קוונפיקציה של פלמיד בתיווך עמידות לאנטיביוטיקה בגישת אבולוציה ניסויית

פלסמידים הם אלמנטים טרום-כרומוזומליים הנפוצים בכל מקום ברוב מיני החיידקים ובתי הגידול שבהם הם סוכנים חשובים מאוד להעברת גנים אודם, היכן שהם יכולים לנדוד בין תאים ובין אוכלוסיות. אחת הדוגמאות הבולטות והבלטות ביותר להעברה כזו היא הפצת גנים עמידים לאנטיביוטיקה המקודדים על פלסמידים. כדי לבנות פלסמיד מודל המקודד גן עמידות לאנטיביוטיקה, בחר עמוד שדרה פלסמיד PCR להגביר את עמוד השדרה באמצעות פולימראז נאמנות גבוהה פריימרים לאגד על התבנית פלסמיד. במקרה שלנו השתמשנו עמוד שדרה pBBR1 פלסמיד. לאחר מכן, להגביר את הגן ההתנגדות nptII כולל מקדם Tn5 יליד באמצעות פולימראז נאמנות גבוהה. תכנן את פריימרים עבור גן ההתנגדות עם כ 20 זוגות בסיס של משלימים רצף אל עמוד השדרה פלסמיד. לאחר PCRs, להתיך את האזור homology של מוצר PCR גן התנגדות מטוהרים אל עמוד השדרה פלסמיד מטוהר באמצעות הרכבה איזותרמית ב 50 מעלות במשך 60 דקות. הפוך את המוצר מותך לתוך E.Coli DH5-אלפא באמצעות אלקטרופולציה. צלחת 100 microliter של התערובת על מדיה סלקטיבית דגירה ב 37 מעלות במשך כ 24 שעות. לאחר מכן ניתן לחלץ את הפלסמיד, לאמת אותו ולהפוך אותו לזן מסוג פראי מסוג E.coli MG1655. זה מניב זן MG1655 pCON.במהלך חשיפה לאנטיביוטיקה, חיידקים צריכים את הפלסמיד כדי לשרוד. לכן, הפלסמיד נמצא תחת בחירה חיובית. בתנאים לא סלקטיביים, כך שבלי אנטיביוטיקה, הפלסמיד חד פעמי לתא. מטרת המחקר שלנו הייתה לעקוב אחר הפלסמידים בתנאים לא סלקטיביים כאלה לאורך זמן. לשם כך, ציידנו את הפלסמידים הקטנים בגן עמידות לאנטיביוטיקה והכרנו אותו לאשריצ'יה קולי. ערכנו ניסוי אבולוציוני ועקבנו אחר תדירות הפלסמידים באמצעות ציפוי העתק. פלסמיד נושאת זן mg1655 pCON הוא הציג כעת לניסוי אבולוציה. ראשית, צלחת mg1655 pCON על צלחות אגר LB בתוספת אנטיביוטיקה דגירה לילה ב 37 מעלות. מצלחת זו לבחור באופן אקראי את 8 מושבות אבות קדמונים דגירה לילה ב 37 מעלות עם רעידות קבועות. למחרת מועברות האוכלוסיות לניסוי המתבצע ב-96 צלחות בארות עמוקות. חשוב מאוד להפיץ באופן אקראי את השכפולים על פני הלוח. לדוגמה, בגישה של לוח שחמט. בניסוי שלנו התרבויות מדוללות ומועברות עם שיעורי דילול שונים בשתי טמפרטורות. במהלך כל אירוע העברה הטיפול בדילול מוחל וההעברה הסדרתית חוזרת על עצמה על פני 98 העברות בסך הכל. לאורך ניסוי האבולוציה, תדירות הפלסמידים באוכלוסייה מוערכת ביחס לתאי נשיאת הפלסמיד. ציפוי העתק היה פופולרי על ידי אסתר ויהושע לדרברג בשנות החמישים שבו הם השתמשו בו כדי לחקור עמידות לתרופות בחיידקים. השיטה תאפשר להם לשנות את קנה מידה הסריקה שלהם עבור פנוטיפים ובסוף המחקר גילה כי עמידות בפניצילין יכול להתעורר בחיידקים עקב מוטציות ספונטניות בגנום. כדי לקבוע את תדירות הפלסמיד באוכלוסייה במהלך הניסוי, תרבויות נייחות מדוללות באופן סדרתי ומצוותות על לוחות אגר LB לא סלקטיביים. התאימו את הדילול לפי תפוקה של 250 עד 500 מושבות לצלחת. האוכלוסיות המ מצופות הם דגירה לצמיחה לילה ב 37 מעלות במשך פחות מ 24 שעות. מומלץ לשכפל מושבות כשהן עדיין קטנות. לאחר צמיחה בן לילה לספור את כל המושבות באמצעות מונה מושבה אוטומטי של הבחירה של הקורא. זה מניב את גודל אוכלוסיית החיידקים הכוללת בתרבויות. שים לב כי מושבות בקצה הצלחת יש להשאיר בחוץ. כדי לשכפל את הצלחות, אתה צריך צלחות אגר סלקטיבי בתוספת אנטיביוטיקה, בלוק עגול, טבעת מתכת שמתאימה לבלוק, ובד קטיפה סטרילי. הבד צריך להיות 100% כותנה כמו זה יכול להיות מעקר על ידי autoclavation. מניחים את הבד על הבלוק ולתקן אותו עם טבעת המתכת.מניחים בזהירות את הצלחת עם המושבות שנספרו על משטח בד הקטיפה הקבוע. הקש על הצלחת בתנועות מעגליות כך שכל משטח הצלחת ייגע במטלית. חשוב מאוד שכל המושבות ייגעו בקטיפה. הסר את צלחת LB ולה מניחים את הצלחת הסלקטיבית על הקטיפה. חזור על ההקשה הקפדה. חשוב שוב כי הצלחת נוגעת בקטיפה לחלוטין. לאחר מכן, להסיר את הצלחת הסלקטיבית. הצלחות דגירה בטמפרטורת החדר לילה. למחרת, הן LB ואת צלחת אנטיביוטיקה נדרשים להערכה. מניחים את הצלחות אחד מעל השני ולהשוות את הצמיחה. אתה יכול בקלות לזהות חללים ללא מושבה. אלה המושבות שלא עמידות לאנטיביוטיקה. לכן, מושבות אלה איבדו את הפלסמיד. בסופו של דבר, סמן כמה מושבות חסרות על צלחת האנטיביוטיקה. המספר הזה נותן לך את האובדן הפלסמידי. חזור על ציפוי העתק של כל האוכלוסיות במהלך ניסוי האבולוציה מדי שבוע. אובדן פלסמיד יכול להיגרם על ידי פלסמיד רב מום. כאשר עובדים על בנייה פלסמיד לומר על הביטוי של גן נתון בזן המארח המועדף עליך ההתנהגות הטבעית של פלסמיד ב vivo לגבי האישור מדינה יכולה לקחת הוא בדרך כלל משהו כי הוא התעלם. ויתר להקשר אבולוציוני, אישור כזה לשינויים עשוי להיות בעל חשיבות רבה. הניתוח של אישורי פלסמיד יכול להיות מאמץ מסובך מאוד. במיוחד multimers פלסמיד קשה לנתח כי הם לא יכולים להיות מזוהים כראוי על ידי PCR או על ידי רצף. בצד השני, מולטימרים פלסמיד קשה לנתח על ידי אלקטרופורזה ג'ל בגלל גודלם הגדול פוטנציאלי הניידות האלקטרופורטית האיטית שלהם. הפרוטוקול שלנו מציע שיטה פשוטה וישירה להקרנה וזיהוי של מולטימרים פלסמיד ב הייתי אומר כל הכנה פלסמיד נתון. כדי מולקולות פלסמיד חזותי לחלץ את הפלסמיד מ 5 mL נייח תרבות תאים לילה באמצעות תמיסת אלקליין. מיצוי פלסמיד של פלסמידים עותק נמוך מוביל לעתים קרובות לזיהום עם DNA כרומוזומלי מארח כי צריך להיות מתעכל לפני הדמיה. כדי להסיר זיהום DNA כרומוזומלי לטפל DNA פלסמיד שחולצו עם פלסמיד בטוח