Name: שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: למד את שיטת ה-cryoAPEX ללוקליזציה מדויקת של חלבוני ממברנה בתאי HEK293 תוך שימור מבנה תאי. טכניקה זו חיונית לחקר מנגנוני שכפול ויראלי ואינטראקציות חלבונים בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרוטוקול המתואר כאן נובע מפרסום על ידי Sengupta ואח ', היומן של מדע התא, 132 (6), jcs222315 (2019)48. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים R01GM10092 (כדי ס) ו AI081077 (R.V.S.) מן המכון הלאומי לבריאות, CTSI-106564 (ל ס) מתוך אינדיאנה מכון למדעי המחקר, ו PI4D-209263 (כדי ס) מהמכון האוניברסיטאי Purdue לדלקת, אימונולוגיה, ומחלות זיהומיות.

1. תרבית תאים והעברה
<ol><li>זרעי HEK-293T תאים בקוטר 60 מ"מ או גדול יותר התרבות רקמות ולגדול ל 60% – 90% המפגש בחממה תרבות התא ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
	<li>תאי העברה עם הבעה מAPEX2-מתויגים באמצעות מגיב (ראו טבלת חומרים) בהתאם להנחיות היצרן.</li>
	<li>ב 12-15 h לאחר ההעברה, לשטוף את התאים פעם אחת עם מלוחים מאגור פוספט (PBS). להסיר תאים ממנה על ידי כביסה עדינה עם PBS. מגיב דיסוציאציה כגון טריפסין עשוי לשמש אם נדרש עבור סוג תא נתון. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות כדי ליצור גלולה.
</li>
</ol>2. קיבעון כימי ותגובת Peroxidase
<ol><li>הסר בזהירות את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה ב 2 מ ל של 2% glutarאלדהיד (v/v) ב 0.1 M נתרן קאבאיחור במאגר, pH 7.4, בטמפרטורת החדר. לדגום את הקרח ואת הביצה במשך 30 דקות. גלולה המדגם ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. מנקודה זו עד שלב 2.3.3, לשמור על המדגם והפתרונות על קרח, ולבצע צנטריפוגה ב 4 ° c. התראה: הן הגלוטרלדהיד והן מאגר הנתרן הקשני (המכילים ארסן) רעילים. יש להשתמש בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי במהלך הטיפול. יש להיפטר מתמיסות המכילות גלוטרלדהיד ו/או מאגר הנתרן הכימי המכיל כפסולת כימית מסוכנת.</li>
	<li>לשטוף את הגלולה 3x עבור 5 דקות עם 2 מ ל של 0.1 M נתרן קא, המאגר המאוחר. עבור אלה, כמו גם שוטף הבאים, בעדינות מחדש את הגלולה התא בפתרון הנדרש, ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g ובזהירות להסיר ולמחוק את supernatant. יש לקחת את הטיפול באמצעות הפלטינג והשלבים החוזרים, על מנת למזער את ההפסד לדוגמה.</li>
	<li>לבצע את התגובה הperoxidase<ol>
<li>להכין פתרון טרי המכיל 1 מ"ג/mL של 3, 3 '-diaminobenzidine הטהידרוכלוריד (בתוספת) ב 0.1 M נתרן המאגר האחרון. לפזר את התוספת על ידי וורטקנג נמרץ עבור 5 – 10 דקות. התראה: הדבר רעיל ומסרטן פוטנציאלי, ויש לטפל בו עם נוהלי בטיחות נאותים וציוד הגנה אישי. יש להתייחס לפתרונות המכילים את הטיפול בחומר כפסולת כימית מסוכנת.</li>
		<li>לשטוף את הגלולה על ידי השעיית מחדש 3 מ ל של הפתרון לאחר מכן לאחר מכן לפלטטינג ב 500 x g עבור 5 דקות.</li>
		<li>השהה מחדש את הגלולה בתמיסת 3 מ ל שאליה מימן מי חמצן נוספה כדי להשיג ריכוז סופי של 5.88 מ"מ. מודקון עבור 30 דקות ב temp בחדר. הגלולה הופכת בצבע חום בעליל המציין את הנוכחות של המוצר מסיסים התגובה להטיפה. הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב את זמן הדגירה עבור כל דוגמה. ניתן לפקח על שינוי הצבע במיקרוסקופ האור. מניסיוננו, הדגירה של 15 עד 45 דקות מספיקה עבור רוב החלבונים. תחמוצת מימן צריך להיות מושגת בקבוק נפתח טרי או אחד שנשמר היטב סגור לאחר פתיחת.</li>
		<li>גלולה את התאים, ולאחר מכן לשטוף 2x עבור 5 דקות עם 0.1 M נתרן מאגר באיחור של סודיום, ואחריו לשטוף אחד ב בינונית שונה של הנשר של דולבקה (DMEM) או תא מדיה של בחירה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-500 μL של פתרון של הגנה על ההקפאה של DMEM (או מדיית תא אחרת של בחירה) המכילה 10% נסיוב בקר עוברי ו 15% סרום שפרה. גלולה שוב, הגדלת מעט את מהירות הצנטריפוגה מ 500 x g אם נדרש כדי להשיג גלולה בתמיסה עבה-הגנה ההקפאה. למחוק את רוב supernatant, להבטיח כי מספיק נוזל נשאר כך הגלולה לא להתייבש. להעביר את הגלולה הסלולרית. לכלי הקפאת הלחץ הגבוה</li>
</ol>3. הקפאה בלחץ גבוה
<ol><li>ממלאים את מאגר המקפיא בלחץ גבוה עם חנקן נוזלי (LN2) ולהתחיל את המשאבה כדי למלא את חדר המדגם עם LN2. התראה: השתמש בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי בעת עבודה עם חנקן נוזלי. הערה: צעדים אלה ספציפיים למקפיא EMPACT2 לחץ גבוה לייקה.</li>
	<li>הפתיל הרחק כל נוזל שנותר מתוך הגלולה התא באמצעות הפינה של ניגוב מעבדה או מגבת נייר. מספיק נוזל צריך להישאר כי הגלולה יוצרת הדבקה דומה בעקביות למשחת שיניים. זה צריך להיות דק מספיק כדי להיות. מואבקים לתוך התשר של 20 ליטר</li>
	<li>מנושף 2 – 3 μL של הגלולה תא ולהפקיד אותו על נושאת קרום. מלא את הבאר של נושאת הקרום לחלוטין, כך שהמתח של פני השטח יוצר כיפה קטנה למעלה, אך הנוזל אינו נשפך מתוך הבאר. אין לקיים בועות אוויר.</li>
	<li>החלק את מנשא הקרום לתוך המחסנית ואבטח. הצב את המחסנית במחשב HPF שהיה מוכן ומוכן ולחץ על התחל כדי להקפיא.</li>
	<li>בדוק את הטמפרטורה לעומת הזמן והלחץ לעומת גרפים זמן כדי לוודא כי הלחץ הגיע ל2100 בר והטמפרטורה הגיע-196 ° צ' בתוך 200 ms, ושני הפרמטרים נשארו יציבים עבור היקף 600 ms.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.3 עד 3.5 עד שנעשה שימוש בגלולה הסלולרית או שהמספר הרצוי של הדגימות הוקפא.</li>
	<li>שמירה על מחסניות שקוע ב-LN2, להסיר כל נושאת ממברנה ממיכל הדיו שלה, מקום לתוך קפסולה פלסטיק, ולמקם את קפסולת פלסטיק לתוך בקבוקון המקפיא מלא של LN2. הערה: ייתכן שהפרוטוקול מושהה כאן. מבחנות ההקפאה עם דגימות ניתן לאחסן ב-LN2 דיואר במקלות ההקפאה או בקופסאות ההקפאה.</li>
</ol>4. הקפאת ההחלפה
התראה: השתמש בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי בעת עבודה עם חנקן נוזלי. בנוסף, רבים של כימיקלים מנוצל בשלב 4 רעילים, כולל חומצה טאנית, אוסמיום tetroxide, ו uranyl אצטט. הכימיקלים הללו חייבים להיות מטופלים על פי נוהלי בטיחות נאותים ולהיפטר מפסולת כימית מסוכנת.
<ol><li>מלא את יחידת החלפת ההקפאה האוטומטית עם LN2. העלה את הטמפרטורה ל-90 ° c.</li>
	<li>הכן את מיקס האלף והתחל ב-FS.<ol>
<li>בשכונה כימית, להכין פתרון של 0.2% חומצה טאנית (w/v) ו 5% די מים ב אצטון ו-1 mL לכל מדגם לתוך מבחנות ההקפאה. . מקום לחדרהשני כדי להקפיא</li>
		<li>מניחים את ה-FS Mix מבחנות 1 ומבחנות ההקפאה המכילות את כדורי התא הקפוא לחדר המדגם של יחידת FS. העבר את הקפסולה הפנימית המכילה את נושאת הקרום מבקבוקון LN2 לתוך הבקבוקון המתאים המכיל את FS Mix 1.</li>
		<li>התחל פרוטוקול FS עם הצעד הראשון שלו להיות 24 h ב-90 ° c. לאחר 24 h, להשהות את ה-FS, ולשטוף את דגימות 3x עבור 5 דקות עם אצטון כי כבר מקורר-90 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת מיקס FS 2 ו-FS שלם התראה: Osmium tetroxide הוא כימיקל רעיל ומחמצן מאוד כי צריך רק להיות מטופלים על ידי אנשים מאומנים על פי פרוטוקולי בטיחות הוקמה. יש לעקוב אחר הפרוטוקולים לאחסון ולסילוק הפתרונות המכילים אוסמיום, כמו גם לתיוג אזורי מעבדה שבהם אוסמיום tetroxide נמצא בשימוש. Tetroxide osmium צריך להיות מטופל בשכונה כימית עם ציוד הגנה אישית כולל הגנה על העין, מעיל מעבדה מתן הגנה מלאה בזרוע, כפפות ניטריל כפול, ו מסכת ההנשמה אופציונלי.<ol>
<li>בשכונה כימית, להכין פתרון של 1% אוסמיום tetroxide, 0.2% uranyl אצטט, ו 5% די מים ב אצטון. הפחתה 1 מ ל לכל מדגם לתוך מבחנות ההקפאה ומקום ב-LN2 להקפיא. הערה: פתרונות מניות של חומצה טאנית (10% w/v ב אצטון), אוסמיום tetroxide (10% w/v ב אצטון) ו uranyl אצטט (8% w/v ב מתנול) עשוי להיות מוכן ומאוחסן במבחנות in2 דיואר עבור קלות ההכנה של ה-FS Mixes.</li>
		<li>הניחו את מבחנות ההקפאה עם FS Mix 2 ליחידת ה-FS והעבירו את הקפסולות מתוך השטיפה השלישית של אצטון לתוך מבחנות ה-FS Mix 2. מודטה ב-FS Mix 2 עבור 72 h ב-90 ° c, ואחריו התחממות הדרגתית ל -0 ° c מעל 12-18 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שמרו על טמפרטורה של 0 ° צ' ושטפו את 3x במשך 30 דקות עם אצטון מקורר מבקבוק שנפתח טרי.</li>
</ol>5. שרף הסתננות והטבעה
התראה: השרף המשמש כאן (ראה שולחן החומרים) רעיל לפני הפילמור, ויש לטפל בו בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי. יש להיפטר משרף שאינו מסוכן. כפסולת כימית מסוכנת
<ol><li>לחדור את הדגימות עם ריכוזים גוברת של שרף מומס של אצטון מבקבוק חדש נפתח. הכינו תערובת של מרכיבי שרף A, B, ו-D בגביע פלסטיק על פי כיווני היצרן, ודגימות דגירה בריכוזים הבאים שרף: 2%, 4%, ו 8% עבור 2 h כל אחד ב 0 ° c. מודטה ב 15%, 30%, 60%, 90%, ו 100% שרף עבור 4 h כל אחד בטמפרטורת החדר. מודטה עבור 4 שעות בתערובת של רכיבים A, B, C ו-D.</li>
	<li>מניחים את נושאות הקרום עם כדורית התא בצד לתוך תבניות הטבעה שטוח למלא עם שרף (A, B, C, D). תוויות נייר עבור הדגימות ניתן להוסיף לבארות בשלב זה.</li>
	<li>פולימל בתנור ב 60 ° c עבור 24-36 h. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר הפילמור.</li>
	<li>להסיר את גושי מהעובש ולתת מגניב. כדי להסיר את נושאת הקרום, במקום הראשון את המדגם את הצ האנכי של ultramicrotome שבו הוא יכול להיות מדמיין עם הגדלה. הפרד את נושאת הקרום מהבלוק על ידי שילוב של חנקן נוזלי על נושאת הקרום כדי להפריד את המתכת מן הפלסטיק, ושימוש להב גילוח כדי לשבב את שרף סביב נושאת הקרום. כאשר מופרדים, להסיר בעדינות את נושאת הקרום משאיר את כיפת הגלולה תא על פני הבלוק.</li>
	<li>מניחים את הבלוק עם הגלולה התא חשוף פונה כלפי מעלה בתבנית הטבעה שטוחה כי הוא מעט עמוק יותר העובש הראשון, ומילוי עם שרף. פולימל בגובה 60 ° צלזיוס בשביל 24 עד 36 שעות. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר הפילמור.</li>
</ol>6. המשך המכירה
<ol><li>חתוך את הבלוק סביב הגלולה התא באמצעות להב תער. ואז למקם את הבלוק במדגם צ'אק על הזרוע החוסמת של אולטרה מיקרוטום. באמצעות סכין זכוכית או יהלום, לחתוך את הבלוק לתוך הצורה טרפז מקרוב מסביב הגלולה התא.</li>
	<li>לקבל 90 ננומטר בעלי מקטעים של הגלולה תא באמצעות זכוכית או יהלום סכין.</li>
	<li>לאסוף רצועת הכלים של מקטעים על רשת TEM. Formvar-מצופה רשתות חריצי נחושת (1 x 2 מ"מ2 חריץ) שימושיים עבור מקטעים טוריים הדמיה. יבש את הרשת על ידי לחסום את הקצה על פיסת נייר סינון, ולאחסן בתיבת אחסון רשת TEM. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר הפרייתם.</li>
</ol>7. TEM הדמיה
<ol><li>הר את הרשת על המחזיק TEM ומקום לתוך המיקרוסקופ. אנו משתמשים באופן קבוע Tecnai T12 ב 80 kV לסינון דגימות קריואיפקס. לרכוש תמונות של תאים מבנים תת תאיים של עניין עם תיוג APEX2.</li>
	<li>אם רצונך בכך, השג ניגוד ממברנה נוסף על-ידי שימוש בהכתמים לאחר הפניה. ראו איור 2 להשוואת דגימות שאינן מוכתמות לאחר מכן (איור 2I-K) ודגימות לאחר הכתמים המובילים (איור 2א – ח).<ol>
<li>צפה רשתות יבשות מקטע-בצד למטה על טיפה של תמיסת נתרן כלוריד מדלל (~ 1.5 mM), 2x עבור 1 דקות כל אחד, ואז 1x עבור 10 דקות.</li>
		<li>הצפת רשתות על טיפת הפתרון המוביל של סאטו עבור 1 דקות. לשטוף על ידי צף על תמיסת נתרן כלוריד 3x עבור 1 דקות, לאחר מכן על המים די 3x עבור 1 דקות. כתמי נוזלים עודפים מרשתות ולאחסן בתיבת רשת. התראה: עופרת היא כימיה רעילה ויש לטפל בה בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי. יש להיפטר מפתרונות המכילים עופרת כפסולת כימית מסוכנת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגימות תמונה שלאחר הכתמים על TEM. הערה: בהכנה לדוגמה המסורתית עבור TEM, השלב המוביל מנוגדים מבוצע לפני הדמיה TEM. עם זאת, מומלץ כי עבור דגימות קריואיפקס, הדמיה מבוצעת תחילה על דגימות שאינן בניגוד. זה מבטיח כי האות מן התג ניתן למקם בקלות על ידי הניגוד החזק שלו עם מבנים סלולריים יותר מוכתם קלות. עבור דגימות רבות, לא יידרש כתמים נוספים; עם זאת, אם הניגודיות הנוספת של הממברנה רצויה, ניתן לבצע כתמים מובילים (Step 7.2) ולדגום את התמונה מחדש.</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

פרוטוקול קריואיפקס המוצג כאן מספק שיטה איתנה לאפיון הלוקליזציה של חלבונים ממברנות בתוך הסביבה התאית. לא רק שימוש של תג APEX2 מקודד גנטית לספק לוקליזציה מדויק של חלבון של עניין, אבל השימוש קריוקיבעון בטמפרטורות נמוכות מספק שימור מעולה וכתמים של מבנה האולטרה הסלולרי המקיף. בשילוב, גישות אלה הן כלי רב עוצמה לוקליזציה של חלבון בעל דיוק גבוה בתוך הקשר התת-תאי שלו.
עיקר ההתקדמות של שיטה זו היא העובדה אובדן ultrastructure בנה מנוסה לאחר ההכנה על ידי שיטות TEM מסורתיות מגיע בעיקר משלב התייבשות ולא בשל...

מחקרים ביולוגיים כוללים לעתים קרובות שאלות לפתרון לוקליזציה של חלבון תת-תאי בתוך תאים ואורגלים. מיקרוסקופ immunofluorescence מספק תצוגה שימושית ברזולוציה נמוכה של לוקליזציה חלבון, וההתקדמות האחרונה בהדמיה סופר ברזולוציה דוחפים את גבולות הרזולוציה עבור מתויג פלואורוסקופים חלבונים1,2,3. עם זאת, מיקרוסקופ אלקטרוני (EM) נשאר תקן זהב עבור דימות ברזולוציה גבוהה הסלולר מבנה הנייד, למרות תיוג של חלבונים הוא אתגר.
מבחינה היסטורית, מספר שיטות EM שימשו לגישה לשאלות של לוקליזציה של חלבון ultraקונסטרוקטיבי. אחת השיטות הנפוצות ביותר היא מיקרוסקופ חיסוני (IEM), כאשר נוגדנים ספציפיים אנטיגן משמשים כדי לזהות את חלבון הריבית. האות EM מופק על ידי יישום של נוגדנים משני מצועם חלקיקי אלקטרון-צפוף, בדרך כלל הזהב4,5. לחילופין, יש להשתמש בנוגדנים עם אנזימים כגון הסוס צנון peroxidase (hrp) יכול לשמש כדי לייצר מזרז אלקטרון צפוף6,7,8. שתי גישות עיקריות קיימות עבור IEM, כינה הטבעה מראש ושלאחר הטבעה של תוויות. ב-הטבעה מראש של IEM, נוגדנים מוצגים ישירות לתוך תאים, אשר מחייבת קיבוע אור וחדירות של התאים9,10,11. שני השלבים עלולים לגרוםנזק. למבנההאולטרסאונד 12,13 פיתוח של נוגדנים קטנים באופן משמעותי המורכב של נוגדן קטע Fab מצועעם 1.4 ננומטר ננוגולד מאפשר התנאים החדירות עדין מאוד לשמש; עם זאת, ננוגולד קטן מדי להדמיה ישירה תחת TEM ומחייב שלבי שיפור נוספים להפוך לגלויים14,15,16. ב-IEM שלאחר ההטבעה, נוגדנים מוחלים על חלקים דקים של תאים אשר עובדו באופן מלא על ידי קיבוע, התייבשות, והטבעה שרף17. בעוד שגישה זו נמנעת משלב החדירות, שמירה על אפירופה של ריבית לאורך ההכנה לדוגמא היא אתגר של18,19,20. שיטת טויאסו של קיבוע האור ולאחריה הקפאה, הקפאת ההקפאה וזיהוי הנוגדן מספקים שימור אפיפי משופר של21,22. עם זאת, הדרישות הטכניות של כריתת המיקרו-בדיקת ההקפאה, כמו גם הניגודיות התת-אופטימלית שהושגה בתא, הן חסרונות23.
השימוש בתגים מקודדים גנטית מבטל רבים של הקשיים של IEM הקשורים לזיהוי של חלבון הריבית. מגוון של תגים זמינים, כולל hrp, ferritin, reash, minisog, ו מטטידור24,25,26,27,28,29,30,31,32. לכל אחד מהם יש יתרונות על פני שיטות קודמות, אך לכל אחד מהם יש חסרונות המונעים שימוש נרחב. החסרונות הללו נע בין חוסר פעילות של HRP ב ציטוסול לגודל גדול של תג ferritin, רגישות קלה של ReAsH, וגודל קטן וחוסר תאימות עם כתמים סלולריים של מטטימיום. לאחרונה, חלבון נגזר ascorbate peroxidase כבר מהונדסים כמו תג EM, בשם APEX233,34. כמו peroxidase, APEX2 יכול לזרז את החמצון של 3, 3 ' diaminobenzidine (בתוך), הפקת מזרז כי מגיב עם אוסמיום tetroxide כדי לספק ניגודיות EM המקומי עם דיפוזיה מינימלית מן החלבון של עניין (פחות מ 25 ננומטר)33,35. שלא כמו שיטות מבוססות HRP מסורתיות, APEX2 הוא יציב מאוד ונשאר פעיל בכל התאים הסלולריים33. דגימות ניתן לעבד עבור TEM באמצעות כתמים מסורתיים לדוגמה EM ושיטות המאפשרות ויזואליזציה טובה של המבנים שמסביב33,34,36. בשל גודלו הקטן, יציבותו, ו רב-תכליתיות, APEX2 התפתחה כתגית EM עם פוטנציאל גדול.
רבים מהגישות שנדונו לעיל אינן יכולות להיות או עדיין לא בשילוב עם המצב הנוכחי של האמנות בשימור בדיקת אולטרה מבנית, קריוקטיביות והקפאה בטמפרטורות נמוכות. כך, הם סובלים מחוסר שימור ממברנה ו/או כתמים תא כדי לקבוע לוקליזציה חלבון מדויק. הדבר מגביל בהכרח את הרזולוציה והפרשנות של הנתונים שניתן להשיג. קריוקיבעון על ידי הקפאת לחץ גבוה (hpf) כרוכה הקפאה מהירה של דגימות בחנקן נוזלי בלחץ גבוה (~ 2,100 bar), הגורם ויטריפיקציה ולא התגבשות של דגימות מימית, ובכך שמירה על תאים במצב קרוב-יליד37,38,39. Hpf אחריו הקפאת החלפת (FS), טמפרטורה נמוכה (-90 ° c) התייבשות אצטון בשילוב עם דגירה עם כתמי EM אופייני כגון אוסמיום tetroxide ו uranyl אצטט. HPF ו-FS יחד לספק יתרון ברור על גבי קיבעון כימי מסורתי (תהליך ארוך יותר אשר יכול להוביל חפצי אמנות) התייבשות אלכוהול בטמפרטורת החדר או על קרח (אשר יכול להוביל להפקת שומנים וסוכרים), ולכן רצוי לשלב עם תגי EM הטוב ביותר עבור זיהוי חלבון.
אחת הסיבות כי HPF/FS לא בשילוב עם תיוג APEX2 היא כי קיבעון כימי קל הוא תנאי מוקדם עבור התגובה peroxidase, הגבלת הדיפוזיה של המוצר התגובה מחיר. במחקרים APEX2 עד כה, קיבעון והתגובה peroxidase הם ואחריו שיטות EM מסורתיות לצביעת ואלכוהול התייבשות33,36. עם זאת, זה הוכח כי בעקבות קיבעון כימי עם HPF/FS מספק יתרון ברור בשימור על קיבעון כימי מסורתי התייבשות אלכוהול לבד40. הפסד של שלמות ultraקונסטרוקטיבית לראות בדוגמאות TEM מסורתיות נראה פחות מחובר קיבעון מאשר התייבשות, אשר נעשה בדרך כלל באמצעות אלכוהול בטמפרטורת החדר או על קרח, והוא יכול להוביל להפקת שומנים וסוכרים40,41. כדי לפתח את שיטת קריואיפקס, שיערו כי הקיבעון הכימי ואת התגובה peroxidase, ואחריו HPF ו-FS, היה לייצר תוצאה אופטימלית מבחינת שימור ultraקונסטרוקטיבי.
כאן אנו מציגים את פרוטוקול קריואיפקס, המשלב APEX2 תיוג עם קריוקיבוע והקפאת שיטות החלפת (איור 1). פרוטוקול פשוט זה מורכב מגלגול של חלבון APEX2 מתויג של עניין, קיבעון כימי של תאים, ואת התגובה peroxidase. HPF ו-FS מבוצעים לאחר מכן על ידי שתילת שרף אופייני והדקים. הדמיה TEM מגלה שימור מעולה של ultrastructure בנה באמצעות שיטה זו. בנוסף, לוקליזציה ברזולוציה גבוהה subcellular והפצה מרחבית של רשתית העין (ER) לומפלמיק חלבון נצפו. שיטה זו שימושית רבות לאיתור לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני. בידינו, השיטה עבדה בהצלחה עבור מגוון של קווי תאים שגדלו בתרבית רקמות, כולל HEK-293T (כליה עובריים האדם), הלה (סרטן צוואר הרחם האנושי), Cos7 (אפריקה ירוק כליות הקוף פיברוהפיצוץ), ו BHK (כליה אוגר התינוק). הוראות מפורטות מתוארות להלן באמצעות התאים HEK-293T.

<table><tbody><tr><td>3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637-1G</td><td></td></tr><tr><td>אצטון (מזוקק זכוכית)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>כוסות; פלסטיק, חד פעמי 120 סמ"ק</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית</td><td>60952</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני אחסון קריוגניים, 2 מ"ל</td><td>VWR</td><td>82050-168</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, רכיב יחיד A, M שרף אפוקסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44611-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, רכיב יחיד B, מקשה 964</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44612-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, רכיב יחיד C, מאיץ 960 (DY 060)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>44613-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, רכיב יחיד D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44614-100ML</td><td></td></tr><tr><td>תבנית הטבעה, שטוחה סטנדרטית, 14 מ"מ x 5 מ"מ x 6 מ"מ</td><td>מיקרוסקופ אלקטרונים מדעים</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>תבנית הטבעה, שטוחה סטנדרטית, 14 מ"מ x 5 מ"מ x 4 מ"מ</td><td>מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי; Nu-Serum IV תוסף גידול בינוני</td><td>קורנינג</td><td>355104</td><td></td></tr><tr><td>סירות סכין זכוכית, 6.4 מ"מ</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>71008</td><td></td></tr><tr><td>יצרנית סכיני זכוכית</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM KMR3</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 10% תמיסה מימית</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293 תאים</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>מקפיא בלחץ גבוה עם מערכת העברה מהירה</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM PACT2</td><td>ארכיון המוצר הוחלף על ידי Leica EM ICE</td></tr><tr><td>מי חמצן 30% תמיסה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-266-27</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 3000 מגיב טרנספקציה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>ממברנה נושא עבור EM PACT2, 1.5 מ"מ x 0.1 מ"מ</td><td>Mager Scientific</td><td>16707898</td><td></td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד,</td><td>מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים</td> גבישי <td>19110</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS) 20X, קפסולות פלסטיק בדרגה טהורה במיוחד</td><td>VWR</td><td>97062-950</td><td></td></tr><tr><td>עבור AFS/AFS2, 5 מ"מ x 15 מ"מ</td> רשתות חריץ <td>Mager Scientific</td><td>16702738</td><td></td></tr><tr><td>, 2 x 1 מ"מ נחושת עם סרט תמיכה Formvar</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>FF2010-Cu</td><td></td></tr><tr><td>מאגר נתרן קקודילאט, 0.2 מ', pH 7.4</td><td>מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים</td><td>102090-962</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד, גלולה 500 גרם (ACS)</td> <td>Avantor Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טאנית</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות, פוליסטירן, סטרילי, קורנינג, 100 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>רצועות</td> <td>סכין אולטרה זכוכיתמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>אולטרהמיקרוטום</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>אורניל אצטט דיהידראט</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

מפתח אירועים סלולריים כמו התמרה אותות וסחר בקרום להסתמך על מיקום החלבון הנכון בתוך תאים סלולריים. ובכך חשוב לענות על שאלות ביולוגיות רבות באופן מדויק. החיפוש אחר תווית איתנה לזיהוי לוקליזציה של חלבון בשילוב עם שימור הסלולר נאותה וכתמים כבר מאתגרת היסטורית. ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) הובילו לפיתוח שיטות ואסטרטגיות רבות כדי להגביר את שימור הסלולר והתווית היעד חלבונים. Peroxidase חדש יחסית מבוסס על תג גנטי, APEX2, הוא מנהיג מבטיח בתגים EM-אקטיב cloneable. הכנה לדוגמה עבור שידור אלקטרון מיקרוסקופ (TEM) יש גם מתקדם בשנים האחרונות עם הופעתו של קריוקיבעון על ידי הקפאת לחץ גבוה (HPF) ו בטמפרטורות נמוכות התייבשות וכתמים באמצעות הקפאת החלפת (FS). Hpf ו-FS לספק שימור מעולה של מבנה האולטרסאונד הסלולרי עבור הדמיה TEM, השני רק ישיר-הדמיה ההקפאה של דגימות אינדקטור. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור שיטת ה-קריואיפקס, המשלבת את השימוש בתג APEX2 עם HPF ו-FS. בפרוטוקול זה, חלבון של עניין מתויג עם APEX2, ואחריו קיבעון כימי ואת התגובה peroxidase. במקום התייבשות כתמים ואלכוהול בטמפרטורת החדר, המדגם הוא קריוקבוע ועובר התייבשות וכתמים בטמפרטורה נמוכה באמצעות FS. באמצעות קריואיפקס, לא רק יכול להיות חלבון של עניין להיות מזוהה בתוך תאים subcellular, אבל גם מידע נוסף ניתן לפתור ביחס לטופולוגיה שלה בתוך קרום שנשמר מבחינה מבנית. אנו מראים כי שיטה זו יכולה לספק החלטה גבוהה מספיק כדי לפענח דפוסי הפצת חלבונים בתוך אורגל לומן, וכדי להבחין את מידור החלבון בתוך מאורגא אחד בסמיכות לאורגלים אחרים בלתי מסומנים. עוד, קריופיסגה היא תהליכים פשוטה וקלה לתאים גדל בתרבות הרקמה. היא אינה מאתגרת יותר מבחינה טכנית מאשר קריופיציה טיפוסית והקפאת שיטות החלפה. קריואיפקס היא ישימה באופן נרחב ניתוח TEM של כל חלבון ממברנה שניתן לתייג גנטית.

על מנת להשוות את שימור האולטרה-מבנית בשיטת הקריואיפקס עם קיבעון והתייבשות מסורתיים, הכנו דגימות שבהן קרום הרשתית האנדופלזמית (ה-אמ. סי; ממברנה ER) מתויג עם APEX2 ו העביר לתוך התאים HEK-293T. אה-APEX2 לאתר את הפנים cytoplasmic של er ו remodels מבנה er לתוך מבנים ברורים מורפולוגית המכונה מאורגנת חלקה ER (oser)34,42,43. מורפולוגיה של OSER כוללת אזורים של ממברנות חלקים, מקבילים ומוערמים בצפיפות, המשמשים כאזור אופטימלי להשוואת שימור ...

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-קריואיפקס, בה חלבון ממברנה APEX2 מתויג יכול להיות מקומי על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ בתוך מבנה מיטבי משומר התא.

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

שיטה זו משלבת את היכולת להכתים לחלבון קרום תוך שמירה על שלמות הממברנה וארכיטקטורה תת-תאית. אז זה באמת חזק עבור לוקליזציה מדויקת חלבון הקשורים קרום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת את השימוש בתג חזק לשיבוט גנטי, APEX2, עם שיטות מתקדמות בשימור תאי למיקרוסקופ אלקטרונים, כולל קריופיקציה והחלפת הקפאה.יחד, אלה מאפשרים לוקליזציה מדויקת של חלבונים בתוך תא שמור היטב. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לנתח מנגנונים שבהם וירוסים משכפלים בתוך התא המארח. וירוסים לעיתים קרובות יחטפו חלבונים מארחים במהלך ערכת הזיהום שלהם.וירוסים הם הגנומים הקטנים, אשר הם משתמשים כדי לשכפל בתוך תאים מארחים אלה. לאחרונה, הצלחנו בנתונים שלא פורסמו, לתייג חלבונים אלה באמצעות טכנולוגיה זו כדי להבין כיצד וירוסים לשכפל. טכניקה זו הוכיחה באמת קריטי במחקר שיתופי שנערך לאחרונה על רעלן חיידקי שגורם התמוטטות golgi.באמצעות cryoAPEX, הצלחנו לאתר במדויק את הרעלן עם חתיכות גולגי מקוטע, משהו שהיה ממש קשה לראות אחרת באמצעות טכניקות immunofluorescence נורמלי. הדגמת טכניקה זו תהיה איליין Mihelc, סטודנט לתואר שני, ושותף מחקר, סטפני אנג'ל, מהמעבדות שלנו. לאחר זריעת תאי HEK293 בצלחת, להדביק את התאים עם APEX2 מתויג פלסמידים ביטוי יונקים באמצעות רגנט transfection על פי הוראות היצרן.ב 12-15 שעות לאחר transfection, לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם PBS מהצלחת לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 x g במשך חמש דקות.הסירו בזהירות את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור בשני מיליליטר של 2%glutaraldehyde ו-0.1 מאגר נתרן קסודילאט טוחן בטמפרטורת החדר של 7.4 pH. מניחים את הדגימה על קרח כדי דגירה במשך 30 דקות. לאחר מכן, גלולה המדגם ב 500 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לשטוף את גלולה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם שני מיליליטר של 0.1 מאגר נתרן קאודילאט טוחנת על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להסיר את העל-טבעי. כדי לבצע את התגובה peroxidase, לשטוף את גלולה על ידי השעיה מחדש בשלושה מיליליטר של פתרון DAB ואחריו גלולה ב 500 x g במשך חמש דקות.לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולה בשלושה מיליליטר של פתרון DAB עם 5.88 מי חמצן מילימולרית. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. גלולה הופך בצבע חום בעליל, המציין את נוכחותו של מוצר תגובת DAB מסיס.לאחר שטיפה שוב עם חיץ קקודילאט נתרן ב- DMEM, על פי כתב היד, להשעות מחדש את גלולת התא ב 500 microliters של פתרון cryoprotectant של DMEM המכיל 10% סרום חזיר עוברי ו 15% אלבומין סרום bovine. העבר את ההשעיה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מיליליטר. גלולה שוב, מעט להגדיל את מהירות הצנטריפוגה מ 500 x גרם.להשליך את רוב supernatant, להבטיח כי מספיק נוזל נשאר כך גלולה לא להתייבש. פתיל משם כל נוזל שנותר מכדור התא באמצעות הפינה של לנגב מעבדה או מגבת נייר. תן לנוזל מספיק להישאר כי גלולה יוצרת הדבק, דומה בעקביות משחת שיניים.שאף שניים עד שלושה מיקרוליטרים של גלולת התא והפקיד אותו על מנשא קרום. ממלאים את באר נושאת הממברנה לחלוטין, כך שמתח פני השטח יוצר כיפה קלה מלמעלה. החלק את מנשא הממברנה לתוך המחסנית ומאובטח.מקם את המחסנית במחשב HPF שהוכנה והוכנה ולחץ על התחל להקפיא. שמירה על המחסניות שקועות בחנקן נוזלי, הסר את מנשא הממברנה מהמחסנית שלו. מניחים לתוך קפסולת פלסטיק ומ מניחים את קפסולת הפלסטיק לתוך Cryovial מלא חנקן נוזלי.במכסה המנוע הכימי, להכין מיליליטר אחד לכל מדגם של הפתרון של 0.2% משקל לפי נפח חומצה טאנית ו 5% DI מים אצטון ב Cryovial. מניחים אותם לתוך חנקן נוזלי להקפיא. מניחים את תערובת החלפת ההקפאה בקבוקון אחד ואת Cryovials המכיל את כדורי התא הקפוא לתוך תא המדגם יחידות החלפת ההקפאה.מעבירים את הקפסולה הפנימית המכילה את נושא הממברנה מבקבוקון החנקן הנוזלי לתוך הבקבוקון המתאים המכיל תערובת החלפת הקפאה אחת. התחל פרוטוקול החלפת הקפאה ב 90 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, להשהות את החלפת ההקפאה ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים במשך חמש דקות עם אצטון כי כבר מקורר ל 90 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, במכסה המנוע הכימי, הכינו מיליליטר אחד לדגימה של פתרון של 1%osmium tetroxide, 0.2% אורניל אצטט, ו 5% DI מים אצטון ב Cryovial וממקמים אותם בחנקן נוזלי להקפיא. מניחים את Cryovials עם תערובת החלפת ההקפאה שתיים לתוך יחידת החלפת ההקפאה ולהעביר את הכמוסות מן לשטוף אצטון השלישי לתוך תערובת החלפת ההקפאה שני בקבוקונים. דגירה אותם להקפיא תחליפים לערבב שתיים במשך 72 שעות ב 90 מעלות צלזיוס, ואחריו התחממות הדרגתית לאפס מעלות צלזיוס מעל 12-18 שעות.שמור על הטמפרטורה באפס מעלות צלזיוס ולהוסיף אצטון מקורר מראש לתוך הבקבוקונים לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. הכינו תערובת של שף לבחירתכם בסקילר פלסטיק בהתאם להוראות היצרן והוסיפו 2%4% ו-8% מהסרף לבקבוקונים כדי לטבול את הקפסולות. דגירה במשך שעתיים כל אחד באפס מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הדגירה ב-15%30%60%90% ו-100% שף רכיבים של A, B ו-D רק למשך ארבע שעות כל אחת בטמפרטורת החדר. לאחר 20 שעות, להכין תערובת של רכיבי שף A, B, C, ו- D דגירה במשך ארבע שעות. מניחים את נושאות הממברנה עם צד גלולת תא למעלה לתוך תבניות הטבעה שטוחות וממלאים בתערובת שרף A, B, C ו- D.Place אותם בתנור כדי להפוך לפולימריה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 24-36 שעות.לאחר פולמריזציה, להסיר את אבני מן התבנית ולמקום את המדגם ב chuck האנכי של microtome אולטרה שבו ניתן לדמיין עם הגדלה. הפרד את נושא הממברנה מהבלוק על ידי שילוב של חנקן נוזלי על מנשא הממברנה כדי להפריד את המתכת מהפלסטיק, ושימוש בסכין גילוח כדי לסובב את שרף סביב נושאת הממברנה. כאשר מופרדים, בעדינות להרים את נושאת הממברנה, משאיר את כיפת גלולת התא על פני הבלוק.מניחים את הבלוק עם גלולת התא החשוף הפונה כלפי מעלה בתבנית הטבעה שטוחה כי הוא קצת יותר עמוק מאשר התבנית הראשונה ולמלא עם רכיבי שרף A, B, C, ו D.Polymerize ב 60 מעלות צלזיוס במשך 24-36 שעות. חתוך את הבלוק סביב גלולת התא באמצעות סכין גילוח. ואז למקם את הבלוק בדגימה צ'אק על זרוע החיתוך של מיקרוטום אולטרה.בעזרת סכין זכוכית או יהלום, חותכים את הבלוק לצורה טרפז המקיפה מקרוב את גלולת התא. השג 90 ננומטר חלקים דקים במיוחד של גלולת התא באמצעות סכין זכוכית או יהלום. בחר רצועת כלים של מקטעים ברשת TEM.יבש את הרשת על-ידי ניקוי הקצה על פיסת נייר סינון ואחסן אותה בתיבת אחסון של רשת TEM. הר את הרשת על מחזיק TEM והצב את המחזיק במיקרוסקופ. השתמש Tecnai T12 ב 80 קילו-וולט להקרנת דגימות cryoAPEX.רכוש תמונות של תאים ומבנים תת-תאיים בעלי עניין באמצעות תיוג APEX2. במחקר זה, הכנת המדגם בשיטות APEX מסורתיות הביאה לתיוג ברור של מבנים מאורגנים וחלקים של רטיקולום אנדופלסמי. בהגדלה גבוהה, הממברנות המוערמות נראו פרוע ופערים לא אחידים היו קיימים בין צפיפות קרום קונצנטרית, המציין שימור קרום לקוי וחילוץ השומנים.המדגם שהוכן על ידי cryoAPEX היה גם תיוג מוגדר בבירור של מאורגן, חלקה מבנים רטיקולום אנדופלסמי, עם זאת, הממברנות היו חלקות ומקבילות מעט מאוד מיצוי השומנים נראה. ניתוח TEM של 90 ננומטר חלקים דקים גילה כי שמרי הנטינגטון אינטראקציה חלבון E היה נוכח ברחבי רקמולום אנדופלזמי היקפי, כמו גם את המעטפה הגרעינית. בנוסף, שמרי הנטינגטון אינטראקציה חלבון E צפיפות נפתרה לתוך מוקדים במים קבועים לאורך קרום הרטיקולום האנטופלסמי luminal.שמרי הנטינגטון אינטראקציה חלבון E הפצה ו foci נראו גם מדגם מוכן עם קיבעון מסורתי והתייבשות. עם זאת, שיבוש קרום נרחב וחילוץ היו נוכחים, מה שהופך את המדגם תת אופטימלי. תיוג APEX2 בוצע באמצעות שלושה סמנים תאיים, מהם Mito-V5-APEX2 סיפק כתמים ספציפיים של המיטוכונדריה בלבד ו- CAAX-APEX2 הפיק כתמים ברורים של קרום הפלזמה בלבד.שום תיוג לא נצפה באברונים תאיים. הכתמים עבור לומן golgi הוערך גם באמצעות סמן אלפא MAN2-APEX2 כמתואר בכתב היד המקורי שלנו Sengupta ואח '. בעקבות הליך זה, שיטות תלת מימדיות כגון טומוגרפיה אלקטרונים או מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת קרן יון ממוקדת עשויות להתבצע על מנת לחקור את התפלגות התלת מימד של חלבון מעניין.רבים מהכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה הם רעילים, ולכן לפני השימוש, יש להתייעץ עם גיליונות נתוני בטיחות כדי להבטיח כי הכימיקלים מטופלים באמצעות ציוד מגן אישי תקין ונפטרים בהתאם להנחיות המוסדיות.

the-cryoapex-method-for-electron-microscopy-analysis-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Schönherr, S., et. al. תיוג אימונולוגי משולב של העתק אופטוגנטי ושבר הקפאה כדי לבחון סידור ספציפי לקלט של קולטני גלוטמט באמיגדלה של העכבר. J. Vis. exp. (2016)סרטון זה מדגים את התיוג החיסוני של העתקים שבורים בהקפאה של רקמת מוח עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים. ההעתקים השבורים והמצופים מתעכלים כדי לחשוף קולטנים. נוגדנים משניים ראשוניים ובעלי תווית זהב מתווספים כדי לסמן קולטנים ספציפיים של ממברנה עצבית. ההעתק מותקן על רשת ומוצג תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

תיוג חיסוני של חלבוני ממברנה עצבית בדגימה שסועה בהקפאה של רקמת מוח של עכבר

כדי לשמר את התהליכים עצביים לניתוח ultrastructural, אנו מתארים פרוטוקול לציפוי של נוירונים העיקרי ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבזק הקפאה, מניב דגימות טהורים בשכבה של קרח זגוגי. ניתן לבחון דגימות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-לדמיין מבנים בקנה המידה ננומטרי.

הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

כאן אנו מתארים הליך לחקר רקמות צמחים שבורות בהקפאה. דגימות עלים קפואות בלחץ גבוה שבורות בהקפאה ומצופות בשכבה כפולה, ומניבות דגימות קפואות-לחות שמורות היטב המצולמות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בהגדלות גבוהות עם נזק מינימלי לאלומה.

לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

כתב יד זה מתאר שיטה קלה לשימוש בעלות הנמוכה cryofixation המאפשרת הדמית תאי השעיה ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים.

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

כאן, אנו מספקים קלה, בעלות נמוכה, וזמן חסכוני פרוטוקול לתקן כימי רקמת מוח הפרימטים עם מקבע אקרולאין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואמת טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה עבור במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

פתחנו שיטה חדשנית במיקרוסקופ אלקטרונים, "פלאש-ו-הקפאה," המאפשרת ויזואליזציה של דינמיקה הממברנה עם רזולוצית ms זמנית. טכניקה זו משלבת את גירוי optogenetic של נוירונים עם מקפיא בלחץ גבוה. הנה, אנחנו מדגימים את הנהלים לתאר את הפרוטוקולים בפירוט.

פלאש-ו-Freeze: שיטה חדשנית לכידה Dynamics ממברנה עם מיקרוסקופית אלקטרונים

שיטה correlative מיקרוסקופ אלקטרונים אור (קלם) מוחל על התמונה הנוצרות על-ידי וירוס תאיים מבנים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) בתאים שנבחרו קודם לכן על ידי מיקרוסקופ אור (LM). באימות LM ו- EM משולבים כמו בגישה הדמיה היברידי להשיג תצלום המשולב של וירוס-פונדקאי אינטראקציות.

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

מוצג כאן פרוטוקול לתיוג חלבוני קרום בתאים יונקים וציפוי המדגם עם גרפן למיקרוסקופ אלקטרונים שידור סריקה שלב נוזלי. היציבות של הדגימות נגד הנזק שנגרם על ידי קרינה יכול גם נחקר עם פרוטוקול זה.

מארז גרפן של תאי יונקים קבועים כימית עבור מיקרוסקופאלקטרונים בשלב נוזלי

פרוטוקול זה מדגים כיצד לדמיין דגימות ביולוגיות שנשמרו על ידי קריו באמצעות מיקרוסקופיית תאורה מובנית קריו. אנו מדגימים את המתודולוגיה על ידי הדמיית הציטוסקלטון של תאי U2OS.

איסוף נתונים מיקרוסקופי תאורה מובנה קריו מתאים שהשתמרו בהקפאה

מטרת פרוטוקול זה היא לכוון הידבקות תאים וצמיחה לאזורים ממוקדים של רשתות למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. זה מושג על ידי החלת שכבה נגד עכירות כי הוא ablated בדפוסים שצוינו על ידי המשתמש ואחריו תצהיר של חלבוני מטריצה חוץ תאית באזורים בדוגמת לפני זריעת התא.

רשתות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של שידור מיקרו-מפזרנינג למיקום תאים ישירים בתהליכי עבודה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים

זרימת עבודה זו מאפשרת ייצור למלה המכוון למבנים ביולוגיים בעלי תווית פלואורסצנטית שהם קטנים (&lt;1 מיקרומטר בהיקף צירי) ונדירים (עותק אחד לתא) באמצעות פלטפורמת הדמיה תלת-צירית קריוגנית. פלטפורמה זו משלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כרסום קרן יונים ממוקדת ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק במיקום מוקד יחיד ומאפשרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בו זמנית בזמן הכרסום.

זרימת עבודה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אלקטרונים וקרן יונים קריוגני לכרסום ממוקד של תאים

למד את שיטת ה-cryoAPEX ללוקליזציה מדויקת של חלבוני ממברנה בתאי HEK293 תוך שימור מבנה תאי. טכניקה זו חיונית לחקר מנגנוני שכפול ויראלי ואינטראקציות חלבונים בתאים.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

גלה סרטונים נוספים