Name: לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: למדו לבצע ניתוח אנוציטים וצביעת טיפות שומן בזחלי דרוזופילה באמצעות צבע BODIPY 493/503. שיטה זו מאפשרת לחקור מטבוליזם שומנים בתנאי רעב ולחקור מחלות מטבוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מן הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (31671422, 31529004, ו 31601112), הפרויקט 111 (D18010), פרויקט מקומי חדשני וצוותי מחקר של גואנג-דונג הנהר הכשרונות התוכנית (2017bt01s155), ואת ה הקרן המדע הפוסט-דוקטורט (2018M640767).

1. הנחת ביצים
<ol><li>הכינו את האוכל הרגיל לארוחות מקורנות להנחת ביצים. הערה: לקבלת מתכון והליך בישול עבור מזון רגיל הארוחה תירס בשימוש כאן, לראות את הפרטים שפורסמו בעבר15.</li>
	<li>הכנת שמרים טריים להדביק על ידי הוספת 6 מ ל של מים מזוקקים 4 גרם שמרים מיובשים פעילים ב 50 mL צנטריפוגלי צינור. השתמש במרית כדי לערבב ולבצע הדבקה.</li>
	<li>הפוך בקבוקי הנחת ביצים על ידי מילוי מזון הארוחה תירס לתוך הבקבוקים ולהתפשט כ 1 גרם שמרים להדביק על פני השטח של אוכל תירס עם מרית.</li>
	<li>מניחים את הזבובים של הגנוטיפים הרצויים בבקבוק הנחת ביצים ומניחים אותו בחממה עם טמפרטורה קבועה של 25 ° c ולחות של 60%. הערה: צלבים אידיאליים בדרך כלל מורכב של 150 בתולה זבובים לפחות 75 זכרים. שמירה על זבובים בחושך על ידי הצבת קופסת אור על הבקבוקים הטלת ביצה יגדיל את שיעור רבייה.</li>
	<li>לפני איסוף ביצים, לאפשר לזבובים להטיל ביצים 1 h כדי לאפשר הסרת כל הביצים הישנות שנשארות מאוחסנים ההטלה הנשי.</li>
	<li>תן לזבובים להטיל ביצים בבקבוק חדש להנחת ביצים עבור 1 h ולהסיר את המבוגרים מן הבקבוק. הערה: שלוט בזמן הנחת הביצה כדי למזער את הטווח ההתפתחותי על מנת להשיג זחלים בשלב התפתחותי בולט בדיוק.</li>
	<li>לאפשר את הביצים לפתח עבור 84 h לתוך הזחלים השלישי באינקובטור בחממה ב 25 ° c עם מחזור אור/12 h 12 h/כהות.</li>
</ol>2. הרעב טיפול הזחלים
הערה: כפי שהוזכר לעיל, ב הזחלים השלישי, יש מעט או לא ניתן לגילוי טיפות שומנים בoenocytes תחת תנאי האכלה נורמלית, אבל טיפות שומנים גדולים רבים יכול להיגרם oenocytes תחת תנאי לחץ, כגון רעב. כדי לוודא עוד שיטה זו, יש צורך לטפל הזחלים האלה כדי לגרום לשומנים droplet biogenesis ב oenocytes. כאן, קורס זמן הרעבה של 12 h, 24 שעות, ו 36 h נבחר כפרדיגמה. בפרט, תקופה קצרה של רעב (למשל, 3 שעות) הוא מספיק כדי לזרז טיפות השומנים לגילוי ב oenocytes. משך הרעב עשוי להשתנות בהתאם למטרות ולהגדרות נסיוניות ספציפיות.
<ol><li>הופכים את הלשכה. לרעב ולטיפול בשליטה<ol>
<li>לחדרי הטיפול ברעב: מניחים נייר מסנן בגודל מתאים בצלחת פטרי של 6 ס"מ ובפיפטה 1 מ ל של PBS על נייר הסינון.</li>
		<li>לחדרי טיפול בשליטה: מקום 5 מ ל של בלומינגטון מזון רגיל לארוחה בצלחת פטרי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמשו במרית כדי לחפור בעדינות את שכבת המזון העליונה המכילה זחלים שעדיין חופרים במזון ומעבירים אותם לצלחת פטרי המלאה ב -5 מ ל של PBS. מערבבים בעדינות את הזחלים ב-PBS כדי להסיר כל זיהום מזון מן הזחלים ולעשות את זה נקי ככל האפשר.</li>
	<li>השתמש במכחול קטן כדי לאסוף 40 הזחלים השלישי של באותו גודל משוער. למיין אותם אקראית לתוך הרעבה או תא בקרה, עם 20 הזחלים כל אחד.</li>
	<li>מניחים את התאים בחממה ב -25 ° c עם 60% לחות ומאפשרים פיתוח של 12 שעות, 24 שעות, ו 36 h של טיפול. הערה: עבור הזחלים בחדר הרעב, להוסיף 1 מ ל של PBS כל 12 h כדי למנוע התייבשות הזחלים.</li>
</ol>3. חיתוך הOenocytes
<ol><li>השתמש במכחול קטן כדי לקטוף הזחלים של הגיל המתאים (12 h, 24 שעות, או 36 h לאחר הטיפול), ואז להעביר אותם לצלחת פטרי חדשה מלאה 5 מ ל של PBS קר קרח לשטוף. הערה: חזור על השלב 2.2 כאשר התמודדות עם הזחלים בחדר הבקרה כדי להסיר את כל זיהום המזון.</li>
	<li>למלא צלחת הניתוח עם PBS קר קרח ולהשתמש מלקחיים כדי להעביר הזחלים בעדינות לתוך לוחית הניתוח. שים את לוחית הניתוח תחת מיקרוסקופ סטריאו לשלב הניתוח הבא. הערה: טמפרטורת הקרח הקרה תסייע לתנועות. איטיות של הזחלים ולהקל על הניתוח</li>
	<li>להפוך את הזחלים בצד העמוק למעלה ולמטה למטה בעדינות להחזיק במקום באמצעות מלקחיים. יש לאבטח את הזחלים במשטח הניתוח על-ידי הצבת סיכת חיתוך למרות הלוע בקצה הקדמי וסיכה נוספת בקצה האחורי. הערה: הצד השני מזוהה בקלות על ידי נוכחות של הגזעים הצדדיים של קנה הנשימה.</li>
	<li>השתמש במספריים של Vannas האביב כדי לפרוץ (longitudinally) דרך האפידרמיס מן הקדמי אל הקצה האחורי.</li>
	<li>להסיר את הרקמה הפנימית של האפידרמיס באמצעות מלקחיים. הערה: יש לנקוט זהירות בעת הסרת ענפי הקנה כדי למנוע נזק לoenocytes, אשר מותאמים למשטח הפנימי של האפידרמיס.</li>
	<li>עם מלקחיים, לאחזר את סיכות לחיתוך ולהעביר את האפידרמיס לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ממולא PBS על הקרח.</li>
	<li>המשיכו לנתח זחלים אחרים בעקבות ההליך המתואר לעיל.</li>
</ol>4. שומנים בצביעת Droplet
<ol><li>דגירה את האפידרמיס בגזור ב בופה קיבעון עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על מסובבי. הערה: מאגר הקיבעון מכיל 4% פאראפורמלדהיד (בארה ב) ב-PBS.</li>
	<li>הסר את מאגר הקיבעון, ואחריו כביסה מהירה. כדי לבצע כביסה מהירה, להוסיף 1 מ ל PBS ב RT לתוך הצינור לאחר הסרת התחתית, בעדינות להשהות את הרקמות, ולמחוק את ה-PBS. זהירות: מאגר הקיבעון מכיל את התחום הה, המזיק לבריאות האדם. חשוב להיפטר כראוי את מאגר הקיבעון כפסולת מסוכנת.</li>
	<li>לשטוף את הדגימות 3x עבור 5 דקות כל אחד עם PBS לשטוף את כל שאריות הכדורגלן האפשרי.</li>
	<li>דגירה את האפידרמיס עם BODIPY 493/503 (1 μg/mL; ראה טבלה של חומרים) עבור 30 דקות ב-RT על מסובבי. הערה: משלב זה ואילך, לעטוף את שפופרת מיקרוצנטריפוגה עם פיסת רדיד אלומיניום כדי להגן על דגימות מהאור ולמזער את התמונה האפשרי הלבנת.</li>
	<li>הסר את הפתרון BODIPY 493/503 כתמים ולשטוף את דגימות 3x עבור 10 דקות כל אחד עם PBS כדי להסיר לחלוטין צבעים שיורית.</li>
</ol>5. הרכבה והדמיה
<ol><li>מקום 6 μL של הרכבה בינונית על שקופית נקייה של מיקרוסקופ. הערה: אמצעי הרכבה משמש לזמן זיהוי ארוך יותר המבוסס על מאפייני העמעום שלו.</li>
	<li>מלקחיים להשתמש כדי להרים את האפידרמיס אחד בעדינות להסיר את שרידי PBS עם מחיקה.</li>
	<li>מניחים את האפידרמיס בתוך המדיום הגובר ומתאימים את האוריינטציה שלו כך שהמשטח הפנימי שלו המכיל את הoenocytes הוא בתחתית והמשטח החיצוני שלו הוא על החלק העליון.</li>
	<li>בעדינות למקם שמיכות על האפידרמיס. הערה: להסיר כל מדיום הרכבה נוספת דולף מתחת הכיסויים עם מחיקה, במידת הצורך. כדי להקל על הדמיה, בעדינות לדחוף למטה על coverslip עם מלקחיים כך כאשר התבוננות השקופית דרך המיקרוסקופ, האשכול oenocyte יכול להיות בקלות הדמיה במישור אחד בודד. לחילופין, זה מעשית לחתוך את האפידרמיס לתוך שני למחצה האפידרמיס דרך קו האמצע כדי למנוע גלגול של האפידרמיס כולו כאשר הרכבה הרקמות.</li>
	<li>החל לק ברור ציפורניים סביב קצות שמיכות כדי לאטום.</li>
	<li>שימו את השקופיות בתיבה לדוגמא לאור הזכוכית ואפשר לק הציפורן להתייבש ב RT, אשר עשוי להימשך 5-10 דקות.</li>
	<li>. המשיכי בניתוח מיקרוסקופי צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית (הגדלה של 63 x עם הגדרות מסנן gfp או fitc אופטימיזציה, עירור = 488 nm, פליטה = 503 nm) כדי לרכוש אותות נקיים ורגישים עם רקע ממוזער.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila%3A+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila: development and disease.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Cheng, Y., Chen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+fly+research+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Fruit fly research in China.</a> Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).</li>
<li>Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+and+Drosophila+models+to+investigate+the+mechanistic+links+between+diet%2C+obesity%2C+type+II+diabetes%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).</li>
<li>Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+hepatocyte-like+cells+regulate+Drosophila+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism.</a> Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).</li>
<li>Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+functions+of+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">The development and functions of oenocytes.</a> Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).</li>
<li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+suppresses+age-dependent+ectopic+fat+accumulation+by+maintaining+the+proteostasis+of+PLIN2+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila.</a> Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+lipid+droplet+turnover+in+response+to+nutrient+deprivation+via+p62-mediated+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).</li>
<li>Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+finally+get+a+little+R-E-S-P-E-C-T%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li>
<li>Murphy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+roles+of+intracellular+lipid+droplets%3A+from+archaea+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals.</a> Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Fowler, S. D., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Nile+red%2C+a+fluorescent+hydrophobic+probe%2C+for+the+detection+of+neutral+lipid+deposits+in+tissue+sections%3A+comparison+with+oil+red+O%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).</li>
<li>Gocze, P. M., Freeman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+underlying+the+variability+of+lipid+droplet+fluorescence+in+MA-10+Leydig+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells.</a> Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials (Basel). 11 (9), (2018).</li>
<li>BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).</li>
<li>Milon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+estrogens+regulate+lipid+status+in+testicular+steroidogenic+Leydig+cell%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?</a> Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).</li>
<li>Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E4+alters+astrocyte+fatty+acid+metabolism+and+lipid+droplet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li>
</ol>

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

בין המפורטים לעיל, קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה, כאשר הביצה מניחה את תקופת הזמן להיות אחת מאלה. כרקמה מoenocyte ליפיד, מדובר ברגישות גבוהה למצב תזונה6,8. פרקי זמן ממושכים להנחת ביצים עלולים לגרום לזחלים מוארכים ולתחרות מזון מוגברת, המובילה לתוצאות לא מדויקות. תקופת הביצה 1 h הנחת השימוש בפרוטוקול זה מאפשרת לזחלים להתפתח ללא תחרות תזונה. מספר גדול הרבה יותר של זחלים שיכולים לנבוע זמן רב יותר ביצים תקופות הנחת עשוי גם להשפיע על כמויות droplet ליפיד ודפוסי...

שומנים חיוניים להישרדות התא. בנוסף התפקיד המסורתי שלהם כמו רכיבים בלתי נפרד של מערכות קרום התאית, שומנים גם לשחק פונקציות מכריע אספקת אנרגיה ו איתות התמרה ברחבי מחזורי חיים של חיות בודדות1. כך, חילוף החומרים של השומנים חייב להתאים תקנות קפדנית כדי לשמור על הומוסטאזיס פיסיולוגיים בתאים. ידוע כי דיסרגולציה של מטבוליזם השומנים תוצאות מחלות שונות, כגון סוכרת ושומן בכבד. למרות החשיבות הרבה של חילוף החומרים לשומנים בבריאות בעלי חיים, המנגנונים הבסיסיים רגולציה מטבוליזם להישאר במידה רבה לא ידוע.
דרוזופילה שימש באופן נרחב במשך שנים מאז פרופ ' תומס ה. מורגן התחיל להשתמש בהם במחקרים הכרוכים בגנטיקה ושאלות אחרות ביולוגיות בסיסיות2. בעשורים האחרונים, ראיות מתפתחות הראו כי drosophila ילה היא אורגניזם מודל מצוין במחקר של מחלות מטבוליזם רבים הקשורים להשמנת יתר, כגון השמנה1,3. במיוחד, מניות Drosophila ילה שמרו באופן מאוד גנים מטבוליים עם בני אדם ובעלי הרקמות הרלוונטיות דומה/איברים סוגי תאים עבור חילוף החומרים השומנים.
לדוגמה, הגוף השמן של דרוסופילה, האחראי על האחסון הטריליגליליד, מתפקד בדומה לרקמת השומן האנושית. לאחרונה, אשכול של תאים המקצועית כמו hepatocyte (כלומר, oenocytes), אשר דווחו להיות אנלוגי פונקציונלי לכבד האדם, הוכחו להיות מעורבים בחומצות שומן ומטבוליזם פחמימנים של פירות זבובים4,5. בדומה למקרה של יונקים כבדים, oenocytes להגיב לרעב על ידי הפעלת היווצרות droplet השומנים בשני הזחל ומבוגרים drosophila ילה, וכתוצאה מכך הצטברות droplet השומנים ב oenocytes4,6,7,8. מבחינה אנטומית, oenocytes הם מחוברים היטב את המשטח הפנימי הבסיס של האפידרמיס לרוחב באשכולות של כ שישה תאים לכל פלח הבטן, מה שהופך אותו מאוד מסוגל לבודד אשכולות oenocyte מן האפידרמיס. כך, oenocytes חייב להיות מחובר האפידרמיס במהלך ניתוח וכתמים.
שומנים מאוחסנים בצורה של טיפות שומנים בדם, אשר אורגלים עם ממברנות שכבה אחת בתאים9. טיפות השומנים להתקיים כמעט כל סוגי התאים על פני זנים שונים10. השומנים הדינמיקה droplet, כולל גודלו ומספר, שינוי בתגובה לגורמי הסביבה. הדבר נחשב כהשתקפות של מצב חילוף החומרים בתגובה למתח, כגון הזדקנות ורעב7,8. לכן, זה חשוב מאוד לפתח שיטה אפשרית ואמינה כדי לקבוע את השומנים droplet הדינמיקה oenocytes במהלך הפיתוח ובתנאים מלחיצים. בפרט, הזחלים הoenocytes השלישי, מכילים מעטים או לא לגילוי טיפות שומנים תחת התנאים האכילים, אבל הם מכילים רבים טיפות השומנים גדול לאחר מחסור בתזונה4. כדי לאמת את האפקטיביות של שיטה זו, הוא הציע לבצע כתמים droplet השומנים ב oenocytes תחת תנאים מורעבים.
כיום, מספר צבעים ליפופילית זמינים לצביעת טיפות שומנים בדם, כגון צבעי פלורסנט בסודאן שחור ושמן אדום וצבעי פלורסנט הנילוס אדום BODIPY 493/50311. סודן שחור, שמן אדום O משמשים בדרך כלל עבור cholesteryl אסטרים רקמות triacylglycerols ניתן לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופ אור. עם זאת, כתמים ברקע גבוה יחסית ברזולוציה נמוכה יחסית הם שני גורמים מגבילים עבור היישומים שלה בניתוח איכותני של שומנים בדינמיקה droplet. כדי להתגבר על מגבלות של צבעי פלורסנט, הנילוס אדום ו BODIPY 493/503 מנוצלים כתחליף אידיאלי עבור כתמים droplet השומנים. זה דווח כי הנילוס אדום יכול גם לזהות כמה כולסטרול שאינו מתאים, מה שהופך bodipy 493/503 צבע ספציפי יותר עבור טיפות השומנים הסלולר, במידה מסוימת12,13,14.
מעל לכל, כדי למלא את הצורך בניתוח מהיר ורגיש של טיפות שומנים בדם ב oenocytes, פרוטוקול זה מציג שיטה אפשרית ומאוד הניתן לשימוש של fixative מבוססי שומנים באופן ספציפי droplet-ספציפיים באמצעות BODIPY 493/503 כמו צבע הכתם. בדו ח זה, oenocytes הם גזור, ו bodipy 493/503 משמש לצביעת droplet השומנים בoenocytes, שבו טיפות שומנים מזוהים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. הקלות והנוחות ביותר של הליך זה הופכים אותו לאידיאלי עבור שינוי ושימוש נוסף ביישומים אחרים, כגון הזרימה cy, try.

<table><tbody><tr><td>צינור צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>430829</td><td>קורנינג 50 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>6 ס"מ צלחת פטרי</td><td>תרמו פישר</td><td>150326</td><td>6 ס"מ</td></tr><tr><td>אגר</td><td></td><td></td><td>למזון זבובים</td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>הגן על סמפל מפני אור</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>צבע מכתים טיפות שומן</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>Leica TSC SP5</td><td>הדמיה קונפוקלית</td></tr><tr><td>סירופ</td><td></td><td></td> תירס <td>למזון זבוב</td></tr><tr><td>קמח</td><td></td><td></td> תירס <td>למזון זבוב</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td>20 ופעמים; 20 מ"מ, 0.13-0.17</td></tr><tr><td>עבה סיכת חיתוך</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>צלחת חיתוך</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>N/A</td> קוטר <td>N/A</td><td>: 11 ס"מ</td></tr><tr><td>מאגר קיבוע</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>4% Paraformaldehyde (PFA) ב-1x PBS</td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>#5</td></tr><tr><td>חממה</td><td>Jiangnan</td><td>SPX-380</td><td>לתרבית זבובים</td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופיה</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>אמצעי הרכבה</td><td>VECTASHIELDAntifade הרכבה בינונית</td><td>H-1000</td><td>Antifade הרכבה בינונית</td></tr><tr><td>לק</td><td>PanEra</td><td>AAPR419</td><td>לאטום את הכיסוי</td></tr><tr><td>מברשת צבע</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>N/A N</td><td>/A</td><td>1x PBS (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)</td></tr> <tr><td>מסובב</td><td>מכשירי מעבדה Kylin-Bell</td><td>WH-986</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Smartdata רפואיים</td><td>SR81</td><td>Vannas מספריים קפיציים</td></tr><tr><td>קמח</td><td></td><td></td> סויה <td>למזון זבובים</td></tr><tr><td>מרית</td><td>N/A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>מזון קמח תירס סטנדרטי</td><td>N/A</td><td>N / A</td><td>קידוד למתכון מזון קמח תירס סטנדרטי של בלומינגטון</td></tr><tr><td>סטריאו מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>Leica S6E</td><td>לנתיחת רקמות</td></tr><tr><td>ניגוב נייר</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>שמרים</td><td></td><td></td><td>למזון זבובים</td></tr><tr><td></td><td>yw נשמר כמלאי מעבדה</td><td>N/A</td><td>Drosophila</td></tr></tbody></table>

לחיתוך וליפיד droplet כתמים של oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

שומנים חיוניים להתפתחות בעלי חיים והומאוסטזיס פיזיולוגי. דיסרגולציה של מטבוליזם השומנים מביא לפגמים התפתחותיים שונים ומחלות, כגון השמנת יתר ושומן בכבד. בדרך כלל, שומנים מאוחסנים טיפות שומנים בדם, אשר הם שומנים משולבים אחסון השומנים בתאים. טיפות ליפיד משתנות בגודל ובמספר ברקמות שונות ובתנאים שונים. זה דווח כי טיפות השומנים מבוקרת היטב באמצעות רגולציה של biogenesis שלה השפלה. ב Drosophila ילה melanogaster, oenocyte היא רקמה חשובה עבור חילוף החומרים לשומנים והוא זוהה לאחרונה בתור הכבד האנושי אנלוגי לגבי הגיוס השומנים בתגובה ללחץ. עם זאת, המנגנונים המשמשים את הוויסות של מטבוליזם droplet השומנים ב oenocytes להישאר חמקמק. כדי לפתור בעיה זו, הוא בעל חשיבות עליונה כדי לפתח שיטה אמינה ורגישה כדי להמחיש ישירות שינויי שומנים דינמיים oenocytes במהלך הפיתוח ובתנאים מלחיצים. ניצול של ליפופילית BODIPY 493/503, השומנים droplet ספציפי לצבוע פלורסנט, תיאר כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור הניתוח והoenocytes השומנים הבאים מכתים בתוך הזחלים של דרוזופילה בתגובה לרעב. זה מאפשר ניתוח איכותני של שומנים בדינמיקה השומנים בתנאים שונים על ידי קונפוקלית יקרוסקופיה. יתר על כן, זו שיטה מהירה ומאוד הניתנת לכימות יכול לשמש גם במסכים גנטיים עבור משיניים גורמים גנטיים הרומן מעורבים מטבוליזם droplet השומנים ב oenocytes ורקמות אחרות.

ביצוע מוצלח של הליך זה צריך לגרום טיפות שומנים ברורים מכתים שחושף את מספר וגודל של טיפות השומנים ב oenocytes. איור 1a, A ', a ' ' מראה כי יש כמה טיפות השומנים לזיהוי (נקודות ירוקות) בoenocytes של הזחלים האכלה נורמלית במהלך שלבים התפתחותיים שונים. איור 1b, B ', b ' מראה מוגברת טיפות השומנים (נקודות ירוקות) סכום oenocytes בתגובה 12 h (ב), 24 h (ב), ו 36 h (ב ') תקופות של רעב. יש לציין כי לאחר 96 h,...

הציגו כאן הן שיטות מפורטות לחיתוך וליפיד droplet כתמים של oenocytes ב הזחלים Drosophila ילה באמצעות BODIPY 493/503, שומנים בצבעי פלורסנט ספציפי לשומנים.

לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

שיטה זו של ניתוח oenocyte וכתמים טיפת השומנים ניתן להשתמש כדי להבין את המראה של טיפת השומנים ב oenocyte זחלים drosophila בתנאים נורמליים ולחוצים. שיטה זו מספקת כלי שימושי לחקר חילוף החומרים של השומנים לא רק חרקים, אלא גם יונקים עם שינויים קלים מעטים בלבד. כדי לגרום להטלת ביצים, הניחו 150 זבובים נקביים בתוליים ו-75 זכרים של הגנוטיפים הרצויים בבקבוק מטיל ביצים והניחו את הבקבוק מתחת לקופסה חסינת אור באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס עם 60% לחות.לאחר שעה, מעבירים את הזבובים לבקבוק חדש ומניחים לזבובים להטיל ביצים בבקבוק החדש במשך שעה לפני הוצאת המבוגרים. לאחר מכן, אפשרו לביצים להתפתח לזחלי instar השלישיים למשך 84 שעות ב-25 מעלות צלזיוס עם מחזור בהיר-כהה של 12 שעות. לפני תחילת הטיפול ברעב, מניחים פיסת נייר סינון בגודל הולם לתוך צלחת פטרי בגודל שישה סנטימטרים ומוסיפים מיליליטר אחד של PBS על הנייר כדי ליצור תא רעב.כדי להפוך תא טיפול בקרה, למקם חמישה מיליליטר של מזון קמח תירס סטנדרטי בלומינגטון לתוך צלחת פטרי שישה סנטימטרים. כאשר התאים מוכנים, השתמש במברשת צבע קטנה כדי לאסוף זחלים instar באותו גודל משוער מבקבוק הטלת ביצה. ו-20 זחלים באופן אקראי לכל רעב ולתא הבקרה.לאחר מכן מניחים את התאים באינקובטור במשך 12, 24 או 36 שעות של פיתוח ו / או רעב. בסוף תקופת הטיפול, השתמש במקלפים כדי להעביר בעדינות זחלים מכל תא לתוך צלחת ניתוח המכילה PBS קר כקרח ול מניחים את הצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו. לכוון את הצד הגחוני הראשון של הזחל למעלה ולהשתמש במקלות כדי להחזיק בעדינות את הזחל במקום.מניחים סיכה אחת דרך הלוע וסיכה נוספת דרך הספירק כדי לאבטח את הזחל לצלחת. השתמש מספריים האביב Vannas לעשות חתך אורך דרך האפידרמיס מן anterior לקצה האחורי של החיה. השתמש מטחנים כדי להסיר את הרקמה הפנימית של האפידרמיס, דואג כדי למנוע נזק oenocytes על פני השטח הפנימיים של האפידרמיס.לאחר מכן השתמש במדפים כדי לאחזר את סיכות הניתוח ולהעביר את האפידרמיס לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר של PBS על קרח. עבור כתמי טיפת שומנים, דגירה האפידרמיס נותחה במאגר קיבוע במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב, ואחריו הפוגה מהירה במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן לשטוף את הדגימות עם שלוש שטיפות חמש דקות במיליליטר אחד של PBS לכל לשטוף כדי להסיר כל שאריות תיקון.לאחר הכביסה האחרונה, הדגירה דגימות האפידרמיס עם בדיקה ליפופילית מתאימה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב. במהלך הדגירה, לעטוף את צינורות מדגם בנייר כסף כדי להגן על הרקמות מפני אור ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים במיליליטר אחד של PBS במשך 10 דקות לכל לשטוף. כדי לדמיין את האונוציטים, העבר כל דגימת אפידרמיס לשישה מיקרוליטרים של מדיום הרכבה על מגלשת מיקרוסקופ נקייה, התאם את כיוון הרקמה, כך שהמשטח הפנימי המכיל את האונוציטים נוגע בתחתית השקופית.מניחים בעדינות כיסוי על האפידרמיס ואוטמים את הקצוות עם לק ציפורניים ברור. כאשר הלק התייבש, תדמיין את הדגימות במיקרוסקופ קונפוקל, שים הגדלה של 63 X עם אורכי הגל המתאימים של העירור וההפלה. יש כמה טיפות שומנים לגילוי בתוך oenocytes של זחלי האכלה נורמליים בשלבים התפתחותיים שונים.כפי שנצפה בתמונות מייצגות אלה עם זאת, טיפות השומנים להגדיל את מספר oenocytes בתגובה 12, 24, ו 36 שעות תקופות של רעב. שיטה זו מספקת פרוטוקול קל וישים לחוקרים בתחומי מחקר רלוונטיים כדי לחקור אם מניפולציות גנטיות או סביבתיות לגרום לשינויים טיפת השומנים בתאים.

dissection-lipid-droplet-staining-oenocytes-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בשנת חרקים, oenocytes לייצר תרכובות פחמימנים cuticular. תרכובות אלו להגן מפני התייבשות ולאפשר תקשורת כימית. כאן אנו להפגין טכניקה לנתיחה להשתמש כדי לבודד את oenocytes מן...

Dissection של Oenocytes מן למבוגרים תסיסנית melanogaster</em

כמה נישות ותאי גזע צורה במהלך הפיתוח היא שאלה חשובה עם השלכות מעשיות.

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

הגורם המגביל בשימוש של...

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

הגישה הסטנדרטית כדי להכין את...

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

סרטון זה מדגים צביעת טיפות שומנים באואנוציטים של זחלי דרוזופילה - תאים דמויי הפטוציטים - באמצעות צבע פלואורסצנטי ליפופילי מבוסס BODIPY. תאים אלה משמשים כמודל לחקר חילוף החומרים של שומנים במהלך ההתפתחות ובתגובה לעקה סביבתית כגון רעב.

צביעת טיפות שומנים של Oenocytes Drosophila זחל: טכניקה להערכת הצטברות טיפות שומנים במצב רגיל ולחוץ באמצעות צבע מבוסס BODIPY

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

תסיסנית ומערכות hematopoietic יונקים חולקים הרבה מאפיינים משותפים, מה שהופך תסיסנית מודל גנטי אטרקטיבי ללמוד hematopoiesis. כאן אנו מדגימים לנתיחת הרכבה של איבר hematopoietic הגדול זחל אימונוהיסטוכימיה. כמו כן, אנו מתארים שיטות Assay שונים תאי hematopoietic זחל כולל hemocytes במחזור ותאי קריסטל נייחים.

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

ניתוח הקשר בין מבנה המיטוכונדריה לתפקוד נדרש להבנה מעמיקה של מנגנוני הרגולציה של פונקציונליות המיטוכונדריה. שיטות ספציפיות לחקר המבנה והתפקוד המיטוכונדריאלי בשחלות דרוזופילה חיות וקבועות מתוארות ומודגמות במאמר זה.

לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי תסיסנית שחלות

השחלה דרוזופילה הוא מערכת דגם מעולה ללימוד פיתוח גומחת תאי גזע. על פי שיטות ניקוד השחלות זחל ומבוגרים פורסמו, השחלה הגולמי והניתוחים דורשות טכניקות שונות זה לא פורסמו בפירוט. כאן אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לנתח, מכתים של הרכבה השחלות הגולמי.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

למדו לבצע ניתוח אנוציטים וצביעת טיפות שומן בזחלי דרוזופילה באמצעות צבע BODIPY 493/503. שיטה זו מאפשרת לחקור מטבוליזם שומנים בתנאי רעב ולחקור מחלות מטבוליות.

לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

גלה סרטונים נוספים