הדמיה חיה של מחזור החיים של החיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצני זמן לשגות

מוצג כאן פרוטוקול המתאר ניטור של מחזור החיים המלא של חיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצני זמן לשגות בשילוב עם כרית agarose ומנות הדמיה תא.

הדמיה חיה-תא Bdellovibrio בקטריובורוס כבר מאתגר בשל מחזור החיים המורכב של חיידקים טורפים אלה. הפרוטוקול שלנו מאפשר ניטור של שלבי מחזור החיים המלא בזמן אמת. למרות שהפרוטוקול שלנו מבוסס על זני שוויון ספציפיים, הוא עשוי להיות מותאם בקלות למגוון זנים חיידקיים כולל זנים פתוגניים.

כדי להקים תרבות B.bacteriovorus, לשלב מיליליטר אחד של חיידקים מתורבתים טריים 24 שעות ביממה עם שלושה מיליליטר של תרבות טרף לילה בבקבוק 250 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר של חיץ היפים סידן בתוספת אנטיביוטיקה לפי הצורך. לאחר דגירה של 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס ו 200 מהפכות לדקה, לבדוק כי תאי הטרף כבר lysed באופן מלא על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פנים רכוב נוזלי. תאים רבים של B.bacteriovorus מרובי התקפה צריכים להיות נוכחים ואין תא E.coli או bdelloplast צריך להיות גלוי.

מסננים את תרבות B.bacteriovorus באמצעות מסנן בגודל נקבובית 0.45 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר ולהשעות את הסינון בצנטריפוגה. ואז להשעות מחדש את גלולת B.bacteriovorus בשלושה מיליליטר של חיץ היפים סידן לצפיפות אופטית סופית ב 600 ננומטר של כ 0.2 ו דגירה החיידקים ב 30 מעלות צלזיוס ו 200 מהפכות לדקה במשך 30 דקות. כדי להכין את התאים המארחים, בחר מושבה אחת מן הזן המארח של עניין כדי להנהן את החיידקים ב 10 מיליליטר של מדיום YT בתוספת אנטיביוטיקה לפי הצורך עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 180 מהפכות לדקה.

למחרת בבוקר להעביר שני מיליליטר של תרבות הלילה למבחנה שני מיליליטר ו גלולה התאים על ידי צנטריפוגה. ואז להשעות מחדש את גלולה ב 200 microliters של חיץ היפים סידן. חשוב מאוד להשעות מחדש את כל גלולת התא לאחר צנטריפוגה כדי לוודא שתא הטרף מופרד ברמת התא הבודד.

כדי להכין את התאים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית לשגות בזמן, הראשון, לערבב 200 מיליגרם של כיתה מולקולרית פלואורסצנטי נמוך agarose עם 20 מיליליטר של חיץ היפים סידן ולהמיס את התעוררות במיקרוגל. יוצקים שלושה מיליליטר של אגרוז נמס לתוך צלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר ולאפשר אגרוז להתגבש. באמצעות מרית מיקרו מעבדה, להסיר בזהירות את כרית agarose מן המנה מבלי להפריע את הקוטב המרכזי של כרית מניחים את הצד התחתון כרית על כיסוי צלחת פטרי.

מניחים חמישה מיקרוליטרים של ההשעיה מרוכזת תא המארח על כרית הפוכה ולהשתמש לולאת חיסון כדי להפיץ תאים בקוטב המרכזי. לאחר מכן להוסיף חמישה microliters של השעיה מרוכזת B.bacteriovorus על פני השטח מצופה התא המארח מבלי להתפשט במהירות להחזיר את הג'ל לצלחת התחתונה 35 מיליליטר זכוכית בצד העליון למטה. ואז לכסות את המנה עם מכסה.

למיקרוסקופיית Time-Lapse Florescence של תרבות השיתוף, מניחים את המנה במחזיק צלחת פטרי כך שהמנה לא תזוז במהלך הניסוי ותמקם טיפה אחת של שמן טבילה על מטרת המיקרוסקופ ההפוך וירידה אחת בתחתית המנה. הר את המחזיק על שלב המיקרוסקופ בתוך תא המיקרוסקופ ההפוך ובתוכנות המיקרוסקופ הגדר את ההגדלה ל- 100X ואת עדשת הפוליכרום ל- GFP ו- Mcherry. באמצעות IPS בברייטפילד, לאתר את המטוס המוקד ולפתוח את המנהל חסר טעם.

הזז את הבמה ולהשתמש בלחצן נקודות סימון כדי לאחסן את הקואורדינטות של לפחות 10 עמדות עניין. העבר את val המצלמה מ IPS לצג. הגדר את מישור המוקד ולחץ על לחצן נקודת ההחלפה בחוסר הטעם למנהל כדי לכייל כל נקודה.

פתח את מעצב הניסויים וסמן תיבת ערימת מחלות. בחר את הערוצים הפלורסנטיים המתאימים ואת הגדרות האי כלילה אופטימלית ולהגדיר את המרווחים בין רכישת התמונה ואת הזמן הכולל של הניסוי. אפשר תחזוקת מוקד עבור המיקומים שנבחרו ובחר את תיקיית הנתונים שבה יש לשמור את קבצי התמונה באופן אוטומטי.

בדוק מחדש את כל ההגדרות בבקרת תוכנת המיקרוסקופ והתחל את ניסוי לשגות הזמן. לאחר השעה הראשונה של הניסוי, בדקו שכל עמדות הבמה עדיין בפוקוס. כאשר הניסוי לשגות זמן הוא סיים, להסיר את צלחת פטרי להשליך את המנה 35 מילימטר עם כרית אגרוז על פי פרוטוקולי ביו בטיחות המתאימים.

לעיבוד נתוני התמונה לשגות בזמן, להעביר את הנתונים הניסיוניים למחשב טעון עם תוכנת פיג'י ולפתוח תמונה בפיג'י. באפשרויות ייבוא בתבניות ביולוגיות, בחר מחסנית תצוגה עם היפר-סטאק. במצב צבע ללא הפרדות צבע, בחר שינוי גודל אוטומטי.

על ידי גלילה בערימות התמונה להעריך אם התאים bdelloplasts נשאר להתמקד במהלך הניסוי. האם כתמי הפלואורסצנטי הירוקים מהדנ"א וירוק ה-mNeon נמצאים בתאי B.bacteriovorus בתוך bdelloplasts לאורך כל שלב הצמיחה והאם ניתן לדמיין את כל שלבי מחזור החיים הטורף. כדי לנתח B.bacteriovorus תא bdelloplast מסוים, להשתמש בכלי בחירה כדי לסמן את התא של עניין.

לאחר מכן שכפל את האזור הנבחר. בתמונה המשוכפלת, לחצו על 'תהליך' ו'חלק' ולכל ערוץ פלואורסצנטי לחצו על תמונה, צבע, כלי ערוצים ובחרו בערוץ המעניין. לאחר מכן לחצו על חדות תמונה, כוונון ובהירות כדי להתאים את הבהירות והניגודיות של התמונה בכל ערוץ.

להוספת סרגל קנה מידה, בחרו 'נתח', 'כלים' ו'סרגל שינוי קנה מידה'. להוספת חותמת זמן לתמונות, לחצו על 'תמונות', 'ערימות' ו'חותמת זמן'. לשמירת התמונות ששונו, בחרו TIF.

לשמירת הנתונים כרצף תמונות, AVI להפקת סרט או PNG לשמירת תמונה בודדת של המסגרת הנוכחית. מערכת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תאי B.bacteriovorus בודדים ומספקת מידע רב ערך על כל שלב של מחזור החיים הטורף המורכב. היתוך mCherry גלולות מאפשר התא הטורף כולו להיות מסומן בשלב ההתקפה, כמו גם בשלב מוקדם של שלב הצמיחה.

המעבר מההתקפה לשלב השכפול יכול להיות חזותי לא רק על ידי היווצרות bdelloplast המארח, אלא גם על ידי המראה של השיבה. השיבה מורכבת בקוטב התא הפולש ויותר מתשיב אחד ניתן לראות בתוך סיסם B.bacteriovorus גדל ככל שלב הרבייה מתקדם. לאחר מספר עותקים של הכרומוזום מסונתזים, השכפול הסתיים.

לבסוף, התסיסה הרב-גרעינית עוברת ספיגה והתאים הצאצאים משתחררים מהלדלופלסטיק. התאים B.bacteriovorus צריך להיות חומר מספיק כדי לחפש באופן פעיל את הטרף שלהם ואת צפיפות התא כולו צריך להיות גבוה מספיק כדי לאפשר חיבור תא טורף. פלטפורמה זו עשויה להיות שימושית בניסויים מעורבים פתוגנים עמידים לתרופות מרובות כדי להקל על שיפורים בהנדסה הגנטית של B.bacteriovorus כמו אנטיביוטיקה בחיים ברפואה האנושית והווטרינרית.