יישום של ממברנה וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית עבור הדמיה בשידור חי התא של פטריות Filamentous

צבעי פלואורסצנט סלקטיביים ממברנה וקיר תא הם כלים חשובים לניתוח דינמיקת organelle ותאים פטרייתיים חיים. הפרוטוקולים שלנו מספקים רקע תיאורטי חיוני והנחיות מעשיות ליישום מבחר צבעים אלה כתמים חיוניים באמת. נקודת המפתח לכך היא להשתמש בריכוזי צבע נמוכים מאוד שאינם גורמים לחפצים תאיים הקשורים לרוויה או לרעילות צבע ועדיין מספקים אות טוב ליחסי רעש להדמיית תאים חיים באיכות גבוהה וארוכת טווח.

עם עמיתים מהמחלקה לרפואה גרעינית של האוניברסיטה הרפואית, השתמשנו לאחרונה בטכניקות הכתמים האלה כדי לפתח גישה חדשנית לאבחון מונחה תמונה של aapergillosis. היכולת לפקח על מבני קרום וקיר התא בזמן אמת הייתה חיונית לקביעת דינמיקת ספיגת תרכובת התרופה הניסיונית. כדי להתחיל בהליך זה, השג תחילה תרבות מוקדמת מוכנה.

השתמש אזמל סטריל לחתוך בלוק אגר קטן שנושא מיסליום לא sporulating מקצה המושבה של תרבות מוקדמת. מניחים את גוש אגר במרכז צלחת בינונית טרייה ומוצקה כדי לחסן את התרבות הניסיונית. הדגירה את התרבות הניסיונית על פי השלב ההתפתחותי שנועד להיות דגירה.

הכנת מדגם היא עדינה במקצת ואופטימיזציה של הגדרות רכישת תמונה היא מורכבת למדי. הדגמה חזותית של שני ההליכים המלווים בהסבר מילולי מקלה מאוד על ההגיון. כדי לטעון את הדגימות, יש לשמור על תפירת כיסוי זכוכית נקייה של 24 על 60 מ"מ ולהוסיף למרכז 18 מיקרוליטרים של תות תוסף מלח נוזלי מינימלי בינוני או פיזיולוגי.

הוסף שני microliters של מוכן 20 פתרון עבודה צבע micromolar לנוזל במרכז להחליק את הכיסוי ומערבבים היטב על ידי צינורות למעלה ולמטה מספר פעמים תוך הימנעות הייצור של בועות אוויר. באמצעות אזמל נקי, לגזור מדגם 15 על ידי 15 מילימטר מהפריפריה של המושבה ולמקם אותו אנכית ליד טיפה בינונית על החלקת הכיסוי. השתמש באזמל כדי לתמוך בקצה העליון של הבלוק ואצבע להחזיק את הצד האחורי של הבלוק במקום.

לאחר מכן, לאט לאט להוריד את הצד נושא את המסטליום על הנוזל. הר את הדגימה המוכנה על שלב המיקרוסקופ. תחילה, התאימו את קביעות רכישת התמונה הבסיסיות כדי ללכוד דינמיקה עומדת בהיקף בודד כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

לצורך בדיקות ספיגת אנדוציטוזיס, התייעץ עם איור 1 וטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט כדי לזהות את הגדרות העירור וההמסה הטובות ביותר עבור FM 143 או FM 464 הזמינות במערכת המיקרוסקופיה ולהתאים הגדרות אלה במערכת בהתאם. התחל הקלטת תמונה באמצעות ההגדרות שהותאמו בעבר והערך את התוצאות. לאחר מכן, מטב את הגדרות רכישת התמונה לרזולוציה המרחבית והזמפוראלית הנדרשת כדי ללכוד את ההיבט של קרום פלזמה או דינמיקת אנדוציטוזיס שהניסוי מתמקד בה.

לדינמיקה של קיר התא, התייעץ עם איור 4 וטבלה אחת של פרוטוקול הטקסט כדי לזהות את הגדרות העירור וההמסה הטובות ביותר עבור צבע קיר התא המוחל ולהתאים את ההגדרות במערכת המיקרוסקופיה בהתאם. התחל הקלטת תמונה באמצעות ההגדרות שהותאמו בעבר והערך את התוצאות. לאחר מכן, מטב את הגדרות רכישת התמונה לרזולוציה המרחבית והזמפוראלית הנדרשת כדי ללכוד את ההיבט של מורפוגנזה של קיר התא שהניסוי מתמקד בו.

בנוסף רק לדמיין תהליכים תאיים, הדמיה של תאים חיים מאפשרת הפקת מידע כמותי מהנתונים המוקלטים. בדוגמה של מסיאי ספיגת FM 464, דגימות פטרייתיות מעובדות כמושבות ומורכבות בשיטת בלוק אגר הפוכה. הראיה זיהתה פגמים בארגון spatio-temporal של אנדוציטוזיס במחיקת גנים וגנים מבטאים יתר על כן מוטנטים של החלבון הספציפי הפטרייתי SFP 2 של trichoderma atroviride.

דוגמאות של FM 464 שיתוף הכתמים של חלבוני היתוך פלואורסצנטיים המיועדים לתאים אנדוציטיים מוצג כאן. כתם משותף זה מועסק כדי לקשר את ההתפלגות התת-תאית של שני החלבונים הפלואורסצנטיים הירוקים המשופרים המתויגים בחלבוני טרנס-ממברנה, SFP 2 ו- GPR 1, למסלול האנדוציטי בטריווירוסיד טריכודרמה. דוגמה של FM 464 שיתוף הכתמים לזיהוי הבדלים מורפוגנטיים מראה כי זה שיתוף הכתם מאפשר קשר נוסף של הדינמיקה לוקליזציה subcellular של חלבון מורכב BUD-6 תיוג קמח כדי לסיים כמה תהליכים תלויי סחר כגון היווצרות של ספיגה וצמיחה מקוטבת קצה המקף.

הוא גם מאפיין הבדלים בארגון התת-תאי ובארכיטקטורת המקף בין סוג פראי וזנים מוטנטים של קרסה נוירוספרה. כתמי קיר תאים מייצגים מראים כי תכונות האינטראקציה השונות של לבן קלקופלור, solophenyl flavine, וקונגו אדום עם פולימרים קיר התא להדגיש הבדלים מורפגנטיים בין מוטציה דלתא SFP 2 ואת סוג הבר של trichoderma atroviride. הגדלת הלחץ בקיר התא שנגרם על ידי ריכוזי צבע גבוהים מתרחשת מהר יותר והוא בולט יותר מוטציה לעומת סוג הבר.

בנוסף, אותן תמונות מאפשרות כימות של הבדלים מורפוגניים לגבי קוטר המקף ומרחק המחיצה בין שני הזנים. ניטור מייצג בזמן אמת של biosynthesis קיר התא עולה כי ריכוז לבן calcofluor נמוך מאוד מונע רוויה של קיר התא עם מולקולות צבע ומאפשר ניטור כמותי בזמן אמת של biosynthesis קיר התא. זה מגלה כי התצהיר של חומר קיר תא חדש אינו אחיד, אבל מגיב במהירות רבה ללחצים פיזיים מקומיים הנובעים עקירה יחסית של תא אחד על התקשרות תא לתא לפני dermalinfusion ב neurospora crassa.

פחות זה יותר. יש להשתמש בצבע מועט ככל האפשר כדי למנוע הפרעה לסמן הפלואורסצנטי בתהליכים תאיים. בעקבות הליך זה, התאוששות flourescence לאחר ניסויים הלבנת תמונה יכול להתבצע כדי לכמת תחבורה ביוגנזה קינטיקה.

ההקדמה החלוצית של כתמי ממברנה וקיר תאים בפטריות סיסמנטיות בתחילת המילניום עשתה ממש מהפכה באופן שבו אנו מסתכלים על פטריות. לבן Calcofluor יכול לגרום לגירויים בעיניים והוא סרטן מסווג. קונגו אדום הוא cancerigenic ו טרטוגנית, אז בבקשה ללבוש הגנה על העין והעור בעת טיפול צבעים אלה.