ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

פרוטוקול זה מספק שיטה מדויקת לשחזור לכמת עשר מחלקות שומנים שונות של Saccharomyces cerevisiae באמצעות שיטת מיצוי אחת ושיטת LC-MS אחת. שיטה זו מאפשרת איתור וכמות של מינים איזובריים איזובריים ושומנים איזומטריים בעלי תכונות כימיות ופיזיות שונות. לתרבות Saccharomyces cerevisiae, הוסיפו תחילה 5 מ"ל של תמיסת מלאי סטרילית של 20% גלוקוז לכל אחד משני בקבוקוני ארלנאמאייר המכילים מדיום YNB סטרילי לריכוז סופי של 2% גלוקוז.

לאחר מכן, השתמש פיפטה סטרילית להעביר נפח של תרבות שמרים לילה המכיל חמש פעמים עשרה לתאי השמרים השביעי לתוך כל בקבוק ולתרבת את flasks לפחות 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם רעידות סיבוב ב 200 מהפכות לדקה. עבור שאיבת שומנים, לקבוע את המספר הכולל של תאי שמרים למיליליטר של תרבות ולהעביר חמש פעמים עשר לתאים השביעי לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. מוסיפים מים קרים כקרח ננו טהורים כדי להביא את הנפח הכולל עד 15 מ"ל ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.

להשעות מחדש את גלולת שמרים ב 15 מ"ל של קרח קר iso-טוניק אמוניום ביקרבונט חיץ עבור צנטריפוגה שנייה להשעות מחדש את גלולה ב 1.5 מ"ל של קר קרח קר אמוניום bicarbonate פתרון. בסוף הצנטריפוגה, לאחסן את גלולה ב 80 מעלות צלזיוס עד החילוץ. כדי להתחיל את מיצוי השומנים, להפשיר את גלולת התא על קרח לפני השעיית התאים מחדש ב 200 microliters של קרח קר ננו טהור מים.

במכסה המנוע אדים, להעביר את ההשעיה התא 15 מ"ל, זכוכית בעוצמה גבוהה, בורג צינור צנטריפוגה העליון עם כובע מצופה polytetrafluoroethylene ולהוסיף 25 microliters של תערובת סטנדרטים שומנים פנימיים, מוכן 2:1 מתנול כלורופורם. 100 מיקרוליטרים של 425 עד 600 חומצה מיקרומולרית שטפו בחנוזי זכוכית ו-600 מיקרוליטרים של מתנול כלורופורם 17:1 לצינור. מערבולת הצינור במהירות גבוהה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשבש את התאים.

ואחריו מערבולת במשך שעה במהירות נמוכה בטמפרטורת החדר כדי להקל על מיצוי השומנים. בסוף החילוץ, הדגירה את המדגם במשך 15 דקות על הקרח, כדי לקדם משקעים חלבון ואת ההפרדה של שלבים מיווים ואורגניים. בסוף הדגירה, צנטריפוגה המדגם כדי להפריד עוד יותר את השלב הממימי העליון מהשלב האורגני התחתון, במכסה המנוע של האדים, להשתמש פיפטה זכוכית borosilicate להעביר את השלב האורגני התחתון חדש 15 מיליליטר זכוכית חוזק גבוה בורג צינור צנטריפוגה העליון עם כובע מצופה polytetrafluoroethylene.

מניחים את השלב האורגני התחתון תחת זרימת גז חנקן, במכסה המנוע של האדים, מוסיפים 300 מיקרוליטרים של תערובת מתנול כלורופורם 2:1 לשלב המימי העליון הנותר. כדי להקל על פוספטידיקאציד, פוספטידילסרין, פוספטידילינוזיטול ומערבולת מיצוי לב-שומנים הצינור במרץ במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני צנטריפוגה המדגם. השתמש פיפטה זכוכית borosilicate להעביר את השלב האורגני התחתון לתוך השלב האורגני התחתון תחת חנקן ולאדות את הממס בשלבים האורגניים המשולבים במכסה המנוע אדים.

לאחר מכן, לסגור את הצינורות של סרט השומנים תחת זרימת גז חנקן ולאחסן את הדגימות ב 80 מעלות צלזיוס. עבור כרומטוגרפיה נוזלית, הפרדת השומנים המופקים ב 500 microliters של 63:35:5 אצטו ניטריל-2-פרופנול ננו טהור תערובת מים לצינור של סרט השומנים ומערבולת שלוש פעמים במשך עשר שניות למערבולת בטמפרטורת החדר. נושא תוכן הצינור sonication קולי במשך 15 דקות לפני מערבולת הצינור שלוש פעמים במשך עשר שניות לכל מערבולת כפי שהוכח רק.

להעביר 100 microliters של המדגם לתוך בקבוקון זכוכית עם הכנס המשמש עבור צלחת 24 גם לחסל את כל הבועות בתוך הכנס. מניחים את ההוספה לתוך באר אחת של צלחת 24 באר טען שלב הפוך C18 עמודה CSH יחד לעמודה מראש לתוך מערכת כרומטוגרפיה נוזלית. הגדר את טמפרטורת העמוד ל 55 מעלות צלזיוס ואת הזרימה ל 300 microliters לדקה.

כאשר כל הפרמטרים נקבעו, לטעון עשרה microliters של חילוץ ריק לפני טעינת המדגם הראשון. לאחר מכן, להפריד את מיני השומנים השונים באמצעות שיפוע כרומטוגרפיה נוזלי, כפי שצוין. כרומטוגרמת יון כוללת מייצגת מנתוני LC-MS עבור השומנים שחולצו מהתאים תיווצר.

לניתוח ספקטרומטרי מסה של השומנים שחולצו, לטעון את הדגימות על ספקטרומטר מסה מצויד במקור יון יינון אלקטרו-ספריי מחומם ולהגדיר את פרמטרי הניתוח כמתואר בטבלה. השתמש מנתח טרנספורמציה פורייה כדי לזהות את היונים אב MS-1 ברזולוציה של 60, 000 ובטווח המסה של 150-2000 דלתונים. לאחר מכן, זהה את היונים המשניים MS-2 באמצעות ההגדרות כפי שצוין בטבלה.

כדי לזהות ולכימת שומנים שונים מקבצי LC-MS דו-מושביים רחבים, חפש בקבצים גולמיים של LC-MS המכילים נתוני MS-1 סריקה מלאה ותלויים בנתונים MS-2 עבור חומצות שומן לא מאושרות בחינם, לב-שומנים, פיטוצריד, פיטו-פינגוקולן, פוספטידילכולין, פוספטידילטנולאמין, פוספטידליגלגלצרול, פוספטידלינוזיטול, פוספטידלסרין וטריאצ'ילגלצרול השומנים באמצעות מסה המחולקת על ידי סובלנות תשלום של חמישה חלקים למיליון עבור יונים מבשרים ועשרה חלקים למיליון עבור יוסונים מוצרים. לאחר מכן, בצע את ההוראות המופיעות במדריך למשתמש התוכנה כדי לזהות תקני שומנים פנימיים ומינים שומנים עם קומפוזיציות חומצות שומן יוצא דופן. שיטת LC-MS טנדם רגישה זו מאפשרת זיהוי וכימות של מינים מולקולריים של שומנים בריכוזים הנמוכים מ- 0.165 פיקומולר למיקרוליטר.

מגבלה זו של כימות שונה משיעורי שומנים שונים במגוון רחב של ריכוזים. שיטה זו יכולה לשמש כדי להגביר את היעילות של יינון עבור שומנים באמצעות תוספי פאזה ניידים חלופיים עבור ספקטרומטריית מסה יינון electrospray. כל אחד מתוספים חלופיים אלה של פאזה ניידת יכול לשמש הן עבור עמודות שלב רגיל והן עבור LC פאזה הפוכה.

שיטת דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות מועילה אם נעשה שימוש בשילוב עם תוסף פאזה נייד אמוניום אצטט עבור מצב שלילי יינון אלקטרו-ספריי של ספקטרומטריית מסה, כמו, בתנאים אלה, זה מאפשר את הגידול ביעילות של פיצול יון השומנים MS-1 לתוך מוצרי MS-2. לעומת זאת, האנרגיה הגבוהה, שיטת דיסוציאציה התנגשות הוא חיובי אם נעשה שימוש בשילוב עם תוסף שלב נייד אמוניום formate עבור מצב חיובי יינון אלקטרו-ספריי של ספקטרומטריית מסה כמו בתנאים אלה, זה מאפשר עלייה ביעילות של פיצול יון השומנים MS-1 לתוך מוצרי MS-2. אין לערבב את השלבים בעת איסוף השלב האורגני.

סגור את הצינורות תחת זרימת גז חנקן. לחסל כל בועה בתוך להוסיף ולחבר את העמודה בכיוון הנכון. אם זהותו של שיא כלשהו אינה ניתנת לנחישות על-ידי LC-MS, ניתן להשתמש ב- MS-NMR כדי להסיק את המבנה של מולקולה זו.