הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

הדמיית תאים חיים מאפשרת התבוננות בתהליכים תאיים דינמיים לאורך זמן בתוך תא אחד. גישות אלה הן רבות עוצמה להערכת התנאים המשפיעים על התהליך הדינמי של חלוקת התאים וחשיפת ההשפעות שיש לפגמים במיטוזיס על התפשטות תאי הבת ועל הכדאיות. פוטוטוקסיות הנבעת מחשיפה לאור במהלך ההדמיה מהווה אתגר משמעותי הקשור לפרוטוקול זה.

לכן, יש למטב את זמני החשיפה ואת מרווח ההדמיה ומשך הזמן. באמצעות טכניקה אספטית וארון בטיחות ברמה 2, השתמש בזכוכית חד פעמית סטרילית פיפט פסטר כדי לשאוף את המדיום מצלחת התרבות המכילה את קו התא נושא את הביטוי של עניין. בקצרה לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של PBS סטרילי עם מערבולת ולטפל בתאים עם שני מיליליטר של 0.05% טריפסין.

לאחר שתיים עד חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף שמונה מיליליטר של מדיום טרי לצלחת כדי לעצור את התגובה ולתלות מחדש את התאים המנותקים עם צינורות עדינים. להעביר את פתרון התא לצינור סטרילי 15 מיליליטר ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. תן שוב את גלולה ב 10 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגה התאים שוב.

תן את גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום לספירה ולדלל את התאים לאחד עד פעמיים 10 לתאים 5 למיליליטר של ריכוז בינוני של תאים. לאחר מכן זרע 500 microliters של תאים לתוך כל באר של צלחת סטרילית 12-well הדמיה התחתונה למקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא כדי לאפשר לתאים לדבוק על פני השטח של הלוח. לא יותר מ 30 דקות לפני הדמיה, להוסיף ריכוז רלוונטי של תרופה mitotic לאחת או יותר של בארות ולהוסיף נפח שווה של המעכב diluent לאותו מספר של בארות כמו הפקדים.

כדי להכין את המיקרוסקופ להדמיה, הנח את הלוחית על הבמה של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך המצויד במצלמה ברזולוציה גבוהה, תא סביבתי שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס ומערכת משלוחים ל-5%פחמן דו-חמצני לח. בחר יעד אוויר 20 פעמים עם צמצם מספרי של 0.5 ומצויד עבור פלואורסצנטיות חדות גבוהה וניגודיות פאזה, או הדמיית שדה בהיר ולהציג את התאים כדי להתאים את הקורס ולמצוא מיקוד כדי להביא תאים לפוקוס. כדי לקבוע את זמני החשיפה האופטימליים עבור רכישת תמונות שדה בהיר, GFP ו- RFP, בחר את קוביות הסינון המתאימות עם העירור וההפחתה המתאימים עבור הפלואורופורים שידמיין ולחץ על הפעל.

אם האות אינו אינטנסיבי מספיק, התאימו את החשיפה האוטומטית ובכל ערוץ פלואורופור בחרו את התאורה המתאימה מהתפריט הנפתח Format. בחר וכייל את שלב המיקרוסקופ לצלחת מרובת הבארים בהתאם להוראות היצרן ולהשתמש בתוכנת רכישת התמונה כדי להדגיש או לבחור בדרך אחרת את הבארים שידמיין. פתח את לוח הבקרה של הנקודות שנוצרו ותחת אזור עבודה בחר מוגבל וגבול כדי להגביל את אזור בחירת הקואורדינטות כדי לא לכלול את גבולות הגם.

בתפריט הנפתח 'הגבלת אזור', בחרו 'אזור שלם' ובחרו מיקום נקודה אקראי. הגדר את הספירה לשש ולחץ על אקראיות כדי לבחור את המספר וההתפלגות של הנקודות שיש ללכוד ל הבאר, בהתאמה. לאחר מכן לחץ על והזן את הערכים בלוח הבקרה של רצף הזמן כדי לבחור ולהזין את מרווח הזמן ואת משך הזמן לאיסוף התמונות.

כדי להמחיש את הכרומטין המסומנת בתווית RFP-H2B, בחר את התמונות שנלכדו עם קוביית מסנן RFP במקום וזהה תא שנכנס למיטוזיס כפי שצוין על ידי דחיסת הכרומטין הראשונית ופירוק המעטפה הגרעינית כדי לקבוע את התזמון המיטוטי של יישור המטה-פאסה והתפרצות האנפסה בתאים בודדים. עקוב אחר התא המעניין באמצעות נקודות זמן עוקבות בסרט הנרכש כדי לקבוע את מספר נקודות הזמן או הדקות מהערך המיטוטי עד כרומטין המסומן RFP-H2B משלים את היישור בקו המשווה של התא במהלך metaphase. כדי לפקח על התזמון המיטוטי, הנאמנות המיטוטית וגורל התא, המשיכו לעקוב אחר התא דרך נקודות זמן רצופות כדי לזהות את קואורדינטת הזמן שבה ניכרת הפרדה כרומוזום אנפה ו/או כאשר התרחשה ריקבון כרומטין ורפורמציה במעטפות גרעיניות.

לאחר מכן דמיינו RFP-H2B כדי לזהות תאים בכל אוכלוסייה המציגים פגמים מיטוטיים, כולל כרומוזומים מפגרים וגשרי כרומטין במהלך הפרדת כרומוזום אנפאזה. על ידי הדמיה אלפא tubulin-EGFP, ניתן לראות כי תאים חווים שיבוש ציר לעבור שינויים דינמיים כמו התמקדות למשוך ציר מושגת ציר מיתוטי דו קוטבי נוצר כהכנה חלוקת התא. במקביל להרכבת ציר, ניתן לדמיין תנועת כרומוזום עם RFP-H2B כדי להעריך את יישור הכרומוזום ואת נאמנות ההפרדה.

באמצעות גישות הדמיה של תאים חיים, תוצאות מייצגות אלה מראות כי תאים עם תוכן centrosome נורמלי מסוגלים להמשיך פירוק מעטפה גרעינית באמצעות יישור metaphase והתפרצות anaphase כדי להשיג חלוקה דו קוטבית בתוך פחות מ -30 דקות. בנוכחות centrosomes נוספים, כמעט 50% מהתאים מסוגלים להתגבר על ציר מיתוטי רב קוטבי חולף וצור ציר דו קוטבי בחלוקת תאים מלאה. התאים הנותרים אינם מסוגלים להשיג ציר דו קוטבי וכתוצאה מכך, לצאת מיטוזה באמצעות חלוקה רב קוטבית.

לא משנה אם דו קוטביות ציר מושגת, תאים עם centrosomes נוסף להפגין משך גדל באופן משמעותי של מיטוזה לעומת תאים עם שני centrosomes. המציין כי הדינמיקה של התקדמות מיתוטית עשויה להשתנות גם כאשר שינויים בתוצאה המיטוטית אינם ניכרים. בעת הגדרת זמני חשיפה לערוצים פלואורסצנטיים, מטב את זמני החשיפה להגבלת פוטוטוקסיות.

ניתן גם לבחור בסל פיקסלים של מצלמה כדי לאפשר שימוש בזמני חשיפה נמוכים יותר. הליך זה כולל יישומים בהקרנות פרמקולוגיות, פלישה וניתוח הגירה. גישות אלה יכולות לשמש גם כדי לבחון את היעילות של טיפולים תרופתיים או את הדינמיקה של תנועתיות הסלולר.