Name: Agrobacterium-תיווך המעבר העובר בלתי בוגר של הסרבן מתוך תירס שורות באמצעות גנים מורפולגניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למד את שיטת QuickCorn להעברת גנים בתירס באמצעות Agrobacterium וגנים מורפולגניים BABY BOOM ו-WUSCHEL. שיטה זו מייעלת את השתלת העוברים הבלתי בוגרים ומסירה את שלב האינדוקציה של הקלוס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לצוות החממה של קורטבע לאספקת תירס בלתי מפותח, מעבדת ההכנה של המדיה של קורטבע למתן סיוע ביצירת מדיה, נינג וואנג מקורטבע לעזרה עם בניית Agrobacterium , ו-Keunsub לי מאוניברסיטת איווה סטייט לקבלת סיוע. פרויקט זה היה נתמך באופן חלקי על ידי הלאומית המדע הגנום צמח מחקר תוכנית גרנט 1725122 ו 1917138 K.W., על ידי צמח חזוי Phenomics המחקר traineeship תוכנית (לאומי המדע הקרן גרנט DGE-1545453) כדי J.Z., על ידי משרד החקלאות nifa לבקוע הפרויקט #IOW04341, על ידי מדינת איווה קרנות, ועל ידי מרכז ביוהנד

<ol><li>Zhao, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+genetic+transformation+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize.</a> Molecular Breeding. 8 (4), 323-333 (2002).</li>
<li>Green, C. E., Phillips, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+regeneration+from+tissue+cultures+of+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Science%22%5BJournal%5D)">Plant regeneration from tissue cultures of maize.</a> Crop Science. 15 (3), 417-421 (1975).</li>
<li>Ji, Q., Xu, X., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+major+cereal+crops%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of major cereal crops.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 495-508 (2013).</li>
<li>Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang, K. Maize (Zea mays, L). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrame%2C+B+%22Agrobacterium+Protocols%22">Agrobacterium Protocols</a>. Wang, K. , 3rd edition, Springer, USA. 101-117 (2015).</li>
<li>Frame, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Agrobacterium-mediated+transformation+of+three+maize+inbred+lines+using+MS+salts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts.</a> Plant Cell Reports. 25 (1), 1024-1034 (2006).</li>
<li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (379), (2014).</li>
<li>Lowe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenic+regulators+Baby+boom+and+Wuschel+improve+monocot+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation.</a> The Plant Cell. 28 (9), 1998-2015 (2016).</li>
<li>Lowe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+genotypes+independent+maize+transformation+via+direct+somatic+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">Rapid genotypes independent maize transformation via direct somatic embryogenesis.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 54 (3), 240-252 (2018).</li>
<li>Boutilier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+BABY+BOOM+triggers+a+conversion+from+vegetative+to+embryonic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth.</a> The Plant Cell. 14 (8), 1737-1749 (2002).</li>
<li>Zuo, J., Niu, Q. W., Frugis, G., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WUSCHEL+gene+promotes+vegetative-to-embryonic+transition+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 30 (3), 349-359 (2002).</li>
<li>Jones, T. J., et al. Maize transformation using the morphogenic genes Baby Boom and Wuschel2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+TJ+%22Transgenic+Plants%22">Transgenic Plants</a>. Kumar, S., Barone, P., Smith, M. , 81-93 (2019).</li>
<li>Anand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+ternary+vector+system+for+Agrobacterium-mediated+rapid+maize+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation.</a> Plant Molecular Biology. 97 (1-2), 187-200 (2018).</li>
<li>Ray, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+acetolactate+synthase+gene+is+an+efficient+in+vitro+selectable+marker+for+the+genetic+transformation+of+Brassica+juncea+%28Oilseed+Mustard%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (Oilseed Mustard).</a> Journal of Plant Physiology. 161 (9), 1079-1083 (2004).</li>
<li>Green, J. M., Hale, T., Pagano, M. A., Andreassi, J. L. II, Gutteridge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+98140+corn+with+gat4621+and+hra+transgenes+to+glyphosate+and+ALS-inhibiting+herbicides%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Response of 98140 corn with gat4621 and hra transgenes to glyphosate and ALS-inhibiting herbicides.</a> Weed Science. 57 (2), 142-148 (2009).</li>
<li>An, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+3%27+control+region+of+the+potato+wound-inducible+proteinase+inhibitor+II+gene%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene.</a> The Plant Cell. 1 (1), 115-122 (1989).</li>
<li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+from+nonbioluminescent+Anthozoa+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 969-973 (1999).</li>
<li>Passarinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+Genes+Provide+Diverse+Entry+Points+into+Cell+Proliferation+and+Cell+Growth+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Target Genes Provide Diverse Entry Points into Cell Proliferation and Cell Growth Pathways.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 225-237 (2008).</li>
<li>Bhyri, P., Khrishnamurthy, N., Narayanan, E., Nott, A., Sarangi, R. R. Novel plant terminator sequences. Patent Number US2014/0130205. , (2014).</li>
<li>Laux, T., Mayer, K. F., Berger, J., Jürgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WUSCHEL+gene+is+required+for+shoot+and+floral+meristem+integrity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis.</a> Development. 122 (1), 87-96 (1996).</li>
<li>Garnaat, C., Lowe, K., Roth, B. Zm-AXIG1-specific polynucleotides and methods of use. Patent Number WO2002006499. , (2002).</li>
<li>Hershey, H. P., Stoner, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cDNA+clones+for+RNA+species+induced+by+substituted+benzenesulfonamides+in+corn%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn.</a> Plant Molecular Biology. 17 (4), 679-690 (1991).</li>
<li>Abremski, K., Hoess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+P1+site-specific+recombination.+Purification+and+properties+of+the+Cre+recombinase+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (3), 1509-1514 (1984).</li>
<li>Sun, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Function+Analysis+of+Small+Heat+Shock+Protein+Gene+ZmHSP17.7+from+Maize%5BTitle%5D)+AND+%22ACTA+Agronomica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7 from Maize.</a> ACTA Agronomica Sinica. 41 (3), 414(2015).</li>
<li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li>
<li>Hershfield, V., Boyer, H. W., Yanofsky, C., Lovett, M. A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+ColEl+as+a+molecular+vehicle+for+cloning+and+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3455-3459 (1974).</li>
<li>Liebert, C. A., Hall, R. M., Summers, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+Tn21%2C+flagship+of+the+floating+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Transposon Tn21, flagship of the floating genome.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (3), 507-522 (1999).</li>
<li>Nishiguchi, R., Takanami, M., Oka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+sequence+determination+of+the+replicator+region+in+the+hairy-root-inducing+plasmid+pRiA+4b%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Characterization and sequence determination of the replicator region in the hairy-root-inducing plasmid pRiA 4b.</a> Molecular and General Genetics. 206 (1), 1-8 (1987).</li>
</ol>

אלישיה מאסטרס, ויליאם גורדון-Kamm, וטוד ג ' ונס הם עובדים של קורטבע אגרימדע שסיפק את הפרוטוקול ואת האוזניים תירס של B73, Mo17, ו W22 בשימוש במאמר זה. המחברים Minjeong Kang, מורגן McCaw, ג'ייקוב Zobrist, ו קאן וואנג אין מה לגלות.

פרוטוקולים מסורתיים עבור התמרת תירס בצע את הפרדיגמה של בידוד עוברי זיפטיים בלתי-מפותחים כדי לייצר רקמת הטרנסג הטרנסגניים, אשר נוצר מחדש לתוך צמחים פוריים4,6. אמנם זה יעיל, callus-מבוססי פרוטוקולים יכולים לגזול זמן רב, וזה לוקח עד 3 חודשים לתהליך התרבות רקמה לייצר צמחים. מה שהופך את השיטה המוצגת כאן משמעותי היא כי הוא callus-חינם, יעיל, מהיר, ומאפשר התחדשות של צמחים T0 בערך במחצית מפרק הזמן. זה נראה גם פחות מסוג גנוטיפ, ולכן הוא יכול להיות יעיל עבור הזמינים ביותר מפגרים8,11.
בעוד כל הצעדים יש לעקוב באופן יעיל, נכון הכנה מדיית גדילה היא הכרחית. רכיבי מדיה צמיחה צריך להתווסף בשלבים הנכונים, מראש ולאחר האוטוקלב, כדי להבטיח כי חומר הצמח מקבל את הריכוז הנכון של כימיקלים. זה יבטיח תרכובות רגישות כמו אנטיביוטיקה לא להישבר. חשוב גם שחומר הצמח מוצב על המדיום הגדילה הנכון בכל שלב, כפי שמצוין בפרוטוקול. לא הצבת חומר על מדיום הגדילה הנכון עלולה לגרום למוות חומרי. בנוסף, יש להימנע מהצבת עוברים רבים מדי או מפתחים רקמות על לוחות. בעוד הצבת פי שניים מכלי הרקמה הרבים עשויים לחסוך את העלות של כימיקלים ומנות פטרי (ואפילו מרחב החממה), הצמיחה של רקמות לוחות צפוף יכול להיות מעכבות ברצינות. בעת ביצוע הזיהום, יש להבטיח כי הצפיפות האופטית של ההשעיה Agrobacterium מתאים. אם צפיפות ההשעיה החיידקית נמוכה מדי, ייתכן שהדבקה נכונה לא תתרחש.
איכות החומרים המתחילים חיונית להצלחה בפרוטוקולי השינוי. אוזניים המשמשות לניתוח העובר חייב להיות בריא, כלומר הצמח שמייצר אותם הוא בריא. הם גם חייבים להחזיק בערכת זרעים נאותה ולהיות מזיקים ונטול מחלות. כמו כן, אין להשתמש באגרובאכטריום הזקן. לוחית האימהות צריכה להיות. לא יותר משבועיים לאחר נקודה זו, לוחית "אמא" חדשה צריכה להיות מקוטעת כדי להתחיל בניסויים חדשים.
בעוד ששיטה זו הוצגה בפני פחות מסוג גנוטיפ, אין אפשרות להניח כי כל השורות יהיו מוצלחות באותה מידה. עדיין יכול להיות וריאציה בין הקווים, כמו גם הבדלים בהצלחה בהתבסס על המבנה בשימוש. ההבדלים בין האוזן לאוזן הוא גם בלתי נמנע כאשר עובדים עם עוברים בוגרים, כך שניסויים אידיאליים צריכים להשתמש במספר אוזניים כדי להסביר זאת. בעבודה זו, W22 ביצע את הטוב ביותר, עם מעל ~ 14% תדירות ההמרה, ואחריו B73 ו Mo17 (~ 4% כל אחד). לאו ואח '8 דיווח על שימוש בפרוטוקול quickcorn לשינוי B73 ו-Mo17. בעבודה זו, תדרי השינוי נעו מ -9%-50% עבור B73 ו-15%-35% עבור Mo17.
אפשרות אחת תדרי שינוי נמוך עבור B73 ו Mo17 נצפו בעבודה זו ניתן לייחס תנודות באיכות האוזן עונתית. הבדל נוסף בין עבודה זו לבין זה של לאו ואח '8 הוא שנעשה שימוש במבנה וקטורי שונה כאן. בעבודתו של לאו, הגנים המוסגניים לא הוסרו מהצומח ההפוך, אלא הושתקו מבחינה מנטלית בשלבים המאוחרים. בעבודה זו, הגנים המורפולגניים הוסרו 8 ימים לאחר ההדבקה. ייתכן שB73 ו-Mo17 יזדקקו לנוכחות ארוכה יותר של Bbm/Wus2 לפיתוח עוברים סומטיים.
שימוש בשיטה זו, יש אפשרות של קבלת צמחי בריחה לא הטרנסגניים, הוספות multimeric, ו טרנסגנים מונגיטים. צמחים אלה לא יהיה פנוטיפים שונים באופן ניכר, כך זיהוי ה-PCR נדרש כדי לקבוע אם הצמח הוא טרנסגניים. כדי לעשות זאת, ניתן ליישם את האזור הפנימי של ה-PCR בתוך האזור המגורש והתחל בכיוון השטח המגורש. שינויי צורה עצמאיים מרובים יכולים גם לייצר צמחים מן העובר אותו בלתי בוגר, מה שהופך את הנחישות של שיעור התאוששות עצמאית טרנספורמאנט הכולל קשה. התקן שלנו כבר לחשב שיעור שינוי המבוסס על דגימת צמח אחד מכל עובר בלתי הולם כי הפיק צמחים וחלוקת זה על ידי מספר העוברים נגוע. שיטה זו כמעט ללא ספק מעריכה את המספר הממשי של אירועים עצמאיים ששוחזרו כמו פלנטטים. האפליה בין אירועים עצמאיים מאותו העובר דורשת רצף של אזורי גבול סביב הטרנסגנים, וזה יהיה יקר באופן גמיש וארוך זמן עבור רוב היישומים; עם זאת, ייתכנו מקרים בהם נתונים אלה שימושיים.
שיטה זו של שינוי התרבות רקמה הוכיחה להיות יעילה מאוד, אבל בעיות עדיין יכול להתרחש. אם חומר הצמח אינו מגיב, ייתכן שיש בעיה עם הקו הטבעי המסוים, הרומז כי משתנים כגון הרכב מדיה צמיחה ותזמון של subculturing דורשים התאמות. משתנה נוסף הוא עיצוב וקטורי נאות ובנייה וקטורית מדויקת, אם הווקטור המקורי שונה. יכול להיות גם בעיות עם רגישות imazapyr, כמו כמה קווים רגישים יותר מאחרים, ואת הריכוז של imazapyr יכול להיות צריך להיות מותאם כדי להשיג צמחים שהפכו בהצלחה.
במהלך 30 השנים האחרונות, התרבות של רקמת תירס ופרוטוקולי טרנספורמציה השתנו והתקדמה; והוא האמין כי פרוטוקול מקוצר זה יהיה להמשך התקדמות זו. שיטה זו יעילה להגדרות אקדמיות משום שהיא פחות גוזלת זמן מאשר שיטות מסורתיות. בנוסף, היא אינה דורשת מפעילים מיומנים ביותר, מה שהופך אותה לקלה יותר להפצה נרחבת בהשוואה לשיטות מסורתיות. בעתיד, שיטה זו יכולה להיות משולבת עם טכנולוגיות חדשות כגון הנדסת גנום.

טרנספורמציה היא כלי בסיסי להערכת ביטוי גנים זרים תירס וייצור קווי תירס מהונדסים גנטית למטרות מחקר ומסחרי. גישה לשינוי תפוקה גבוהה יכולה להקל על הצורך המוגבר בלימודי הביולוגיה המולקולרית והתאית1. היכולת לשנות את מינים היבול בצורה גנטית היא חיונית למעבדות ציבוריות ופרטיות. זה מאפשר הן הבנה יסודית של מנגנוני רגולציה הגנים, כמו גם שיפור היבול בקנה מידה גלובלי כדי לתמוך באוכלוסיה ההולכת וגוברת.
התגלית כי עוברים בלתי בוגרים מתירס יכול לשמש לייצור של יבלות שלנו מקורו ב 19752. מאז ההתגלות הזאת, מדרגיים ביותר של תירס פרוטוקולים המרה יש צורך היווצרות ובחירה לפני התחדשות3. במהלך תהליך של שינוי גנטי, agrobacteriumאו ביוליסטיק-העוברים הופצץ בלתי בוגרים הם מתורבתים על מדיה עבור embryogenic יבלות האינדוקציה. Çallı המושרה אז הם מתורבתים על מדיה סלקטיבית (למשל, המכיל קוטל הצמחים), כך שרק חתיכות çallı שהפכו מסוגלים לשרוד. הקריאה האנטי-מגנטית העמידים בפני עשבים מולתרים ונוצרות מחדש לצמחים. בעוד שיטה זו יעילה, התהליך ארוך ועתיר עבודה, והוא יכול להימשך שלושה חודשים עד להשלמת4. וחשוב מכך, הפרוטוקולים של שינוי הצורה של תירס קונבנציונאלי הם בעלי מגבלה גדולה הרבה יותר, כלומר, רק מספר מצומצם של הגנוטיפים של תירס יכול להיהפך5,6.
לואו ואח '7,8 דיווחו בעבר על שיטת שינוי "quickcorn", שלא רק הקטינה באופן משמעותי את משך תהליך הטרנספורמציה אלא גם הרחיבה את רשימת הגנוטיפים הטרנספורבית. השיטה של מהירות התירס משתמשת ברישומי תירס (זם-bbm ו -Wus2) של מרכיבי התעתיק של התינוק בום (BBM)9 ורכרוכי (wus)10. כאשר משולבים במערכת וקטור שינוי, גנים אלה לעבוד בסינרגיה כדי לעורר embryogenic צמיחה7.
פרוטוקול quickcorn המתואר בעבודה זו התבסס על הפרוטוקול ב-Jones ואח '11, שהיה שיפור נוסף של השיטה שדווחה על-ידי לאו et7,8. במחקר הנוכחי, מאמץ Agrobacterium LBA4404 (שלך-) מחסה מבנה וקטורי בינארי PHP81430 (איור 1) ו-פלבין האביזר PHP7153912 משמשים לטרנספורמציה. T-DNA של PHP81430 מכיל את הרכיבים המולקולריים הבאים. (1) השינוי הסלקטיבי של הקלטת ביטוי של גן הרה . ה"תירס hra " הוא גן שונה לacetolactase סטנדרטים (als), שהוא מאוד סובלני לקוטלי עשבים שאינם מעכבים כגון סולופולוביאס וסרנוזולונס13,14. הגן של הארה ב מוסדר על ידי היזם דורה ALS8 ו תפוחי אדמה מעכבי פרוטטינואז ii (pinii) שליחות קטלנית15. T-DNA גם מכיל (2) קלטת ביטוי בעל שינוי הצורה מאפשר לסמן גן Zsgreen. זה ירוק חלבון הפלואורסצנטי גן Zsgreen מתוך זוציץ sp. השונית אלמוג16 מוסדר על ידי היזם המקדם של דורה/intron ואורז אוביקוויב שליחות קטלנית.
בנוסף, ה-DNA מכיל (3) את הקלטת ביטוי הגן המורפולגני Bbm . Bbm הוא גורם שעתוק הקשורים להתפתחותהעובר 9,17. Bbm מוסדר על ידי תירס מפוספוליפיד חלבון (pltp) יזם8 ואורז T28 שליחות קטלנית18. זם-Pltp הוא גן עם ביטוי חזק באפיתל העובר, שערות משי, ותאי הבת של העלה (מאגף את תאי המשמר), ביטוי נמוך באברי הרבייה, ואין ביטוי בשורשים8. הוא מכיל גם (4) את הקלטת Wus2 ביטוי הגן מורפולגניים. Wus2 הוא עוד גורם שעתוק הקשורים לתחזוקת מריאגזע האפיפיורי19. זם-Wus2 הוא תחת שליטה של תירס הinducible יזם (זם-Axig1)20 ו תירס In2-1 שליחות קטלנית21. בסופו של דבר, ה-DNA מכיל (5) מערכת שילוברקומבינציה של היצורים. Recombinase היצור הג22 הוא תחת שליטה של תירס הלם חום חלבון 17.7 (hsp 28.5)23 מקדם תפוחי אדמה ומחסל הסיכה2. שני אתרי Loxp (באותו כיוון)24 אגף ארבע קלטות של ביטוי גנים כולל zsgreen, היצורים, bbm ו Wus2.
בגלל הנוכחות של הגנים מורפולגניים אינו רצוי עבור בגרות הצמח הבאים צאצאים, הנגרמת חום המושרה -loxp מערכת רקומבינציה ילוב נבנה לתוך ה-DNA כדי להסיר גנים מורפולגניים מן הגנום תירס כדי לאפשר התחדשות באופן רגיל יבלות ופיתוח הצמח. בעת טיפול בחום, הביטוי של חלבון היצור מסיר את כל הטרנסגנים למעט הגן על בחירת ה- Hra . Transformants מוצלחת צריך להיות עמיד לצמחים אבל Zsgreen-שלילי. כדי לשפר עוד יותר את תדירות ההמרה, זן Agrobacterium גם נמלים אביזר נוסף פלמיד (PHP71539) כי יש עותקים נוספים של Agrobacterium התקפה אלימה (vir) גנים12.
שיטת QuickCorn שונה מפרוטוקולים קונבנציונליים של שינוי תירס, שכן היא אינה כרוכה בצעד האינדוקציה קריאה במהלך שינוי. במהלך השבוע הראשון לאחר זיהום עם Agrobacterium, העוברים הסומטיים להתפתח על האפיתל scutellar של העוברים בוגרים נגועים. העוברים מועברים לאחר מכן למדיום עם הורמונים המעודדים התבגרות והיווצרות העובר. במהירות העברת העוברים הסומטיים על התבגרות/לירות היווצרות בינונית מדלג על שלב יבלות המסורתי ששימש בעבר לשינוי תירס והיתרי דור ישיר של צמחים T08. לעומת שיטות השינוי של תירס שפורסמובעבר, שיטת התירס המהירה מהירה יותר, יעילה יותר ופחות גנוטיפ. באמצעות שיטה זו, צמחים מושרשת הם בדרך כלל מוכנים להעביר לקרקע רק 5-7 שבועות, ולא שלושה או יותר חודשים הנדרשים על ידי פרוטוקולים מסורתיים. מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מעמיק והדגמה של השיטה, המאפשרת שכפול קל יותר בהגדרת מעבדה הנמצאת בדרך כלל ברוב המוסדות האקדמיים.

<table><tbody><tr><td>2,4-D</td><td>Millipore Sigma</td><td>D7299</td><td></td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurine (BAP)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Millipore Sigma</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7921</td><td></td></tr><tr><td>רדיד</td><td></td><td></td> אלומיניום <td>לכיסוי בקבוק</td></tr><tr><td>אמוניום סולפט</td><td>Millipore Sigma</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>איזון</td><td></td><td></td> אנליטי <td>לשקול כמויות קטנות של כימיקלים</td></tr><tr><td>Autocalve</td><td>Primus (אומהה, NE)</td><td>PSS5-K</td><td>למדיה וכלים לחיטוי</td></tr><tr><td>לולאת תרבית חיידקים (10 ומיקרו; l)</td> <td>פישר מדעי</td><td>22-363-597</td><td>אוסף אגרובקטריום מהצלחת להעברה לנוזל</td></tr><tr><td>Bactoagar</td><td>BD bioscience</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>כוסות (1 ליטר, 2 ליטר, 4 ליטר)</td><td></td><td></td> <td>לערבב את הכימיקלים למדיה</td></tr><tr><td>בנומיל</td><td>מיליפור סיגמא</td> <td># 45339</td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה (8.25% נתרן היפוכלוריט)</td> <td>קלורוקס</td><td></td><td>לעיקור</td></tr> <tr>זרעים<td>חומצה בורית</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>קרבניצילין</td><td>Millipore Sigma</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>קזאין הידרוליזט</td><td>Phytotech</td><td>C184</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime</td><td>Phytotech</td><td>C380</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי (50 מ"ל)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-443-19</td><td>מכילים מדיום נוזלי ומתלה אגרו</td></tr><tr><td>קובט (חצי מיקרו)</td> <td>פישר מדעי</td><td>14955127</td><td>להחזיק נוזל למדידת OD</td></tr><tr><td>Dicamba</td><td>Phytotech</td><td>D159</td><td></td></tr><tr><td>מד</td><td></td><td></td> לחות דיגיטלי <td>בדיקת טמפרטורה ולחות לטיפול בחום</td></tr><tr><td>EDTA, מלח דיסודיום, דיהידראט</td><td>Millipore Sigma</td><td>324503</td><td></td></tr><tr><td>צינור אפנדורף (2.0 מ"ל)</td> <td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM12475</td><td></td></tr><tr><td>ויטמינים</td><td>Phytotech</td><td>E330</td><td>1000x של אריקסון באתנול נוזלי</td></tr><tr><td>(70%)</td><td></td><td></td><td>כלים ומשטחי חיטוי</td></tr><tr><td>ברזל סולפט Heptahydrate</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8263</td><td></td></tr><tr><td>, אוסמוקוט פלוס 15-9-12</td><td>ICL דשנים מיוחדים (דבלין, אוהיו)</td><td>A903206</td><td>בקבוק דשן</td></tr><tr><td>(2 ליטר)</td> <td>Pyrex</td><td>10-090E</td><td>למדיה וכלים לחיטוי</td></tr><tr><td>שטוחים (סטנדרטי 1020, פתוח עם חורים, 11 אינץ' רוחב x 21.37 אינץ' אורך x 2.44 אינץ' D)</td> <td>האמרט אינטרנשיונל (Earth City, Mo)</td> <td>11300000</td><td>מגש להחזקת אדמה והכנסת עציץ, מתאים למלקחיים Humidome</td></tr><tr><td>(עדינים וגדולים)</td><td></td><td></td> <td>עדין לטיפול בעוברים; גדול יותר עבור חומרים צמחיים גדולים ומשמש כמחזיקי</td></tr> <tr><td>אוזנייםGentamicin</td><td>Gold Biotechnologies</td><td>G-400</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק זכוכית (1 ליטר)</td> <td>Pyrex</td><td>06-414-1D</td><td>לחיטוי</td></tr><tr><td>בינוני צילינדר</td><td></td><td></td> מדורג <td>להתאמת נפח המדיה</td></tr><tr><td>Imazapyr</td><td>Millipore Sigma</td><td>37877</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור, 20 & deg; C</td><td>Percival Scientific</td><td>Model I-36NL</td><td>לגידול צלחת אם ודגירה של עוברים במהלך חממת זיהום אגרו</td></tr><tr><td>, 27 & deg; C</td><td>Percival Scientific</td><td>Model I-36NL</td><td>לגידול צלחת גידול משותף וחממת תרבית עובר תירס</td></tr><tr><td>, 45 & deg; C</td><td></td><td></td><td>טיפול בהלם חום</td></tr><tr><td>הכנס TO Standard, עציצים</td><td>Hummert International (Earth City, Mo)</td> <td>11030000</td><td>להשתלת צמחים מהשתרשות לאדמה, מתאים שטוח</td></tr><tr><td>ומכסה המנוע</td><td></td><td></td> הלמינר <td>Humidome שומר על תנאים סטריליים</td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Phytotech</td><td>P698</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט Heptahydrate</td><td>Millipore Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>זרעי תירס מונולדים B73</td> מזהה <td>צמח לאומי של ארה"</td>ב <td>= 47638</td><td></td></tr><tr><td>זרעי תירס מובלד Mo17</td> מזהה <td>צמח לאומי של ארה"</td>ב <td>= 15785</td><td></td></tr><tr><td>זרעי תירס מונולדים W22</td> מזהה <td>צמח לאומי של ארה"</td>ב <td>= 61755</td><td></td></tr><tr><td>מנגן סולפט מונוהידראט</td><td>Millipore Sigma</td><td>M7899</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q מערכות</td> <td>טיהור מיםMillipore sigma</td><td>MILLIQ</td><td>לתרבית רקמות מים בדרגה</td></tr><tr><td>MS בזאלי בינוני</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>MS תערובת מלח בסיסי</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>N6 תערובת מלח בסיסי</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1416</td><td></td></tr><tr><td>מהדקי נייר, ללא החלקה</td><td></td><td></td><td>מחזיק על שקיות ציצית</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD bioscience</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי (100x15 מ"מ)</td><td>פישר FB0875713 מדעי</td><td></td><td>לתרבית חיידקים בינונית</td></tr><tr><td>צלחת פטרי (100x25 מ"מ)</td><td>פישר מדעי</td><td>FB0875711</td><td>למד pH בינוני תרבית רקמות צמחים</td></tr><tr><td></td><td>פישר מדעי</td><td>AB150</td><td>להתאמת pH של מדיה</td></tr><tr><td>פיפטה (1 מ"ל)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4641100N</td><td></td></tr><tr><td>קופסאות פלסטיק</td><td>חנות המכולות</td><td>10048430</td><td>לאחסון ודגירה של תרביות רקמות</td></tr><tr><td>כיפת לחות מפלסטיק (Humi-Dome)</td> <td>Hummert International (Earth City, Mo)14385100</td><td></td> <td>כיסוי פלסטיק לאדמה שטוחה</td></tr><tr><td>אשלגן יודיד</td><td>Millipore Sigma</td><td>793582</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן חנקתי</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8291</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Millipore משקל Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td></td><td>לשקילת כימיקלים למדיה</td>להב אזמל (מס' 11, 4 ס"מ)Thermo Scientific 3120030 להסיר את החלק העליון של כתרי הגרעינים לדיסקציה של עוברים ידית אזמל אוחזת להבי אזמל Schenk &<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ויטמין הילדברנדט (S& H ויטמין)</td> <td>Phytotech</td><td>S826</td><td>100x</td></tr><tr><td>אבקת מספריים</td><td></td><td></td><td>חיתוך יורה</td></tr><tr><td>אוזניים תיק יורה (Canvasback- שקוף למחצה)</td> <td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td> <td>S26</td><td>שקית חצי שקופה לכיסוי יורה אוזניים</td></tr><tr><td>כסף חנקתי</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7276</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מוליבדט דיהידראט</td><td>Millipore Sigma</td><td>M1651</td><td></td></tr><tr><td>מצע ללא סויה LC1</td><td>SunGro Horticulture (Agawam, Ma)</td><td>#521</td><td>לגידול צמחי תירס</td></tr><tr><td>מרית (מיקרו-מחודדת כפולה)</td><td>Fischer Scientific</td><td>2140110</td><td>ניתוח עוברים מגרעינים</td></tr><tr><td>מרית (עם כף)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-375-10</td><td>למדידת כימיקלים למדיה</td></tr><tr><td>ספקטינומיצין</td><td>Millipore Sigma</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר (Genesys 10S UV-Vis)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>840-300000</td><td>מדידה OD של השעיה אגרו</td></tr><tr><td>מוט ערבוב</td><td>פישר מדעי</td><td>14-513-67</td><td>לערבב</td></tr><tr><td>מדיה פלטות</td><td></td><td></td> חימום <td>לערבוב מזרק מדיה</td></tr><tr><td>(ללא מחט, 60 מ"ל)</td> <td>פישר מדעי</td><td>14-823-43</td><td>לעיקור מסנן</td></tr><tr><td>מזרק (0.22 ומיקרו; m)</td> <td>Fisher scientific</td><td>09-720-004</td><td>לעיקור פילטר</td></tr><tr><td>שקית ציצית (Canvasback- חום)</td> <td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td> <td>T514</td><td>שקית לכיסוי גדילים של צמחים לא טרנסגניים</td></tr><tr><td>שקית ציצית (פס ירוק קנבס)</td> <td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td> שקית <td>T514G</td><td>לכיסוי גדילים של צמחים טרנסגניים</td></tr><tr><td>תיאמין HCl</td><td>Phytotech</td><td>T390</td><td></td></tr><tr><td>Thidiazuron</td><td>Phytotech</td><td>T888</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1895</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>Phytotech</td><td>T869</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cas #9005-64-5</td><td>פעילי שטח</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI0236</td><td>הומוגניזציה של נוזלים (השעיה אגרו)</td></tr><tr><td>אמבט מים (גדול - דגם דיוק 186)</td><td>פישר מדעי</td><td>כל מה שיכול להתאים לצלוחיות 4+ 2 ליטר ולהגיע ל-55 מעלות; C</td><td>שומר על מדיה חיטוי בטמפרטורה אופטימלית</td></tr><tr><td>שקול צלחת</td><td>פישר מדעי</td><td>08-732-112</td><td>למדידת כימיקלים למדיה</td></tr><tr><td>נייר שקילה</td><td>פישר מדעי</td><td>09-898-12A</td><td>למדידת כימיקלים למדיה</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP14222</td><td></td></tr><tr><td>Zeatin</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z0164</td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium-תיווך המעבר העובר בלתי בוגר של הסרבן מתוך תירס שורות באמצעות גנים מורפולגניים

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

הפגינו כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור Agrobacterium-תיווך הטרנספורמציה גנטית של תירס שורות מורפולגניות באמצעות גנים מורגניים התינוק בום (bbm) ו Wuschel2 (Wus2). Bbm מוסדר על ידי תירס פוספוליפיד מיזם גנטי (pltp), ו Wus2 הוא תחת השליטה של תירס מinducible (Axig1) מיזם. זן Agrobacterium נושאת אלה גנים מורפולגניים על העברת דנ א (T-DNA) ועותקים נוספים של התקפה ואלימה של agrobacterium (vir) גנים משמשים כדי להדביק תירס העובר בלתי בוגר explants. העוברים הסומטיים מטפסים על הסמשתלה של העוברים הנגועים וניתן לבחור על ידי התנגדות לעשבים ומונבטים לצמחים. המופעל חום מערכת שילוב של loxP מובנה במבנה ה-DNA מאפשר הסרה של גנים מורפולגניים מן הגנום תירס בשלב מוקדם של תהליך השינוי. תדרים שינוי של כ 14%, 4%, ו 4% (מספרים של אירועים הטרנסגניים עצמאית לכל 100 עוברים נגועים) ניתן להשיג עבור W22, B73, ו Mo17, בהתאמה, באמצעות פרוטוקול זה.

הפגינו כאן הוא פרוטוקול צעד אחר צעד עבור Agrobacterium-תיווך הטרנספורמציה גנטית של שלושה הציבור תירס שורות הטבעי (B73, Mo17, ו W22) כי היו משמעותיים בתחום גנטיקה של תירס. שינוי שלושת הקווים המואליים לא ניתן להשיג באמצעות שימוש רגיל של תירס שינוי פרוטוקולים5. איור 1 ואיור 2 מראים את המבנה וחומרי ההתחלה, בהתאמה, משומשים כאן. אוזניים הם בדרך כלל לקצור 9-12 ימים לאחר האבקה. רסטר עם אורכים בין 1.5-2.0 מ"מ הם הexplants הטובה ביותר עבור שינוי עבור פרוטוקול זה (איור 2).
שמונה ימים לאחר ההדבקה, העוברים ביטוי הסומאטיים של Zsgreenהביעו מתחת לערוץ ה-gfp של מיקרוסקופ פלורסנט (איור 3). המחלה הנגועה הייתה נתונה לטיפול בחום 8 ימים לאחר ההידבקות (שלבים 5.1 ו-5.2). טיפול זה השפיע על הביטוי של היצור recombinase כי הניח את Bbm, Wus2, היצור , ו zsgreen ביטוי קלטות מוקף בין שני אתרי loxp (איור 1). הרקמות שטופלו בחום היו אז מתורבתים על היווצרות לירות בינונית המכילה את imazapyr הצמחים לבחירה של רקמת הטרנספורמציה לאחר הסרת גנים מורפולגניים.
מתרבים רקמות עם עוברים התבגרות או לירות ניצנים כי היו עמידים imazapyr נצפו סביב 3-4 שבועות לאחר זיהום (איור 4). כמה הרקמות העמידות imazapyr היו שליליות עבור ZsGreen, הרומז כיהכריתה של היצור-מתווכת סביר שהתרחשה ברקמות אלה (איור 4). לאחר הרקמות הועברו השתרשות הדגירה בינונית וקלה, יורה החלה לפתח (איור 5). נצרי בריאה ונמרצת עם שורשים מפותחים היטב נקצרו (איור 5). כמה רקמות הופיעו יש מספר נצרי (איור 5E, F, G). סוג זה של "דשא" מחדש עשוי להיות עקב צמחי שבטים בעלי דפוסי אינטגרציה זהים. ניתוח ביולוגי מולקולרי נדרש כדי גנוטיפ אלה צמחים.
כל שלושת הקווים הציבוריים הגיבו היטב באמצעות פרוטוקול זה, כמו גם את המבנה המשמש בעבודה זו. W22 הפיק את התדר הגבוה ביותר של imazapyr עמיד נצרי, עם תדר של כ 14% (על 14 הטרנסגניים לצלם לכל 100 העוברים בוגרים נגועים). שניהם B73 ו Mo17 הפיק כ 4% הטרנסגניים נצרי. התדרים הללו מצביעים על כל הצילומים הטרנסגניים, כולל הצמחים הנושאים את הגנים המוורגניים והצמחים עם הגנים המוורגניים שהוסרו על ידי הסרת הצורה בתיווך.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig1.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של אזור ה-DNA של הפלPHP81430 הבינארי. RB = הגבול T-DNA הימני; Loxp = היצורים recombinase אתר היעד; Axig1pro:Wus2 = תירס אוקאין-inducible יזם (זם-Axig1) + זם-Wus2 + תירס In2-1 שליחות קטלנית; Pltppro:זם-bbm = תירס פוספוליפיד חלבונים העברת חלבון (זם-Pltp) מיזם + זם-Bbm + אורז T28 שליחות קטלנית (Os-T28); Hsppro: היצור = תירס הלם חום חלבון 17.7 יזם (כלומר-hsp 28.5) + ביצורים Recombinase gene + תפוחי אדמה מעכבי השני (קשירה) שליחותקטלנית; Ubipro:zsgreen = דורה אוביקוויב יזם/Intron (Sb-Ubi) + חלבון פלורסנט ירוק zsgreen גן + אורז אוביקוויב שליחות קטלנית (Os-ubi); קלטת Hra = דורה acetolactase סטנדרטים (Sb-Als) מיזם + תירס Hra (זם-Hra) וכלי קשירה שליחות קטלנית; ליברות = הגבול T-DNA שמאל; colE1, מקור השכפול של פלאמיד ColE125; SpecR = Spectinomycin גן aadA1 מTn21 עבור בחירת החיידק26; נציג A, B, C = מקור השכפול מ pRiA4 של Agrobacterium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig2c.jpg"> איור 2: חומרי התחלה. אוזניים B73שנקטפו 12 ימים לאחר האבקה (א). עוברים לא בוגרים של B73 (ב), Mo17 (ג) ו-W22 (ד). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig3c.jpg"> איור 3: התפתחות רקמות על מנוחה מדיום 1 שבוע לאחר ההדבקה. עוברים (8 ימים לאחר הזיהום) תחת מיקרוסקופ פלורנציה (מסנןgfp) המראה gfp ביטוי העוברים הסומטיים של Mo17 (a) ו W22 (ב). פיתוח רקמות (B73) תחת שדה בהיר (C) ו-gfp מסנן (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig4c.jpg"> איור 4: התפתחות רקמות על התבגרות בינונית עם בחירה. צלחת ההבשלה של W22 (א). פיתוח רקמות (Mo17, 15 ימים לאחר ההדבקה) תחת שדה בהיר (ב) ו-gfp מסנן (ג). פיתוח רקמות (Mo17, 28 ימים לאחר ההדבקה) תחת שדה בהיר (D) ו-gfp מסנן (E). חצים הצבע כדי ליצור מתחדשות רקמות כי הם חסרים ביטוי GFP, מציע את כריתה של גן Zsgreen בין האתרים loxp לאחר המושרה חום פעילות חלבון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig5c.jpg"> איור 5: התפתחות רקמות על השתרשות התקשורת. נצרי של W22 (א), B73 (ב) ו-MO17 (C, D). אירוע עם מספר רב של מB73 (E) ו-W22 (F, G). מצלם עם שורשי B73 (H) ו-W22 (I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: קומפוזיציות מדיה לשינוי של תירס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/table1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a>

גנים מורפולגניים הצמח יכול לשמש כדי לשפר את הטרנספורמציה גנטית של גנוטיפים הסרבן. המתואר כאן הוא Agrobacterium-תיווך הטרנספורמציה גנטית (quickcorn) פרוטוקול עבור שלושה חשובים הציבור תירס שורות.

Agrobacterium-תיווך המעבר העובר בלתי בוגר של הסרבן מתוך תירס שורות באמצעות גנים מורפולגניים

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

רוב קווי הת תירס inbred לא ניתן לשנות גנטית באמצעות פרוטוקולי טרנספורמציה קונבנציונליים. כאן, אנו מתארים שיטת טרנספורמציה QuickCorn כי הוא מהיר ופחות תלוי גנוטיפ. שיטת QuickCorn משתמשת בגורמי שעתוק תירס בייבי בום ו-WUSCHEL.כאשר הם משולבים במערכת וקטור הטרנספורמציה, גנים אלה פועלים בסינרגיה כדי לעורר צמיחה עוברית. שלא כמו פרוטוקולי טרנספורמציית תירס קונבנציונליים, השיטה QuickCorn אינה כרוכה בשלב אינדוקציה של callus במהלך הטרנספורמציה. אזור T-DNA של הווקטור הבינארי המשמש בעבודה שלנו מכיל שלושה מרכיבים מרכזיים, גנים מורפוגניים, גנים של סמן, ואת מערכת recombination cre / loxP.מערכת רקומפינציה cre / loxP הנגרמת על ידי חום נכללה ב- T-DNA כדי להסיר את הגנים המורפוגניים מהגנום תירס כדי לאפשר התחדשות callus נורמלי בפיתוח הצמח. בערך יומיים-שלושה לאחר שהתגלו משי, ואם אבקה תהיה זמינה למחרת, חותכים את המשי וההצקה עם מספריים מעוקרים של 70%, בערך 2 וחצי ס"מ מתחת לקצה עלי ההצצה, שם מגיחים המשי ומכסים את המשי בשקית יורה. ברגע שאתרים מגיחים מתוך צצוץ, מכסים את הצאסל בשקית צצוץ, ומ מניחים אקליפ נייר ללא החלקה בבסיס התיק סביב הגבעול.בבוקר שלאחר הנחת שקית הצצה, לכופף בעדינות את הצמח, והקש על התיק כדי לעודד אבקה להשתחרר. לאחר מכן להסיר את שקית צבר, ולקפל את החלק העליון של התיק מעל כדי למנוע אבקה לברוח. כדי להאביק צמח המטופל, לחשוף את המשי, במהירות לשפוך אבקה משקית ציצית על המשי.מכסים מיד את האוזן האבקה עם שקית צסל, ולאבטח את הבסיס של התיק סביב הגבעול עם סיכות. כדי לבדוק את גודל העובר לא בוגר, תשעה עד 12 ימים לאחר ההאבקה, בעדינות למשוך את הזרימה כדי לחשוף את הגרעינים בערך 1/3 כדי 1/4 של היקף האוזן ועל 1/3 של המרחק במורד האוזן. השתמש באזמל כדי לחתוך את המכסה של גרעין יחיד שנראה דומה לרוב הגרעינים האחרים בגודל ובצבע, ולהשתמש מרית עם סרגל כדי לחלץ את העובר.לאחר מכן השתמש בסרגל או בקליפר כדי למדוד את אורך העובר. בתוך יום עד ארבעה ימים של הקציר, להסיר את הפקקים והמשי מן האוזניים שנקטפו, ולהכניס ידית מתאימה לתוך החלק העליון או הבסיס של כל אוזן. להטביע את האוזניים במיכל גדול של ת פתרון אקונומיקה חיטוי במכסה המנוע לזרימה למינאר סטרילית עם הידית פונה כלפי מעלה.לאחר 20 דקות, לשטוף את האוזניים שלוש פעמים עם נפח נדיב של מים מזוקקים סטריליים טריים במשך חמש דקות לכל לשטוף לפני המאפשר לאוזניים להתייבש במשך כמה דקות. לאחר מכן, מלא צינור מיקרוצנטריפוגה אחד של שני מיליליטר לאוזן במדיום נוזלי 700A, ולהשתמש באזמל סטרילי כדי להסיר את החלק העליון של אחד עד שני מילימטרים של כל כתר קרנל כדי לחשוף את האנדוספרם של האוזן. אתר את העובר הלקוי בתוך הקרנל בצד הפונה לקצה האוזן, ליד ההחזקה לקורח.עבור המטפל העליון ומפעילים ימניים, הנח את האוזן על צלחת פטרי סטרילית גדולה, והכנס מרית מיקרו לתוך האנדוספרם ב pericarp הרחוק ביותר מן העובר. בעדינות לסובב כלפי מעלה כדי לנטרל את האנדוספרם ולחשוף את העובר, ולהשתמש מרית בזהירות למקם את העובר לתוך צינור אחד של 700A מדיום נוזלי. עבור מפעילי מטפל בסיס מחזיק את האוזן ביד שמאל, להכניס מרית מיקרו לתוך האנדוספרם ב pericarp הרחוק ביותר מן העובר, בעדינות לסובב כלפי מעלה כדי לנטרל את האנדוספרם.כדי לתרבת את העוברים בתרבות השעיית אגרובקטריום, לאסוף חיידקים מצלחת עבודה מוכנה טרי לתוך 10 מיליליטר של מדיום נוזלי 700A, ומערבולת להשעות את תרבות החיידקים לחלוטין. למדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 550 ננומטר, ולשטוף את העוברים עם מיליליטר אחד של מדיום 700A טרי. לטבול את העוברים במיליליטר אחד של השעיית אגרובקטריום, ומערבולת על הגדרה נמוכה במשך 30 שניות.ליישב את העוברים על הספסל עם הצינורות בכיוון אופקי במשך חמש דקות לפני העברת כל התוכן של כל צינור על צלחות בודדות של 562V שיתוף טיפוח בינוני. מערבבים בעדינות את הצלחות כדי להפיץ את העוברים באופן שווה, ושואף את ההשעיה העודפת של אגרובקטריום. בזהירות לכוון את העוברים עם הצד בצורת כיפה פונה כלפי מעלה, דואג כדי למנוע נזק לעוברים.ואז למקם צלחות לתוך קופסאות פלסטיק עבור דגירה לילה ב 21 מעלות צלזיוס בחושך. למחרת בבוקר, להעביר בזהירות עוברים נגועים על מנוחה בינונית 605T, מקום כ 30 עוברים לכל צלחת, צד scutellum למעלה, עבור דגירה של ארבעה עד 10 ימים ב 26 מעלות צלזיוס בחושך. בסביבות שבעה ימים, התפתחות עובר סומטית ניתן לראות על פני השטח של scutellum זיגוטי.בתום תקופת המנוחה, מניחים את קופסת העוברים באינקובטור של 45 מעלות צלזיוס עם 70% לחות יחסית למשך שעתיים, ולאחר מכן דגירה של שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס בחושך. בסוף הדגירה, מניחים 10 עד 15 עוברים לא בוגרים בהלם חום על צלחות בודדות של היווצרות לירות בינוני בתוספת 05 מיליגרם לליטר של קוטל עשבים imazapyr כסוכן סלקטיבי. הסר בזהירות את כל הקולופליחים לפי הצורך, והחזר את העוברים לאנקובטור הכהה של 26 מעלות צלזיוס למשך שבועיים.בסוף הדגירה, מעבירים כשמונה חתיכות של רקמה לכל צלחת על בסיס צלחות בינוניות עבור דגירה של שבוע עד שבועיים עם 16 שעות של אור ושמונה שעות של חושך ב 27 מעלות צלזיוס. ככל שהצמחיות מתפתחות, מניחים צמח אחד חזק יותר המכיל הן יורה והן שורשים נמרצים על צלחות בודדות של מדיום השתרשות תחת אור במשך שבעה עד 14 ימים נוספים. אפשר יורה כי הם לא מפותחים באופן מלא להיות דגירה על אותו מדיום במשך עוד שבוע עד שבועיים עד שהם מוכנים לעבור לאדמה.ככל שהצמח הופך נמרץ יותר, לשטוף את השורשים עם מי ברז כדי להסיר אגר. לאחר מכן להשתיל את הצמחים בודדים לתוך סירים שלושה אינץ 'המכיל מצע ללא אדמה רטוב מראש במגש עם חורי ניקוז, ולמקם את המגש בתא צמיחה עם או בלי כיפת לחות פלסטיק. תשעה עד 14 ימים לאחר העברת חשיש, להשתיל כל צמח עם אדמה לתוך סיר 1.5 ליטר.מוסיפים לסיר דשן בשחרור מבוקר, ושומרים על הצמחים בחממה. כאשר יורה האוזן מתחילים לצאת מן הצמח, להשתמש בשקית לירות חצי קדם כדי לכסות את היורה, כך המשי המתעוררים ניתן לראות מבלי להסיר את התיק. לאחר מכן להאביק את הצמחים בשלב המתאים של פיתוח כפי שהוכח.אוזני הת תירס נקצרות בדרך כלל תשעה עד 12 ימים לאחר האבקה. עוברים לא בוגרים באורכים הנעים בין 1.5 לשני מילימטרים הם המתפוצצים הטובים ביותר לשינוי עבור פרוטוקול זה. שמונה ימים לאחר ההדבקה, עוברים סומטיים המבטאים ZsGreen יכולים להיות חזותיים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.טיפול בחום שמונה ימים לאחר ההדבקה גורם לביטוי cre recombinase, וכתוצאה מכך כריתה של הגן המורפוגניים, cre, ו ZsGreen ביטוי קלטות מוקף בין שני אתרי loxP. לאחר שלושה עד ארבעה שבועות של תרבות על לירות היווצרות בינוני המכיל קוטל עשבים, רקמות מתרבות עם עוברים התבגרות או לירות ניצנים עמידים קוטל עשבים ניתן לראות. חלק מהרקמות עמידות בפני קוטל עשבים עשויות להיות שליליות עבור ZsGreen, מה שמרמז כי כריתה מתווכה cre סביר התרחשה ברקמות אלה.לאחר העברת הרקמות השתרשות דגירה בינונית וקלה, בריא, נמרץ, גדל יורה עם שורשים מפותחים ניתן לקצור. שים לב כי רקמות מסוימות עשויות להיראות יש יורה מרובים אולי בשל צמחים שיבוט בעל דפוסי אינטגרציה מהומר זהה. שיטת QuickCorn יכולה לשפר מאוד את יעילות טרנספורמציית הת תירס ולהרחיב את רשימת הגנוטיפים הניתנים לשינוי.הפרוטוקול יכול להיות משוחזר בהצלחה על ידי חוקרים עם אימון טרנספורמציה תירס מינימלי. באמצעות שיטת QuickCorn, צמחים מושרשים צריכים להיות מוכנים לעבור לאדמה רק חמישה עד שבעה שבועות לאחר יום הזיהום. שימו לב להרכב הבינוני, לתזמון תת-התת-תרבות ולתנאי הטמפרטורה והתאורה.איכות החומרים ההתחלתיים חיונית גם לטרנספורמציה מוצלחת. הכימיקלים, פתרון האקונומיקה קוטל עשבים המשמשים בפרוטוקול זה הם biohazardous. אנא הקפד ללבוש את ציוד ההגנה האישי המתאים במהלך השימוש בהם.

agrobacterium-mediated-immature-embryo-transformation-recalcitrant

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: בירנינק, ב. מ. ואחרים. הזרקה ישירה של שתילי תירס באמצעות הזרקה של וירוס הפסיפס של זנב שועל רקומביננטי ושיבוטים זיהומים של וירוס פסיפס קנה הסוכר. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון הזה מדגים את העברת שיבוטים ויראליים רקומביננטיים בתיווך אגרובקטריה לשתילי תירס לצורך השתקת גנים. הוא מתאר את תהליך זיהום האגרובקטרים , התפשטות וירוסית מערכתית ושינויים פנוטיפיים המונעים מהפרעות RNA.

העברת שיבוטים ויראליים רקומביננטיים בתיווך אגרובקטריום לשתילי תירס להשתקת גנים

בסרטון זה אנו מדגימים טרנספורמציה גנטית של גנום האורז באמצעות וקטור בינארי Agrobacterium tumefaciens. חיידק זה מאפשר העברה של פלסמיד DNA זר באמצעות חלבוני אלימות אגרובקטריום.

טרנספורמציה גנטית בתיווך אגרובקטריום: שיטה לשינוי גנטי של גנום האורז באמצעות גידולי אגרובקטריום מהונדסים גנטית

המטרה היא להמחיש שניתן להשתמש בקלות במודל הקטניות Medicago truncatula כדי לחקור את הוויסות של עובריות צמחים מוקדמות כדי להשלים את מודל ה-Arabidopsis שאינו קטניות. מורפולוגיה של תרמילים קשורה לשלבי אמבריוגנזה זיגוטית ומסופק גם פרוטוקול לאיסוף עוברים באמצעות תרבית רקמה.

פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם<em&gt; Medicago truncatula</em

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אספרגילוס flavus צמיחה וייצור aflatoxin ב תירס גרעינים ביטוי של חלבונים נגד פטריות.  באמצעות זן GFP-לבטא flavus א לנו פיקוח זיהום או התפשטות הפטרייה ב גרעינים בוגרת בזמן אמת. וזמינותו היא מהירה, אמינה, לשחזור.

עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל'

עבודה זו מתארת את השימוש בטכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR-Cas9 כדי נוקאאוט גן אנדוגני OsABCG15 ואחריו Agrobacterium שונה-פרוטוקול טרנספורמציה בתיווך לייצר קו זכר סטרילי יציב באורז.

אגרובקטריום -תווךטרנספורמציה גנטית, ייצור טרנסגנית, ויישום שלה לחקר התפתחות הרבייה הגברית באורז

פרוטוקול הזרקה מבוסס אגרובקטריום (אגרובקטריה) מוצג לחיסון של וירוס פסיפס זנב שועל ווירוסי פסיפס קני סוכר לשתילי תירס. חיסון באופן זה מוביל לזיהום ויראלי, השתקת גנים הנגרמת על ידי וירוס של גנים סמן, ו overexpression ויראלי של GFP.

אגרוינוקולציה ישירה של שתילי תירס על ידי הזרקה עם וירוס פסיפס זנב שועל רקומביננטי ווירוס פסיפס קנה סוכר שיבוטים זיהומיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בתפוקה גבוהה להעברה זמנית של מיליוני פרוטופלסטים של תירס לבדיקת ספריות גדולות של פלסמידים בתאי מזופיל תירס.

טרנספקציה ניתנת להרחבה של פרוטופלסטים של מזופיל תירס

במחקר זה פותח בבמבוק רומן בשיטת ביטוי גנים של צמחים ובשיטת עריכת גנים בתיווך אגרובקטריום . שיטה זו שיפרה מאוד את יעילות אימות תפקוד הגנים בבמבוק, דבר שיש לו השלכות משמעותיות על האצת תהליך גידול הבמבוק.

ב Planta ביטוי גנים ועריכת גנים בעלי במבוק מוסו

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול הראשון לחדירת ואקום מקומית למחקרי in vivo של טרנספורמציה גנטית של צמחים גדולים. באמצעות מתודולוגיה זו, השגנו לראשונה את הטרנספורמציה הארעית של קקאו בתיווך אגרובקטריום בפלנטה .

חדירה חקלאית כפויה בוואקום עבור בצמח טרנספורמציה של צמחים סרבנים: קקאו כמקרה בוחן

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

למד את שיטת QuickCorn להעברת גנים בתירס באמצעות Agrobacterium וגנים מורפולגניים BABY BOOM ו-WUSCHEL. שיטה זו מייעלת את השתלת העוברים הבלתי בוגרים ומסירה את שלב האינדוקציה של הקלוס.

Agrobacterium-תיווך המעבר העובר בלתי בוגר של הסרבן מתוך תירס שורות באמצעות גנים מורפולגניים

גלה סרטונים נוספים