לאותו מספר של בארות כמו הפקדים.כדי להכין את המיקרוסקופ להדמיה, הנח את הלוחית על הבמה של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך המצויד במצלמה ברזולוציה גבוהה, תא סביבתי שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס ומערכת משלוחים ל-5%פחמן דו-חמצני לח. בחר יעד אוויר 20 פעמים עם צמצם מספרי של 0.5 ומצויד עבור פלואורסצנטיות חדות גבוהה וניגודיות פאזה, או הדמיית שדה בהיר ולהציג את התאים כדי להתאים את הקורס ולמצוא מיקוד כדי להביא תאים לפוקוס. כדי לקבוע את זמני החשיפה האופטימליים עבור רכישת תמונות שדה בהיר, GFP ו- RFP, בחר את קוביות הסינון המתאימות עם העירור וההפחתה המתאימים עבור הפלואורופורים שידמיין ולחץ על הפעל.אם האות אינו אינטנסיבי מספיק, התאימו את החשיפה האוטומטית ובכל ערוץ פלואורופור בחרו את התאורה המתאימה מהתפריט הנפתח Format. בחר וכייל את שלב המיקרוסקופ לצלחת מרובת הבארים בהתאם להוראות היצרן ולהשתמש בתוכנת רכישת התמונה כדי להדגיש או לבחור בדרך אחרת את הבארים שידמיין. פתח את לוח הבקרה של הנקודות שנוצרו ותחת אזור עבודה בחר מוגבל וגבול כדי להגביל את אזור בחירת הקואורדינטות כדי לא לכלול את גבולות הגם.בתפריט הנפתח 'הגבלת אזור', בחרו 'אזור שלם' ובחרו מיקום נקודה אקראי. הגדר את הספירה לשש ולחץ על אקראיות כדי לבחור את המספר וההתפלגות של הנקודות שיש ללכוד ל הבאר, בהתאמה. לאחר מכן לחץ על והזן את הערכים בלוח הבקרה של רצף הזמן כדי לבחור ולהזין את מרווח הזמן ואת משך הזמן לאיסוף התמונות.כדי להמחיש את הכרומטין המסומנת בתווית RFP-H2B, בחר את התמונות שנלכדו עם קוביית מסנן RFP במקום וזהה תא שנכנס למיטוזיס כפי שצוין על ידי דחיסת הכרומטין הראשונית ופירוק המעטפה הגרעינית כדי לקבוע את התזמון המיטוטי של יישור המטה-פאסה והתפרצות האנפסה בתאים בודדים. עקוב אחר התא המעניין באמצעות נקודות זמן עוקבות בסרט הנרכש כדי לקבוע את מספר נקודות הזמן או הדקות מהערך המיטוטי עד כרומטין המסומן RFP-H2B משלים את היישור בקו המשווה של התא במהלך metaphase. כדי לפקח על התזמון המיטוטי, הנאמנות המיטוטית וגורל התא, המשיכו לעקוב אחר התא דרך נקודות זמן רצופות כדי לזהות את קואורדינטת הזמן שבה ניכרת הפרדה כרומוזום אנפה ו/או כאשר התרחשה ריקבון כרומטין ורפורמציה במעטפות גרעיניות.לאחר מכן דמיינו RFP-H2B כדי לזהות תאים בכל אוכלוסייה המציגים פגמים מיטוטיים, כולל כרומוזומים מפגרים וגשרי כרומטין במהלך הפרדת כרומוזום אנפאזה. על ידי הדמיה אלפא tubulin-EGFP, ניתן לראות כי תאים חווים שיבוש ציר לעבור שינויים דינמיים כמו התמקדות למשוך ציר מושגת ציר מיתוטי דו קוטבי נוצר כהכנה חלוקת התא. במקביל להרכבת ציר, ניתן לדמיין תנועת כרומוזום עם RFP-H2B כדי להעריך את יישור הכרומוזום ואת נאמנות ההפרדה.באמצעות גישות הדמיה של תאים חיים, תוצאות מייצגות אלה מראות כי תאים עם תוכן centrosome נורמלי מסוגלים להמשיך פירוק מעטפה גרעינית באמצעות יישור metaphase והתפרצות anaphase כדי להשיג חלוקה דו קוטבית בתוך פחות מ -30 דקות. בנוכחות centrosomes נוספים, כמעט 50% מהתאים מסוגלים להתגבר על ציר מיתוטי רב קוטבי חולף וצור ציר דו קוטבי בחלוקת תאים מלאה. התאים הנותרים אינם מסוגלים להשיג ציר דו קוטבי וכתוצאה מכך, לצאת מיטוזה באמצעות חלוקה רב קוטבית.לא משנה אם דו קוטביות ציר מושגת, תאים עם centrosomes נוסף להפגין משך גדל באופן משמעותי של מיטוזה לעומת תאים עם שני centrosomes. המציין כי הדינמיקה של התקדמות מיתוטית עשויה להשתנות גם כאשר שינויים בתוצאה המיטוטית אינם ניכרים. בעת הגדרת זמני חשיפה לערוצים פלואורסצנטיים, מטב את זמני החשיפה להגבלת פוטוטוקסיות.ניתן גם לבחור בסל פיקסלים של מצלמה כדי לאפשר שימוש בזמני חשיפה נמוכים יותר. הליך זה כולל יישומים בהקרנות פרמקולוגיות, פלישה וניתוח הגירה. גישות אלה יכולות לשמש גם כדי לבחון את היעילות של טיפולים תרופתיים או את הדינמיקה של תנועתיות הסלולר.

live-cell-imaging-to-assess-dynamics-metaphase-timing-cell-fate

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לתמונה ולכמת את העיתוי mitotic של חיים יונקים התרבות תאים ורקמות לאחר transfection siRNA.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה...

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

Metaphase לanaphase מעבר מופעל באמצעות anaphase-קידום מורכב (APC / C)-התלוי ubiquitination וההרס הבא של cyclin B. הנה, הקים מערכת ש, בעקבות דופק מרדף תיוג, מאפשר ניטור proteolysis B cyclin באוכלוסיות תאים שלמות ו מאפשר זיהוי של הפרעה על ידי המחסום המיטוטי.

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

אנו מציגים פרוטוקול לסינכרון תימידין כפול של תאים הלה ואחריו ניתוח באמצעות קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו היא המפתח להשגת מספר גדול של תאים, כי המשך באופן סינכרוני שלב S מיטוזה, המאפשר לימודים mitotic התפקידים של חלבונים רב תכליתי אשר גם בעלי פונקציות לאטמוספרה.

שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

הדמיה לחיות תאים מספק שפע של מידע על תאים בודדים או באוכלוסיות שלמות כי הוא בלתי ניתן להשגה על-ידי תא קבוע הדמיה לבד. כאן, מתוארים פרוטוקולי הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic.

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה ונוחה כדי לתייג והמחש בשידור חי הכרומוזומים בתאים mitotic באמצעות תווית 2.0 BacMam Histone2B-GFP ומערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסק מסתובב.

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

חטיבות התא ניתן לדמיין בזמן אמת באמצעות חלבונים מתויגים פלואורוסקופים ומיקרוסקופ זמן לשגות. בעזרת הפרוטוקול המוצג כאן, המשתמשים יכולים לנתח את דינמיקת התזמון של החטיבה הסלולרית, הרכבת הmitotic צירים והפרדה בין כרומוזום ובידוד. פגמים באירועים אלה בעקבות הפרעות RNA (RNAi)-תיווך גנים הסתרה ניתן להעריך ולכמת.

שימוש ב- Drosophila ילה S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא

כאן אנו מציגים שיטה איתנה ומפורטת של ניתוח מיקרוטוכדורית בתאים מסונכרנים בprometaphase באמצעות מיקרוסקופ הדיסק המסתובב של תא חי מיקרוסקופיה ועיבוד תמונה מבוסס MATLAB.

מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר Mitotic צירים

חקור דינמיקת מיטוזה וצורת המטאפזה באמצעות הדמיית תאים חיים. השיטה מאפשרת הערכת פגמים מיטוטיים וניתוח השפעת תרופות אנטי-מיטוטיות על חלוקת תאים בזמן אמת.

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

גלה סרטונים נוספים