Name: זמן הדמיה של נחילים חיידקיים ואת תגובת הלחץ הקולקטיבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: למד ליצור סרטי טיים-לאפס ברזולוציה גבוהה של נחילי Pseudomonas aeruginosa בתגובה לבקטריופאג'ים ואנטיביוטיקה. השיטה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר דינמיקת הנחיל וניתוח התנהגות חיידקית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

י.-ל ג'ונסון, א. י., ו. מ. ק. ה. כתב ושינו את כתב היד. כל המחברים תכננו את הניסויים. ג.-ל ג'ונסון ביצעו את הניסויים והניתוח. עבודה זו נתמכת על ידי K22AI112816 בפרס NIH ו-R21AI139968 מענק ל-ס. י. ובאוניברסיטת קליפורניה. נ. מ. ח-ק בתמיכת מלגות לונלבק R220-2016-860 וR251-2017-1070. לתורמים לא היה כל תפקיד בהחלטה להגיש את העבודה לפרסום. . אין לנו אינטרסים מתחרים להכריז

1. הכנת לוחות שורצים במשך P. aeruginosa שורצים זמן הדמיה
<ol><li>להכין 1 L של 5x M8 מינימום מדיה בבקבוק זכוכית על ידי הוספת 64 g של Na2hpo4• 7h2O, 15 גרם של KH2פו4, ו 2.5 g של הנאל ב 500 mL כפול מים מזוקקים (ddh2O). כוונן את אמצעי האחסון הסופי ל-1 ל' עם תוספת ddH2O. אוטוקלב כדי לעקר ולאחסן מדיה נוזלית בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכינו 100 mL של 1 M MgSO4 (מגנזיום גופרתי) בבקבוק זכוכית על ידי הוספת 24.6 g של mgso4• 7h2o ב 50 ml Ddh2o. להתאים את הנפח הסופי 100 Ml עם תוספת ddh2o. אוטוקלב לחטא. . חנות בטמפרטורת החדר</li>
	<li>הכינו 100 mL של 20% חומצות קאמינית בבקבוק זכוכית על ידי הוספת 20 גרם של חומצות קאמינית ב 50 mL ddH2o. כוונן את הנפח הסופי ל 100 mL עם תוספת ddh2o. אוטוקלב לחטא. . חנות בטמפרטורת החדר</li>
	<li>להכין 100 mL של 20% גלוקוז בבקבוק זכוכית על ידי הוספת 20 גרם של גלוקוז ב 50 ml ddh2o. להתאים את הנפח הסופי ל 100 ml עם תוספת ddh2o. לעקר על ידי סינון עם מסנן 0.22 יקרומטר. . חנות בטמפרטורת החדר</li>
	<li>כדי להפוך 10 לוחות שורצים, להוסיף 1 גרם של אגר ב 100 mL של ddH2o ולהתאים את הנפח הסופי ל 160 ml עם תוספת ddh2o ב a 250 mL erlenmeyer בקבוקון. . לחטא על ידי אוטוקלינג<ol>
<li>מיד לאחר האוטוקלינג, מניחים את הפתרון אגר באמבט מים 55 ° c עבור 15 דקות.</li>
		<li>להסיר את הפתרון אגר מאמבט מים ולהוסיף 40 mL של מדיה 5x M8 מינימלי, 200 μL של 1 M MgSO4, 2 מ ל של 20% גלוקוז, ו 5 מ ל של 20% חומצות קאמידיות15. המשך לשלב 1.6 מיד לאחר ערבוב. הערה: הריכוזים הסופיים הם 0.5% אגר, 1 מ"מ MgSO4, 0.2% גלוקוז, ו 0.5% חומצות אמינו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שימוש בפיפטה 25 מ ל לנפח אחיד, להוסיף 20 מ ל של הפתרון שורצים באגר 10 ס"מ צלחת פטרי. הערה: נפח קבוע של פתרון אגר חשוב, כמו אמצעי האחסון משפיע על זמן ייבוש תוכן הלחות של אגר. להימנע בועות בעת ביצוע צלחות שורצים אגר.</li>
	<li>לאפשר אגר לגבש ידי הצבת צלחות שורצים בערימה אחת עם מכסים על 1 h על הספסל בטמפרטורת החדר. הפעל את מכשיר האדים כדי להקטין את הלחות היחסית של החדר ל-40-50% 1 h לפני השלב הבא.</li>
	<li>נגב את הצלחות שורצים במשך 30 דקות נוספות עם העפעפיים בתוך כיפה זרם למינארי ב 300 ft3/min עם 40-50% לחות יחסית בטמפרטורת החדר. מייבשים את פנים העפעפיים על-ידי הצבת הפנים למעלה במכסה הזרימה הבינארי. חנות לוחיות שורצים ב -4 ° c עד 24 שעות.</li>
	<li>הכינו שחור 10 ס מ עפעפיים צלחת פטרי להדמיה על ידי החלקת החלק הפנימי של המכסה עם נייר זכוכית. הניחו את העפעפיים בתוך קופסת האריזה והניחו את תיבת האריזה תחת כיסוי כימי. רסס בתוך העפעפיים באמצעות ספריי צבע שחור. . הניחו לעפעפיים להתייבש הערה: ניתן להשתמש מחדש בעפעפיים שחורים לניסויים נוספים. חשוב שעפעפיו נצבעים כך שלא ישקפו אור במהלך הסריקה.</li>
</ol>2. צמיחה של P. aerginosa ותנאי ציפוי
<ol><li>הכינו 400 מ ל של ציר ליבסואז (LB) על ידי הוספת 10 גרם של מיקס אבקת LB-מילר לתוך 400 mL ddH2O. עבור 2% LB-אגר מנות פטרי, להוסיף 8 גרם נוסף של אגר. אוטוקלב לחטא.</li>
	<li>יוצקים 20 מ ל מדיום LB-אגר מותכת לתוך 10 ס מ בקוטר מנות פטרי ולאפשר להם לגבש בטמפרטורת החדר לילה. אחסן מדיה נוזלית בטמפרטורת החדר וצלחות אגר ב -4 ° c.</li>
	<li>רצף P. aeruginosa על צלחת ליברות-אגר פטרי ממניה קפואה מאוחסן ב-80 ° c באמצעות לולאות סטרילי או מקלות עץ. הפוך את צלחת פטרי הפוכה ללילה ב 37 ° c. חנות ליברות-אגר הצלחת ב 4 ° צ' עד שבוע אחד.</li>
	<li>בחר מושבה אחת מצלחת פטרי עם לולאה סטרילית או מקל עץ, האיחסן אותו לתוך 2 מ"ל ליברות בינונית, ו דגירה את התרבות לרוויה בן לילה (16 – 18 h) ב 37 ° c בתוף רולר להגדיר ב 100 rpm.</li>
	<li>Pipet 5 μL של תרבות לילה משלב 2.4 באמצעות P20 pipet ובמקום במרכז צלחת אגר שורצים על ידי מתקרב טיפ pipet בזווית (10-45 °) 2.5 ס מ מעל אזור האיתור, ליטוף למטה אל התחנה הראשונה, ולגעת אגר עם רק טיפה נוזל (איור 1B).<ol>
<li>להימנע מלגעת אגר עם טיפ pipet כפי שהוא פוגע אגר. השתמש בתבנית כדי למקם את הספוט בעקביות בלוחות שונים של שורצים (איור משלים S1).</li>
		<li>עבור שורצים מסורתיים, השתמש רק במקום המרכזי ולדלג לשלב 2.8. עבור תגובת הלחץ הקולקטיבי אומר להמשיך שלב 2.6 (עבור זיהום phage) או צעד 2.7 (עבור לחץ אנטיביוטי).</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור זיהום phage, מערבבים 30 μL של תרבות לילה של P. aeruginosa משלב 2.4 עם 6 μl של 1 x 1012 pfu/mL phage DMS3vir20. . המשך מיד לשלב הבא<ol>
<li>Pipet 6 μL של P. aeruginosa-phage התערובת משלב 2.6 באמצעות P20 pipet וספוט ב 6 עמדות לווין מרחוק ברדיוס 2.8 ס מ מעגל קונצנטריים זה ממורכז בצלחת פטרי על ידי מתקרב את הטיפ pipet בזווית (10 כדי 45 °) 2.5 ס מ מעל אזור האיתור, מלטף עד התחנה הראשונה, ונוגע באגר רק עם טיפת נוזל (איור 1ג).</li>
		<li>להימנע מלגעת אגר עם טיפ pipet כפי שהוא פוגע אגר. השתמש בתבנית ציפוי לצורך עקביות (איור משלים S1). . המשך לשלב 2.8</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור טיפולים אנטיביוטיים, מערבבים 30 μL תרבות לילה P. aeruginosa משלב 2.4 עם 6 μl של 3 מ"ג/ml בג, 10 μl של 100 Mg/ml, או 7.5 μl של 100 Mg/ml fosfomycin. . המשך מיד לשלב הבא<ol>
<li>Pipet 6 μL של אנטיביוטיקה שטופלו P. aeruginosa משלב 2.7 באמצעות מP20 ובמקום 6 עמדות לווין ברדיוס 2.8 ס מ במעגל מעגלי על מרכז המנה על ידי מתקרב את הטיפ pipet בזווית (10 כדי 45 °) 2.5 ס מ מעל אזור האיתור, מלטף עד התחנה הראשונה, ונוגע באגר רק עם טיפת נוזל (איור 1ד).</li>
		<li>להימנע מלגעת אגר עם טיפ pipet כפי שהוא פוגע אגר. השתמש בתבנית ציפוי לצורך עקביות (איור משלים S1). . המשך לשלב 2.8</li>
	</ol>
</li>
	<li>החליפו את עפעפיו הצלולים בעפעפיים שחורים שנעשו בשלב 1.9 (איור 2א).</li>
	<li>מניחים את לוחיות המים על הסורק בחממה שנקבעה ב 37 ° c עם אמבטיה של 10 מטרים כדי לשמור על לחות ב 75% (איור 1E, איור 2ב). התראה: לא להפריע בתאי הבחין על צלחות שורצים באגר. . לשמור על הצלחות מופנות כל הזמן</li>
</ol>3. רכישת תמונה באמצעות סורק
<ol><li>הפחת את תאורת הסביבה של מנות פטרי על-ידי הצמדת בד מאט שחור לארון תקשורת 40-60 ס מ מעל סורק המסמך. אבטח אותו באמצעות מיקוד (איור 2ב').</li>
	<li>הסורק יהיה נשלט באמצעות תוכנת סריקה ותוכנת scripting אוטומטית.<ol>
<li>בתוכנת הסריקה, בחר את מצב הבית (איור 3א). לכידת תמונות בצבע על-ידי בחירת צבע תחת סוג תמונה. כדי להגדיר את איכות התמונה, בחר באפשרות אחרת תחת יעד והתאם את הרזולוציה ל-300 dpi. שמור את גודל התקן עבור התמונות על-ידי בחירה במקור עבור גודל היעד. השאר את כל האפשרויות תחת התאמות תמונה לא מסומנת עבור איכות תמונה סטנדרטית. הערה: גודל היעד מוגדר כמקורי כברירת מחדל. כדי לבחור אפשרויות אחרות עבור ' גודל יעד ', לחץ על התצוגה המקדימה הראשונה.</li>
	</ol></li>
	<li>הגדר את נתיב השמירה של תמונות על-ידי לחיצה על סמל התיקייה מימין לסריקה כדי לפתוח את ' הגדרות שמירת קובץ ' (איור 3A).<ol>
<li>בחר את יעד התיקיה לשמירת תמונות על-ידי בחירה באפשרות אחרת תחת מיקום ולחץ על עיון. בחרו תיקייה לשמירת התמונות.</li>
		<li>נקוב בשמות התמונות בתיבת המלל ' קידומת '. הגדר את התחל מספר 001 כדי להתחיל רצף שמות עבור התמונות. הגדר את תבנית הקובץ ל-JPEG על-ידי בחירה ב-JPEG (*. jpg) עבור סוג תחת תבנית תמונה ולחץ על אפשרויות כדי להתאים לפרטים. הגדר את איכות תבנית התמונה על-ידי התאמת רמת הדחיסה ל-16, קידוד ל-Standard ובדוק את פרופיל ICC. לחץ על אישור כדי לסגור את החלון (איור 3ב).</li>
		<li>השאר את האפשרות הראשונה שאינה מסומנת ("החלף קבצים באותו שם") ובדוק את 3 האפשרויות הבאות ("הצג תיבת דו-שיח זו לפני הסריקה הבאה", "פתיחת תיקיית תמונה לאחר הסריקה", ו-"הצג את תיבת הדו הוספת דף לאחר הסריקה"). לחץ על אישור כדי לסגור את החלון</li>
		<li>בדוק את איכות התמונה על-ידי לחיצה על תצוגה מקדימה. חלון התצוגה המקדימה מופיע וסמל הסריקה הופך לפונקציונלי (איור 3ג).</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש בתוכנת ה-scripting כדי להפוך את רכישת התמונה לאוטומטית. הסקריפט שסופק לוחץ על סריקה בחלון סריקה ובסדר בחלון הגדרות שמירת הקבצים במרווחי זמן של 30 דקות.<ol>
<li>יבא את קובץ ה-script על-ידי לחיצה על פעילות | יבא ובחר הן את Single_scan. צק וIdle_scanning. צק (קבצים שסופקו כקבצים משלימים 1 ו-2). ראה איור 3ד. הערה: Single_scan. צק לוחץ על לחצן הסריקה בחלון הסריקה ואישור בחלון הגדרות שמירת הקובץ. . Idle_scanning מפעיל Single_scan כל 30 דקות אפשר לשנות את תדר הסריקה על ידי שינוי ההפעלה של Idle_scanning. צק</li>
		<li>אפשר סריקה אוטומטית במרווחי זמן של 30 דקות על-ידי בחירה הן בסריקת סרק (מיובאות) והן בסריקה אחת (מיובאות), לחיצה ימנית על סריקת סרק (מיובאת), ולחיצה שמאלית על זמינה (איור 3ד, איור משלים S2). הערה: סריקה אוטומטית מופעלת עד שהמשתמש מפסיק ידנית את קובץ ה-script. כדי לעצור את קובץ ה-script, בחר בסריקת סרק (מיובאת), לחץ לחיצה ימנית על סריקת סרק (מיובא)ולחץ על הלחצן השמאלי זמין. סימן הביקורת יוסר.</li>
	</ol></li>
</ol>4. הידור זמן-תמונות לשגות ומדידת הדחייה נחיל
<ol><li>בצע עריכת סרטים וניתוח תמונות באמצעות ImageJ.</li>
	<li>יבא את כל התמונות הסרוקות ל-ImageJ על-ידי לחיצה על קובץ | יבא | רצף תמונות ובחר את התמונות. בחלון אפשרויות רצף , בדוק את ההמרה ל-RGB כדי לשמור את התמונות בצבע. ספר התמונות מציין את מספר התמונות שנבחרו.</li>
	<li>שמור על התמונה ב-1 כדי להתחיל מהתמונה הראשונה בתיקיה ושנה את גודל התמונות ב-100% כדי לשמר את הגודל המקורי של התמונות. השאר את השימוש במחסנית וירטואלית לא מסומנת. לחץ על אישור והמתן לטעינת תמונות (איור 4א).</li>
	<li>להגדיר את רמת דחיסת הווידאו כדי 100 על ידי לחיצה על עריכה | אפשרויות מסוימות | קלט/פלט. .. ולהתאים את איכות JPEG ל 100.</li>
	<li>שמור את הקובץ כ. avi על ידי לחיצה על הקובץ | שמירה בשם | אבי. התאם דחיסה ל-JPEG ולקצב מסגרות ל-5 fps (איור 4ב). שמור את שעון ה-. avi בתיקייה הרצויה.</li>
	<li>כדי לכמת מרחקים דחייה, פתח תמונה לקראת סוף התקופה השורצים ב-ImageJ. לחץ על הקובץ | פתח ובחר את התמונה. להתאים את הסולם על ידי לחיצה על לנתח | קביעת קנה מידה והגדרת מרחק בפיקסלים ל-118, מרחק ידוע ל-1, יחס רוחב-גובה של פיקסל ל-1.0, ויחידת אורך ל-cm (איור 4ג). השאר את הכלל לא מסומן. לחץ על אישור כדי לסגור את החלון.</li>
	<li>לחץ על הסמל ישר ולמדוד ממרכז המושבה בעמדת לווין לקצה של האוכלוסייה שורצים. בחר באפשרות ' נתח ' | מידה כדי להפוך חלון חדש להופיע עם המידות (אורך) (איור 4D). הערה: השתמש ב-"+" כדי להגדיל את התצוגה הקרובה ו-"-" כדי להתרחק.</li>
</ol>

<ol><li>Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+and+mobility+protect+swarming+bacteria+against+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).</li>
<li>Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility%3A+a+multicellular+behaviour+conferring+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance.</a> Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).</li>
<li>Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+a+complex+adaptation+leading+to+increased+production+of+virulence+factors+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance.</a> Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).</li>
<li>Yeung, A. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators%2C+including+MetR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li>
<li>Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+physiochemical+properties+of+mucus+in+the+protection+of+the+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium.</a> The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).</li>
<li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li>
<li>Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aD%C3%A9ziel%2C+E+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).</li>
<li>Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+implications+on+rhamnolipid+biosurfactant+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Genetic+Engineering+Reviews%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production.</a> Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).</li>
<li>Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+dependent+on+cell-to-cell+signaling+and+requires+flagella+and+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili.</a> Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).</li>
<li>Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+forms+spreading+dendrites+that+have+characteristics+of+active+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility.</a> Scientific Reports. 5, 17698(2015).</li>
<li>Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotaxis+system%2C+but+not+chemotaxis%2C+is+essential+for+swarming+motility+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Tremblay, J., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li>
<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+imaging%2C+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338(2015).</li>
<li>Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plate-based+assay+for+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).</li>
<li>Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li>
<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+dependent+alkyl+quinolone+signaling+responses+to+antibiotics+in+Pseudomonas+aeruginosa+swarms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).</li>
<li>Bru, J. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PQS+produced+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+stress+response+repels+swarms+away+from+bacteriophage+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li>
<li>van Kessel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PQS+signaling+for+more+than+a+quorum%3A+the+collective+stress+response+protects+healthy+Pseudomonas+aeruginosa+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li>
<li>Zegans, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+bacteriophage+DMS3+and+host+CRISPR+region+inhibits+group+behaviors+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).</li>
<li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PloS One. 6 (6), 20888(2011).</li>
<li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Environmental+Factors+Influence+the+Importance+of+the+Phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+Swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).</li>
<li>Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Metabolic+and+Quorum+Sensing+Signals+Governing+the+Decision+to+Cooperate+in+a+Bacterial+Social+Trait%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait.</a> PLoS computational biology. 11 (5), 10004279(2015).</li>
<li>Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+surface-associated+group+behaviors+by+individual+amino+acids+through+c-di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling.</a> Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול זה מתמקד בצמצום השונות בלוחות שורצים באגר ומספק שיטה פשוטה ובעלות נמוכה לרכישת תמונות בזמן של P. aeruginosa שורצים ומגיבים ללחץ. הליך זה ניתן להרחיב את התמונה מערכות בקטריאלי אחרות על ידי התאמת הרכב התקשורת ותנאי גדילה. עבור P. aeruginosa, למרות M9 או בינוני מינימלי FAB יכול לשמש כדי לגרום שורצים16,21, הפרוטוקול המוצג כאן משתמש M8 medium עם חומצות קמינו, גלוקוז, ו מגנזיום סולפט6. P. aeruginosa שורצים רגי...

שורצים היא צורה קולקטיבית של תנועתיות בקטריאלי מתואמת המגביר עמידות לאנטיביוטיקה והפקת גורמי התקפה אלימה במחשב המארח1,2,3. התנהגות זו רב-תאיים מתרחשת על משטחים חצי מוצקים הדומים לאלה של שכבות ריריות המכסים ממברנות אפיתל בריאות4,5. ביוסוררים מיוצרים בדרך כלל על ידי אוכלוסיות שורצים כדי להתגבר על מתח פני השטח על משטחים ועל הייצור של אלה מוסדר על ידי תא התא מורכב איתות מערכות, הידוע גם כ-quorum חישה6,7,8. מינים רבים של חיידקים מסוגלים שורצים, כולל הפסאודומונס aeruginosa, סטייהולוקוקוס האוראוס, ואסאנכיה קולי9,10,11,12. דפוסי השמון שנוצרו על ידי חיידקים הם מגוונים ומושפעים התכונות הפיזיות והכימיות של שכבת פני השטח כולל הרכב מזינים, פורמים, ולחות13,14. בנוסף למאפייני פני השטח, טמפרטורת הצמיחה ולחות הסביבה משפיעים על מספר היבטים של שורצים, כולל שיעור שורצים ודפוסים12,13,14,15. משתני הצמיחה המשפיעים על שורצים ליצור אתגרים המשפיעים על התוכסות ניסיוני ואת היכולת לפרש את התוצאות. כאן, אנו מתארים שיטה סטנדרטית פשוטה כדי לפקח על הדינמיקה של נחילי בקטריאלי דרך הדמיה זמן לשגות. השיטה מתארת כיצד לשלוט בתנאי גדילה קריטיים המשפיעים באופן משמעותי על ההתקדמות של שורצים. בהשוואה לשיטות מסורתיות של ניתוח נחיל, זו שיטת הדמיה הזמן מאפשר לעקוב אחר תנועתיות של נחילים מרובים במקביל במהלך פרקי זמן ארוכים עם רזולוציה גבוהה. היבטים אלה משפרים את עומק הנתונים שניתן להשיג מהנחילים לניטור ולהקל על זיהוי גורמים המשפיעים על שורצים.
שורצים P. aerginosa הוא הקלה דרך הייצור ושחרורו של הרחמנויפידים ו-3-(3-הידרוקסילואנוק) חומצות אלקאנומית לאזור שמסביב6,16. המבוא של לחץ מתוך ריכוזי תת קטלני של אנטיביוטיקה או זיהום על ידי וירוס phage משפיע על הארגון של נחילים. במיוחד, הלחצים האלה לגרום P. aeruginosa לשחרר את מולקולה חישה 2-הפלטיל-3-הידרוxy-4-quinolone, הידוע גם בשם האות הפסאודומונס quinolone (pqs)17,18. בתוך הנחיל אומר כי מכילים שתי אוכלוסיות של נחילים, PQS המיוצר על ידי האוכלוסייה הנגרמת לחץ דוחה נחילים מטופל מלהיכנס לאזור המכיל את הלחץ (איור 1). תגובת הדחק הקולקטיבית מהווה מערכת מסוכנת לתקשורת איתות המזהירה את P. aeruginosa על איומים סמוכים18,19. השפעת הלחץ על P. aeruginosa, הפעלת תגובת הלחץ הקולקטיבי, ואת הדחייה של נחילים ניתן לדמיין באמצעות שיטת הדמיה בזמן שתוארה כאן. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד: (1) להכין צלחות אגר עבור שורצים, (2) תרבות P. aeruginosa עבור שני סוגים של בחני (שורצים מסורתיים או תגובת הלחץ קולקטיבית התגובה) (איור 1), (3) לרכוש תמונות זמן, ו (4) להשתמש imagej לקמפל ולנתח את התמונות
בקצרה, P. aerginosa מן התרבות לילה הוא הבחין באמצע הלוח שורצים בזמן P. aeruginosa כי הם נגועים phage או מטופלים עם אנטיביוטיקה מאותרת בעמדות לווין. ההתקדמות של P. aeruginosa שורצים מנוטרים על מסמך הצרכן סורק שנמצא ממוקם בתוך לחות מוסדר 37 ° c אינקובטור. הסורק נשלט על ידי תוכנה שסורקת באופן אוטומטי את הצלחות במרווחי זמן קבועים על תקופת הצמיחה נחיל, בדרך כלל 16 – 20 h. שיטה זו מפיקה במקביל סרטוני וידאו של עד 6 10 ס"מ לוחות שורצים. התמונות מצולמות בסרטים והדחייה של הנחילים על ידי אוכלוסיות מוחלשות מקוונזת באמצעות תוכנת ImageJ זמינה באופן חופשי. שיקול מיוחד ניתן כדי להבטיח עקביות והתמדה בין ניסויים שורצים שונים.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגר בקטו, מיובש</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td>לצלחת LB-אגר וצלחת אגר נחיל</td></tr><tr><td>חומצות קסמינו</td><td>BD Difco</td><td>223050</td><td>למדיה נחילה</td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>פישר כימיקל</td><td>D16500</td><td>דקסטרוז. למצעי נחילים</td></tr><tr><td>מלח דיסודיום Fosfomycin</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>F0889</td><td>ריכוז מלאי: 200 מ"ג/מ"ל. מומס ב-ddH2O</td></tr><tr><td>Gentamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td>ריכוז מלאי: 3 מ"ג/מ"ל. מומס ב-ddH2O</td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>ריכוז מלאי: 100 מ"ג/מ"ל. מומס ב ddH2O</td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>עבור מרק LB וצלחות LB-agar</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>עבור נחילים מדיה</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>עבור 5x M8 מדיה</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9888</td><td>עבור 5x M8 מדיה</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי heptahydrate</td><td>פישר כימיקל</td><td>S373</td><td>עבור 5x M8 media</td></tr><tr><td>זנים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS27E.118</td><td>PA14</td></tr><tr><td>זן DMS3vir</td><td>O'Toole lab</td><td>DMS3vir20</td><td>בקטריופאג'</td></tr><tr><td>< חזק>אספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלומיניום תחמוצת נייר זכוכית</td><td>3M</td><td>150 עדין</td><td>עבור מכסים שחורים</td></tr><tr><td>בד שחור</td><td>Joann</td><td>PRD7089</td><td>בד שחור</td></tr><tr><td>שחור ספריי צבע</td><td>קרילון</td><td>5592 שחור מט</td><td>עבור מכסים שחורים</td></tr><tr><td>בקבוק Erlenmeyer Kimax</td><td></td><td>26500</td><td>250 מ"ל</td></tr><tr><td>בקבוקי אחסון זכוכית</td><td>פיירקס</td><td>13951L</td><td>250 מ"ל, 500 מ"ל, 1,000 מ"ל</td></tr><tr><td>8 אינץ' קשרי רוכסן</td><td>גרדנר בנדר</td><td>E173770</td> לחיבור כלי פטרי <td>מבד מט שחור</td></tr><tr><td>(100 מ"מ x 15 מ"מ)</td><td>פישר</td><td>FB0875712</td><td>100 מ"מ x 15 מ"מ לוחות פוליסטירן</td></tr> מקלות <tr><td>עץ</td><td>פישר</td><td>23-400-102</td><td>לפסים וחיסון חיידקים</td></tr> <tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שוק החיטוי</td><td>Forge Industries</td><td>STM-E</td><td>לעיקור ריאגנטים</td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפטה</td><td>ארה"ב Scientific, Inc.</td><td>1072-5410</td><td>לפיפט 20 מ"ל לנחיל צלחות אגר</td></tr> מסיר <tr><td>לחות</td><td>Frigidaire</td><td>FAD704DWD 70 ליטר</td><td>לשמירה על לחות יחסית בחדר בכ-45%</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.52a</td><td>תוכנה לניתוח תמונות</td></tr><tr><td>חממה</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>לגידול חיידקים ב-37 מעלות; C</td></tr><tr><td>אמבט מים איזוטמפ</td><td>פישר</td><td>15-462-21Q</td><td>לקירור מדיה עד 55 מעלות; C</td></tr><tr><td>קולט אדים זרימה למינארי</td><td>חברת בייקר</td><td>SG603A</td><td>לייבוש צלחות</td></tr><tr><td>P-20 פיפט</td><td>גילסון</td><td>F123601</td><td>תצפית על צלחות אגר נחיל</td></tr><tr><td>בקר פיפטה</td><td>BrandTech</td><td>accu-jet</td><td>לפיפט 20 מ"ל לנחיל צלחות אגר</td></tr><tr><td>תוף רולר</td><td>ניו ברונסוויק</td><td>TC-7</td><td>לגידול חיידקים ב 100 סל"</td></tr><tr><td>ד סורק</td><td>Epson</td><td>סורק תמונות Epson Perfection V370</td><td>ללוחות הדמיה</td></tr><tr><td>תוכנת אוטומציה של הסורק</td><td>RoboTask Lite</td><td>v7.0.1.932</td><td>להדמיה פנימית של 30 דקות</td></tr><tr><td>תוכנה לרכישת תמונות סורק</td><td>Epson</td><td>v9.9.2.5US</td><td>תוכנה ללוחות הדמיה</td></tr></tbody></table>

זמן הדמיה של נחילים חיידקיים ואת תגובת הלחץ הקולקטיבי

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

שורצים היא צורה של תנועתיות פני השטח שנצפו במינים בקטריאליים רבים, כולל הפסאודומונס aeruginosa ואסאנכיה קולי. כאן, אוכלוסיות צפופות של חיידקים לנוע מעל מרחקים גדולים בקהילות בצורת tendril אופייני במהלך השעות. שורצים רגישים למספר גורמים, כולל לחות בינונית, לחות ותוכן תזונתי. בנוסף, תגובת הלחץ הקולקטיבי, אשר נצפתה ב P. aeruginosa , כי הם הדגיש על ידי אנטיביוטיקה או בקטביאג (phage), דוחה נחילים מתקרבים לאזור המכיל את הלחץ. השיטות המתוארות כאן כתובות כיצד לשלוט על הגורמים הקריטיים המשפיעים על שורצים. אנו מציגים שיטה פשוטה לפקח על שורצים הדינמיקה ואת תגובת הלחץ הקולקטיבי עם ברזולוציה גבוהה בזמן באמצעות סורק מסמך מסורק, ולתאר כיצד לקמפל ולבצע ניתוח כמותי של נחילים. שיטה פשוטה וחסכונית זו מספקת כימות מדויקת ומבוקרת היטב של שורצים ועשויים להיות מורחבים לסוגים אחרים של הצלחת הצמיחה המבוססת על לוח ומינים חיידקי.

השלבים לצמוח P. aeruginosa, להדגיש את התאים, ואת התמונה לוחות שורצים מיוצגים באיור 1. חיסלנו מושבה אחת של מסוג פראי P. aeruginosa ucbpp-PA14 המתח מצלחת lb-אגר ב 2 מ ל המרק lb לילה ב 37 ° c ו הבחין 5 μl במרכז הצלחת שורצים. הדמיה של הצלחת הזמן מגלה את הצמיחה הראשונית בצורה של מושבה במרכז ולאחר מכן מתפשטת של קנוקנות רדיאלי מן המושבה (וידאו 1). עבור תגובת הלחץ הקולקטיבי אומר, בנוסף לאיתור P. aeruginosa במרכז, 30 μl של תרבות לילה זהה מעורבב עם 6 μl של 1 x 1012<...

אנו לפרט שיטה פשוטה כדי לייצר ברזולוציה גבוהה זמן לפקיעה סרטים של פסאודומונס aeruginosa נחילים כי להגיב בקטיויוג'ה (phage) ומתח אנטיביוטי באמצעות סורק מסמך מסורק. הליך זה הוא שיטה מהירה ופשוטה לניטור שורצים הדינמיקה יכול להיות מותאם ללמוד תנועתיות וצמיחה של מינים חיידקיים אחרים.

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לייצר סרטים לשגות זמן של Pseudomonas aeruginosa שורץ וללכוד את הדחייה של נחיל על ידי בקטריופאג 'או אנטיביוטיקה. הסרטים לשגות זמן ללכוד את הדינמיקה המפורטת של התגובה שורצת אנטיביוטיקה ו bacteriophage ואת הטכניקה רק דורש dehumidifier, מחשב, אינקובטור, וסורק מסמכים. כדי להכין צלחות אגר שורצות עבור P.aeruginosa שורץ זמן לשגות הדמיה, להשתמש פיפטה 25 מיליליטר להוסיף 20 מיליליטר של פתרון אגר נוהר לכל צלחת ניסיונית 10 ס"מ קוטר פטרי.מניחים את הצלחות בערימה אחת עם מכסים במשך שעה בטמפרטורת החדר. הפעל את dehumidifier כדי להקטין את הלחות היחסית של החדר ל 40-50% כאשר אגר התגבש, לייבש את צלחות אגר שורץ במשך 30 דקות נוספות ברדס זרימה למינארית עם המכסים את הפנים כלפי מעלה ב 300 מטרים מעוקבים לדקה עם 40-50% לחות יחסית בטמפרטורת החדר. לאחר מכן אחסנו את צלחות הגר היובשות בארבע מעלות צלזיוס עד 24 שעות.עבור ציפוי אגר נוהר, להחזיק קצה פיפטה P20 טעון עם חמישה microliters מתרבות P.aeruginosa לילה בזווית 10-45 מעלות 2-1/2 ס"מ מעל מרכז צלחת שורצת אחת ולדכא את הבוכנה כדי להפסיק הראשון לגעת אגר עם טיפה נוזלית בלבד. השתמש בתבנית כדי למקם את הנקודה באופן עקבי על-פני צלחות הגר השונות. כדי לצחצח זיהום פאג', תחילה לערבב 30 microliters של P.aeruginosa בתרבות לילה עם שישה microliters של אחד פעמים 10 כדי 12 לוח להרכיב יחידות למיליליטר של פאג DMS3 vir ומיד להוסיף שישה microliters של תערובת פאג P.aeruginosa בשש עמדות לווין שקילה על 2.8 סנטימטרים קונצנטרייםהשתמש בתבנית כדי למקם את הנקודה באופן עקבי על פני צלחות אגר שונות. כדי צלחת טיפולים אנטיביוטיים, לערבב 30 microliters של P.aeruginosa בתרבות לילה עם הריכוז והנפח המתאים של אנטיביוטיקה של עניין ומיד להוסיף שישה microliters של חיידקים שטופלו באנטיביוטיקה בשש עמדות לווין שיווי משקל על מעגל רכזי רדיוס 2.8 ס"מ על מרכז המנה. השתמש בתבנית כדי למקם את הנקודה באופן עקבי על-פני צלחות הגר השונות.כאשר כל התרבויות כבר מצופה, להחליף את מכסי צלחת פטרי ברור עם מכסים שחורים בהתאמה אישית. בזהירות למקם את צלחות אגר שורץ על סורק באינקובטור להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס עם אמבט מים 10 ליטר כדי לשמור על הלחות ב 75% לאחר הצבת הצלחות לתוך הסורק, לפתוח את הקובץ ולשמור הגדרות כדי להגדיר את נתיב השמירה עבור התמונות ולחץ על סריקה וסדר במרווחים של 30 דקות. כדי להפוך את רכישת התמונה לאוטומטית, השתמש בתוכנת ה- Scripting.בחר הן סריקה לא פעילה והן סריקה בודדת ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על סריקה לא פעילה ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על זמין. בסוף הדגירה, יבא את כל התמונות הסרוקות לתוך ImageJ. בחלון אפשרויות הרצף, מספר התמונות יציין את מספר התמונות שנבחרו.המשך להפעיל את התמונה באחת כדי להתחיל מהתמונה הראשונה בתיקיה ואת תמונות קנה המידה ב- 100%כדי לשמר את הגודל המקורי של התמונות. לחצו על 'סמוי' ל-RGB כדי לשמור על צבע התמונות. השאירו את האפשרות 'השתמש בערימה וירטואלית' לא מסומנת ולחצו על הלחצן 'אשר' לטעינת התמונות.לחץ על קובץ, שמור בשם ו- AVI כדי למזג את התמונות לקובץ AVI. התאימו את הדחיסה ל- JPEG ולקצב המסגרות לחמש מסגרות לשניה. לאחר מכן שמור את זמן האחסון של AVI לתיקיית האחסון המתאימה.הדמיה לשגות זמן של מושבה אחת של P.aeruginosa מסוג פראי מצלחת אגר LB במרק LB לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו הבחין למרכז צלחת אגר שורצת מגלה צמיחה ראשונית בצורה של מושבה במרכז הצלחת המתפשטת בגידים באופן רדיני מהמושבה. נחילים נעים ממרכז צלחות הגר הנוהרים לפריפריה ונודפים על ידי אות לחץ הנפלט על ידי החיידקים שנדבקו בפאג'ים או טופלו בגנטמיצין. פאג'ים או ג'נטמיצין הבחינו לבד בעמדות הלוויין אינם גורמים לאוכלוסיות שורצות להימנע מאזורים אלה.השתמש פיפטה 25 מיליליטר כדי להבטיח כי צלחות אגר שורץ מכילים בדיוק 20 מיליליטר. חשוב גם להתאים את זמן הייבוש של הצלחת בהתאם לסביבת המעבדה. הטכניקה שלנו מאפשרת לנו לדמיין את הדפוסים הנוהרים הכוללים של אוכלוסיות אווירוגינוזה פסאודומונס.המטרה הבאה היא לפקח על תנועתיות תאים בודדת באמצעות מיקרוסקופיה של ברייטפילד.

time-lapse-imaging-bacterial-swarms-collective-stress

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הקלטה התנהגות תאיים ב Myxococcus xanthus Biofilms באמצעות זמן לשגות Microcinematography

מקור: Bru, J., et al., הדמיית זמן-lapse של נחילי חיידקים ותגובת הלחץ הקולקטיבית. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את ההליך לניתוח התנהגות הנחיל של Pseudomonas aeruginosa על ידי התבוננות בצמיחת חיידקים מתרבית מרכזית לעבר נקודות לוויין המכילות את אותה תרבית מעורבת עם אנטיביוטיקה, באמצעות מערך צלחת אגר והדמיית זמן-lapse.

התנהגות נחילים של Pseudomonas aeruginosa תחת עקה אנטיביוטית

מקור: Bru, J., et.al. הדמיית זמן-lapse של נחילי חיידקים ותגובת הלחץ הקולקטיבית. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים כיצד לדמיין ולמדוד התנהגות הימנעות מנחילים ב-Pseudomonas aeruginosa באמצעות בדיקת צלחת אגר נחיל. הוא מציג את ההגדרה להדמיית זמן-lapse בתנאים מבוקרים ומסביר כיצד אותות מתח הנגרמים על ידי אנטיביוטיקה מכוונים מחדש את תנועת החיידקים, אשר מכומתת באמצעות ניתוח תמונה.

הדמיה וכימות תגובות הימנעות מנחילים ללחץ אנטיביוטי ב-Pseudomonas aeruginosa

מקור: Morales-Soto, N. et al., הכנה, הדמיה וכימות של מבחני תנועתיות פני השטח של חיידקים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים בדיקת נחיל באמצעות חיידקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לצפות בתנועתיות פני השטח על אגר רך. הדמיית זמן-lapse לוכדת התרחבות מתואמת והיווצרות קנוקנות, ומדגישה את תנועתיות פני השטח של החיידקים.

בדיקת נחיל להמחשת תנועתיות פני השטח של חיידקים

מקור: Cayron, J., et al. ניתוח רב-ממדי של צמיחת חיידקים תחת טיפולי לחץ. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים כיצד להכין ולהשתמש בצלחת מיקרופלואידית להדמיית תאי חיידקים בתנאי עקה. הוא מתאר את תהליך החדרת תרבית חיידקים ומדיום אנטיביוטי מעורר מתח, ואחריו העמסת תאים והתקנה מיקרוסקופית. לאחר מכן משתמשים בהדמיית זמן-lapse במצב ניגודיות פאזה כדי לצפות בהתפתחות של תאים מוארכים וחוטיים עם תכולת DNA מוגברת עקב חלוקת תאים מעוכבת.

ניתוח מיקרוסקופי של גידול חיידקים תחת לחץ באמצעות תאים מיקרופלואידיים

מקור: Guo, S., et al. כימות תנועתיות נחיל פני השטח של חיידקים על לוחות שיפוע משרה. J. Vis. Exp. (2022).סרטון זה מדגים את השימוש בצלחת נחיל שיפוע דו-שכבתית כדי לחקור התנהגות נחיל חיידקים בריכוזי מעכבים משתנים. צלחת עם מעכב יוצר שיפוע בשכבה התחתונה מחוסנת בחיידקים ומודגרת. התמונות מצולמות במרווחי זמן קבועים כדי לנתח את השפעת ריכוז המעכבים על נחיל חיידקים.

הערכת נחילי חיידקים באמצעות לוחית מעכב שיפוע

ScanLag היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה למדידת העיכוב בצמיחה, כלומר זמן השהיה, כמו גם קצב הצמיחה של מושבות עבור אלפי תאים במקביל. סינון באמצעות ScanLag מאפשר הבחנה בין זמן פיגור ארוך לצמיחה איטית ברמה של וריאנט בודד.

ScanLag: כימות תפוקה גבוהה של המושבה צמיחה ול&quot;ג בזמן

פרוטוקול זה מאפשר תיאור בזמן הפתרון של גידול חיידקי בתנאי לחץ בתא בודד ואת רמות האוכלוסייה התא.

רב היקף ניתוח של צמיחה חיידקים תחת טיפולי סטרס

פנוטיפים של צמיחת שמרים נמדדים במדויק באמצעות הדמיה מקבילה מאוד של תאים משותקים הגדלים למיקרוקולוניות. במקביל, ניתן לעקוב אחר עמידות ללחץ, ביטוי חלבון ולוקליזציה של חלבונים, וליצור ערכות נתונים משולבות כדי לחקור כיצד הבדלים סביבתיים וגנטיים, כמו גם הטרוגניות של ביטוי גנים בקרב תאים איסוגניים, מווסתים את הצמיחה.

הדמיה חיה בעלת תפוקה גבוהה של מיקרוקולוניות למדידת הטרוגניות בצמיחה ובביטוי גנים

בכתב יד זה, אנו מספקים פרוטוקול מקיף להערכת הישרדות אנטיביוטיקה עבור Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus, הפיכת פלסמידים ל - P. aeruginosa ו- S. aureus כדי ליצור זני כתב ולדמיין וריאנטים פנוטיפיים, כגון מתמידים, על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר.

הדמיית מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר של Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus פנוטיפים הטרוגניים

למד ליצור סרטי טיים-לאפס ברזולוציה גבוהה של נחילי Pseudomonas aeruginosa בתגובה לבקטריופאג'ים ואנטיביוטיקה. השיטה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר דינמיקת הנחיל וניתוח התנהגות חיידקית.

זמן הדמיה של נחילים חיידקיים ואת תגובת הלחץ הקולקטיבי

גלה סרטונים נוספים