Name: הדמיה חיה של מחזור החיים של החיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצני זמן לשגות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: למדו לעקוב אחר מחזור החיים המורכב של החיידק הטורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה זמן-אמת. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה באינטראקציות טורף-טרף וניתוח התנהגות תאית בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק מרכז המדע הלאומי אופוס 2018/29/B/NZ6/00539 לג'יי.זי.סי.

1. הכנת ב. בקטריובוס לניתוח מיקרוסקופי
<ol><li>בקבוקון 250 מ"ל, להגדיר את coculture על ידי שילוב 1 מ"ל של תרבות בקטריובוז 24 h רענן (למשל, HD100 DnaN-mNeonGreen / PilZ-mCherry) ו 3 מ"ל של תרבות טרף לילה (למשל, E. coli S17-1 pZMR100) עם 50 מ"ל של מאגר Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 מ'מ CaCl2 [pH = 7.6]) בתוספת עם אנטיביוטיקה בעת הצורך (כאן, 50 μg/ mL kanamycin).</li>
	<li>דגירה coculture במשך 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד.</li>
	<li>ודא כי תאי הטרף הם lysed באופן מלא על ידי מיקרוסקופית פאזה רכוב נוזלי. בשלב זה, מספר רב של תאי התקפה מוטיב שלב B. bacteriovorus צריך להיות נוכח, ולא תא E. coli או bdelloplast צריך להיות גלוי.</li>
	<li>סנן את תרבות B. bacteriovorus באמצעות מסנן גודל נקבוביות 0.45 μm כדי להסיר את כל התאים המארחים הנותרים. תאים טורפים (0.3-0.5 μm x 0.5–1.4 μm) חודר בחופשיות 0.45 μm נקבוביות, בעוד תאים מארחים נשמרים על פני המסנן.</li>
	<li>סובבו את הסינון למשך 20 דקות ב-2469 x g ו-30°C בצינור חרסי של 50 מ"ל לאיסוף תאים טורפים. תחשוף מחדש את גלולת החיידק B. bacteriovorus ב- 3 מ"ל של מאגר Ca-HEPES (עד ODסופי 600 של כ 0.2) ולדגור ב 30 ° C ו 200 סל"ד במשך 30 דקות.</li>
</ol>2. הכנת תאים מארחים לפלישה ב. בקטריובוס
<ol><li>השתמש במושבה אחת של זן המארח(E. coli S17-1 pZMR100 מומלץ בשל גדלים שונים של תאים וכתוצאה מכך היווצרות של bdelloplasts בגודל לא שווה) כדי לחסן 10 מ"ל של YT בינוני (0.8% Bacto tryptone, 0.5% תמצית שמרים, 0.5% NaCl [pH = 7.5]) כי כבר בתוספת עם אנטיביוטיקה, במידת הצורך (כאן, 50 μg / מ"ל kanamycin). תאי תרבות לילה ב 37 °C ו 180 סל"ד.</li>
	<li>להעביר 2 מ"ל של תרבות E. coli לילה (OD600 של ~ 3.0) למבחן 2 מ"ל צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (RT) ו 2469 x g עבור 5 דקות. תוסתה מחדש את הכדור ב-200 μL של מאגר Ca-HEPES.</li>
</ol>3. הגדרת המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים)
<ol><li>מחממים מראש תא מיקרוסקופי עם יעד טבילה שמן פי 100 ל-30 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת לפני השימוש. שלב זה נדרש כדי למנוע שגיאות בשמירה על המיקוד במהלך הניסוי.</li>
	<li>הפעל הן את מיקרוסקופ והן אוטומציית מיקרוסקופ. אתחל את תוכנת הבקרה ובחר את המסננים המתאימים כדי לרכוש תמונות brightfield/DIC/phase-contrast ופלואורסצנציה, לפי הצורך (כאן: תמונות BF, מסנן פוליכרומי GFP/mCherry, ופליטה/ריזור עבור mCherry ו-GFP).</li>
</ol>4. הרכבה של פריסות עבור מיקרוסקופית פלואורסצנית זמן
<ol><li>לערבב 200 מ"ג של agarose כיתה מולקולרית פלואורסצנטית נמוכה עם 20 מ"ל של מאגר Ca-HEPES (1% ריכוז agarose הסופי) ולהמיס את agarose במיקרוגל. ניתן לעשות באצווה עשה בו פעולה חוזרת מספר פעמים לאחר שהיא מתגבשת, לכן פשוט חזור על שלב החימום.</li>
	<li>יוצקים 3 מ"ל של אגרוז נמס לתוך צלחת זכוכית תחתית 35 מ"מ(שולחן של חומרים). תן לאגרוז להתגבש.</li>
	<li>באמצעות מיקרו מרית מעבדה, בזהירות להסיר את כרית agarose מצלחת 35 מ"מ מבלי להפריע את הקוטב המרכזי של כרית agarose. הופכים את החלק התחתון כלפי פנים כלפי למעלה וממקם אותו בכיסוי צלחת פטרי(איור 2).</li>
	<li>לשים 5 μL של מתלה E. coli מרוכז על גבי המשטח ההפוך ולהפיץ תאים בעמוד המרכזי באמצעות לולאת חיסונים. הוסף 5 μL של מתלה B. bacteriovorus מרוכז (OD600 של ~ 0.2) על פני השטח E. coliמצופה. אל תפיץ את התאים.</li>
	<li>מחזירים במהירות את ג'ל אגרוז לצלחת 35 מ"מ עם תחתית זכוכית (בצד העליון עם הפנים כלפי מטה), ולאחר מכן מכסים במכסה. במידת הצורך, הסר את כל בועות האוויר על-ידי לחיצה בעדינות על הגאר כנגד הצלחת.</li>
</ol><img alt="תרשים הגדרת ניסוי חיידקים; צלחת פטרי, E. coli, B. bacteriovorus, מיקרוסקופ הפוך." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: תיאור סכמטי של זרימת העבודה הניסיונית. כרית agarose מוסרת מצלחת 35 מ"מ והתהפכה כך שהצד התחתון פונה כלפי מעלה. מתלים טריים של תאים טורפים ותרבות לילה של תאי טרף מונחים על המשטח ההפוך כדי לכסות את הצד ה"תחתון". כרית agarose לאחר מכן התהפך לכיוון המקורי שלה והונח בחזרה בצלחת 35 מ"מ, אשר מותקן על שלב מיקרוסקופ הפוך בתא המיקרוסקופ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
5. מוליכות של מיקרוסקופ פלואורסצני זמן לשגות
<ol><li>מניחים את צלחת ה-35 מ"מ במחזיק צלחת פטרי כך שהיא לא תזוז במהלך הניסוי. מניחים טיפה אחת של שמן טבילה (1.518 אינדקס שבירה) על המטרה, כמו גם את החלק התחתון של צלחת 35 מ"מ.</li>
	<li>הר המחזיק על השלב של מיקרוסקופ הפוך בתא המיקרוסקופ.</li>
	<li>הגדר את האפשרויות בתוכנה לבקרת מיקרוסקופ כדי לאסוף תמונות מרובות בעמדות שלב מרובות לאורך זמן.<ol>
<li>הגדר את ההגדלה (100x) ואת העדשה הפוליכרומית (GFP/mCherry). באמצעות פיסת עין ובהירפילד (BF), למצוא את מישור המוקד ולפתוח את מנהל רשימת הנקודות.</li>
		<li>בחר לפחות 10 עמדות עניין על-ידי הזזת הבמה ואחסון הקואורדינטות עבור כל מיקום בתוכנה למיקרוסקופ על-ידי לחיצה על לחצן סימן נקודה. הימנעו מעמדות הממוקמות קרוב זו לזו כדי למנוע פוטו-בליך וצילום-רעלים. סובב את שסתום המצלמה מהעין לצג וכויל כל נקודה על-ידי הגדרת מישור המוקד ולחיצה על לחצן החלף נקודה במנגנון רשימת הנקודות.</li>
		<li>פתח את מעצב הניסוי והגדר את כל הפרמטרים הניסיוניים בכל כרטיסיה באופן הבא:<ol>
<li>בטל את סימון תיבת סידור הערימה Z.</li>
			<li>בחרו ערוצי פלורסנט והגדרו את הגדרות התאורה האופטימליות. כאן נעשה שימוש בהגדרות הבאות: עבור ערוץ mCherry, ערכות מסנן mCherry (EX575/25; EM625/45), עוצמה של 50% וזמן חשיפה של 200 השנייה; עבור ערוץ GFP, סט מסנני GFP (EX475/28; EM525/48), עוצמה של 50% ו- 80 ms; ולתמונות BF, ערוץ POL, 5% עוצמה, ו 50 ms.</li>
			<li>בחר מרווחי זמן בין רכישת תמונות לבין הזמן הכולל של הניסוי. כאן, 5 דקות מרווחים בוצעו במהלך 10 שעות של הניסוי.</li>
			<li>אפשר תחזוקת מיקוד עבור המשרות שנבחרו (עבור המערכת המשמשת כאן, על-ידי סימון תיבת הסימון שמור על מיקוד עם UltimateFocus).</li>
			<li>בחר את תיקיית הנתונים שבה יש לשמור באופן אוטומטי את קבצי התמונה.</li>
			<li>בדוק מחדש את כל ההגדרות בפקד תוכנת מיקרוסקופ ולאחר מכן התחל את ניסוי הזמן- לשגות.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר השעה הראשונה של הניסוי, בדקו שכל עמדות הבמה עדיין בפוקוס. התאם את המוקד במהלך מרווחי זמן בין רכישת תמונה, במידת הצורך.</li>
	<li>עם סיום ניסוי הזמן, הסר את צלחת פטרי והשתמש בצלחת 35 מ"מ עם משטח agarose על פי פרוטוקול הבטיחות הביולוגית. הערה: כל שלד המשנה לאחר שלב 5.2 הם ספציפיים עבור משתמשי DeltaVision Elite. חוקרים המשתמשים במערכות אחרות צריכים להתאים את ההגדרות בהתאם למערכות בודדות.</li>
</ol>6. עיבוד תמונות וייצור סרטים באמצעות תוכנת פיג'י
<ol><li>העבר נתונים ניסיוניים למחשב הטעון עם תוכנת פיג'י. הפעל את תוכנית פיג'י ופתח תמונה באמצעות קובץ | פתח או פשוט על-ידי גרירה ושחרור של קובץ התמונה לתוך פיג'י.</li>
	<li>באפשרויות ייבוא בפורמטים ביולוגיים, בחר הצג מחסנית עם Hyperstack באפשרויות הצפייה בערימה, לחץ על מצב צבע מורכב באפשרויות הצבע וסמן קנה מידה אוטומטי.</li>
	<li>על ידי גלילה בין ערימות התמונה, להעריך אם התאים bdelloplasts נשאר בפוקוס במהלך הניסוי. בדוק אם כתמי פלורסנט ירוקים מ-DnaN-mNeonGreen נמצאים בתוך תאי B. bacteriovorus בתוך bdelloplasts לאורך כל שלב הצמיחה, ולהבטיח כי כל השלבים של מחזור החיים הטורף ניתן לדמיין.</li>
	<li>כדי לנתח תא B. bacteriovorus מסוים / bdelloplast, לסמן אותו באמצעות כלי הבחירה בתפריט פיג'י(מלבן, סגלגל, מצולע, או Freehand). שכפול האזור הנבחר באמצעות תמונה | שכפול או באמצעות Ctrl + Shift + D.</li>
	<li>כוונן את הבהירות והניגודיות עבור כל ערוץ פלואורסקם כדלקמן:<ol>
<li>לבחירת ערוץ בודד, פתחו את כלי הערוץ על-ידי לחיצה על תמונה | צבע | כלי ערוצים או Ctrl + Shift + Z, ובחר את ערוץ העניין(ערוץ 1: mCherry, ערוץ 2: mNeonGreen, ערוץ 3: brightfield).</li>
		<li>כוונון הבהירות והניגודיות של תמונות בערוץ הפלואורסץ על-ידי פתיחת תפריט B&amp;C בתמונה | כוונן | בהירות/חדות או על-ידי לחיצה על Ctrl + Shift + C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוספת סרגל קנה מידה באמצעות ניתוח | כלים ומידע | סרגל קנה מידה. הוסף את חותמת הזמן לתמונות על-ידי לחיצה על תמונות | ערימות | סטמפר זמן.</li>
	<li>כדי לשמור תמונות ששונו, עבור אל קובץ | שמור בשם ובחר TIFF לשמירה כרצף תמונות, AVI כדי להפיק סרט או PNG כדי לשמור תמונה בודדת של המסגרת הנוכחית.</li>
</ol>

<ol><li>Shatzkes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predatory+Bacteria+Attenuate+Klebsiella+pneumoniae+Burden+in+Rat+Lungs%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs.</a> mBio. 7 (6), (2016).</li>
<li>Iebba, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bdellovibrio+bacteriovorus+directly+attacks+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+Cystic+fibrosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 5, (2014).</li>
<li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injections+of+Predatory+Bacteria+Work+Alongside+Host+Immune+Cells+to+Treat+Shigella+Infection+in+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae.</a> Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+flagellar+filament+and+the+role+of+motility+in+bacterial+prey-penetration+by+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Predatory+Patchwork%3A+Membrane+and+Surface+Structures+of+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Microbial+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Chromosomal+Replication+in+Predatory+Bacterium+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1898(2016).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Chromosome+Replication+and+Its+Relationship+to+Predatory+Attack+Lifestyles+in+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).</li>
<li>Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadowing+the+actions+of+a+predator%3A+backlit+fluorescent+microscopy+reveals+synchronous+nonbinary+septation+of+predatory+Bdellovibrio+inside+prey+and+exit+through+discrete+bdelloplast+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores.</a> Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).</li>
<li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+D-amino-acids+reveal+bi-cellular+cell+wall+modifications+important+for+Bdellovibrio+bacteriovorus+predation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation.</a> Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).</li>
<li>Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predation+of+human+pathogens+by+the+predatory+bacteria+Micavibrio+aeruginosavorus+and+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

בשל העניין המוגבר בשימוש B. bacteriovorus כאנטיביוטיקה חיה, כלים חדשים להתבוננות במחזור החיים הטורף, במיוחד אינטראקציות טורפים-פתוגן, נדרשים. הפרוטוקול המוצג משמש למעקב אחר כל מחזור החיים B. bacteriovorus, במיוחד במהלך הצמיחה שלה בתוך המארח, בזמן אמת. יתר על כן, היישום של זן המייצר פלואורסצנט מתויג בטא מהדק של ה-DNA פולימראז השלישי הולואנזים אפשר ניטור של התקדמות שכפול כרומוזום לאורך כל שלב הרבייה של B. bacteriovorus.
שלב קריטי בשיטה זו הוא הכנה נכונה של פריסות בצלחת...

Bdellovibrio bacteriovorus הוא קטן (0.3-0.5 μm על ידי 0.5-1.4 μm) חיידק גרם שלילי הטורף חיידקים אחרים גרם שלילי, כולל פתוגנים מזיקים כגון Klebsiella דלקת ריאות, פסאודומונס aeruginosa, ו Shigella flexneri1,,2,3.3 מאז B. bacteriovorus הורג פתוגנים, הוא נחשב אנטיביוטיקה חיה פוטנציאלית שניתן להחיל כדי להילחם בזיהומים חיידקיים, במיוחד אלה הנגרמת על ידי זנים עמידים לתרופות מרובות.
ב. bacteriovorus מציג מחזור חיים מוזר המורכב משני שלבים: שלב התקפה חיים חופשיים שאינם משוכפלים ושלב רבייה תאית(איור 1). בשלב החיים החופשיים, החיידק המוטיב הזה, אשר נע במהירויות של עד 160 μm / s, מחפש את טרפו. לאחר הצמדה לממברנה החוצה של הטרף, הוא נכנס פריפלסמה4,5. במהלך שלב הרבייה הבין-פריפלסמית, ב. בקטריובוס משתמש בשפע של אנזימים הידרולטיסיים כדי להשפיל את המקרומולקולות של המארח ולהשתמש בהם מחדש לצמיחה שלו. זמן קצר לאחר הפלישה פריפלסמה, התא המארח מת ומתנפח לתוך מבנה כדורי הנקרא bdelloplast, שבו התא הטורף מארכת ושכפול כרומוזומים שלה. תהליך השכפול מתחיל במקור השכפול (oriC)6 וממשיך עד שמספר עותקים של הכרומוזום מסונתזיםלחלוטין 7. מעניין, שכפול של כל כרומוזום אינו מלווה על ידי חלוקת תאים. במקום זאת, הטורף מתעצם כדי ליצור תא ארוך, רב-גרעיני ונימה. עם דלדול תזונתי, חוט החוט עובר ספיגה סינכרונית ותאי הצבי משתחררים bdelloplast8.
לפני B. bacteriovorus יכול לשמש כאנטיביוטיקה חיה נגד זיהומים חיידקיים, זה חיוני כדי להבין את השלבים העיקריים של מחזור החיים שלה, במיוחד אלה הקשורים להתפשטותו בתוך הטרף. הדמיה חיה של ב. בקטריובוס הייתה מאתגרת, בשל הצורות המורפולוגיות השונות של הטורף וטרפו במהלך מחזור החיים המורכב. עד כה, האינטראקציות בין B. bacteriovorus והתא המארח שלה נחקרו בעיקר על ידי מיקרוסקופאלקטרונים וניתוח snap-shot 2,9,10, שניהם יש מגבלות, במיוחד כאשר הם משמשים כדי לפקח על שלביםרצופיםשל מחזורהחייםהטורף. שיטות אלה מספקות תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי B. bacteriovorus ומאפשרות התבוננות טורף קטן במהלך שלב ההתקפה או הצמיחה. עם זאת, הם אינם מאפשרים מעקב אחר תאים B. bacteriovorus יחיד לאורך שני שלבי מחזור החיים.
מוצג כאן פרוטוקול מקיף לשימוש מיקרוסקופית פלואורסצנית זמן לשגות (TLFM) כדי לפקח על מחזור החיים המלא של B. bacteriovorus. מערכת המורכבת משטח agarose משמש בשילוב עם צלחת הדמיה תא, שבו התאים הטורפים יכולים לנוע בחופשיות מתחת למשטח agarose בעוד תאי טרף משותקים מסוגלים ליצור bdelloplasts(איור 2). הגדרה זו מוכנה בהתבסס על זנים ספציפיים של חיידקי אי-קולי ו-B. bacteriovorus, אך ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כך שיתאים לזנים האישיים של המשתמש (לדוגמה, נשיאת סמני בחירה שונים, חלבונים המותכים לפלואורופורים שונים וכו').
במקרה זה, כדי לדמיין B. bacteriovorus במהלך שלב ההתקפה, זן ספציפי (HD100 DnaN-mNeonGreen / PilZ-mCherry) נבנה המבטא גרסה מתויגת פלורסנטית של חלבון cytoplasmic, PilZ (זמין במעבדה שלנו על פי בקשה)7. זן זה בנוסף מייצר DnaN (β-הזזה מהדק), תת-אחד של הולוגאנזים DNA פולימראז השלישי, התמזגו עם חלבון פלורסנט. זה מאפשר שכפול DNA מתמשך להיות במעקב בתוך התאים הטורפים כפי שהם גדלים בתוך bdelloplasts.
למרות הפרוטוקול המתואר והתוכנה המשמשים לרכישת תמונה מתייחסים מיקרוסקופ הפוך המסופק על ידי יצרן מסוים (ראה טבלת חומרים),טכניקה זו עשויה להיות מותאמת עבור כל מיקרוסקופ הפוך מצויד תא סביבתי או מחזיק חימום חיצוני אחר ומסוגל הדמיה לשגות זמן. עבור ניתוח נתונים, משתמשים יכולים לבחור כל תוכנה זמינה התואמת לתבניות פלט בודדות.
<img alt="דיאגרמת מחזור החיים של Bdellovibrio; שלבי התקפה ורבייה; תהליך פלישת חיידקים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: מחזור חיים ב. bacteriovorus ב E. coli כתא מארח. במהלך שלב ההתקפה, תא B. bacteriovorus שחיה חופשית מחפש ומתחבר לתא E. coli מארח. לאחר הפלישה, התא הטורף הופך למקומי בפריפלסמה של הטרף, משנה את צורת התא המארח ויוצר bdelloplast. שלב הרבייה מתחיל במבנה bdelloplast. התא הטורף מעכל את תא הטרף ומהשתמש מחדש בתרכובות פשוטות כדי לבנות מבנים משלו. ב. bacteriovorus גדל כתרימה אחת ארוכה בתוך פריפלסמה של המארח. כאשר המשאבים של תא הטרף מוצו, חוט החיידק B. סינכרוני ספיגה ויוצר תאים צגידים. לאחר שתאי הצולה מפתחים את הפלגלה שלהם, הם מלקטים את ה-bdelloplast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table><tbody><tr><td>צנטריפוגה</td><td>MPW MED. INSTRUMENTS</td><td>MPW-260R</td><td>רוטור נ"צ 12183</td></tr><tr><td>מוסמך ביולוגיה מולקולרית Agarose</td><td>BIO-RAD</td><td>161-3100</td><td>אגרוז פלואורסצנטי נמוך עבור כרית אגרוז</td></tr><tr><td>פיג'י</td><td>ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>חבילת עיבוד תמונה בקוד פתוח</td></tr><tr><td>צלחת תחתונה זכוכית 35 מ"מ</td><td>ibidi</td><td>81218-200</td><td>זכוכית</td></tr> <tr><td>לא מצופהמיקרוסקופ</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Microtiter Stage, מודול לייזר פוקוס אולטימטיבי, מצלמת DV Elite CoolSnap HQ2, מכלול SSI FP DV, ערכה obj. שמן Oly 100x 1.4 NA, פריזמה Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V</td></tr><tr><td>מסנן Minisart 0.45 ומיקרו; m</td><td>Sartorius</td><td>16555----------K</td><td>אצטט תאית, סטרילי, Luer Lock Outlet</td></tr><tr><td>Start SoftWoRx</td><td>GE</td><td></td><td>תוכנת הדמיה המסופקת על ידי היצרן</td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה של מחזור החיים של החיידק טורף bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצני זמן לשגות

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus הוא קטן גרם שלילי, חיידק טורף חובה שהורג חיידקים אחרים גרם שלילי, כולל פתוגנים מזיקים. לכן, הוא נחשב אנטיביוטיקה חיה. כדי להחיל B. bacteriovorus כאנטיביוטיקה חיה, זה הראשון הכרחי כדי להבין את השלבים העיקריים של מחזור החיים המורכב שלה, במיוחד התפשטותו בתוך טרף. עד כה, זה היה מאתגר לעקוב אחר שלבים רצופים של מחזור החיים הטורף בזמן אמת. מוצג כאן פרוטוקול מקיף להדמיה בזמן אמת של מחזור החיים המלא של B. bacteriovorus, במיוחד במהלך הצמיחה שלה בתוך המארח. לשם כך, מערכת המורכבת משטח agarose משמש בשילוב עם צחות הדמיה תא, שבו התאים הטורפים יכולים לנוע בחופשיות מתחת למשטח agarose בעוד תאי טרף משותקים מסוגלים ליצור bdelloplasts. היישום של זן המייצר שפעת מתויגת β-subunit של פולימראז DNA III עוד יותר מאפשר שכפול כרומוזום להיות במעקב במהלך שלב הרבייה של מחזור החיים B. bacteriovorus.

המערכת המתוארת מבוססת TLFM מאפשרת מעקב אחר תאים בודדים של B. bacteriovorus (איור 3, סרט 1) ומספקתמידע רב ערך על כל שלב במחזור החיים הטורף המורכב. היתוך PilZ-mCherry מאפשר לתייג את כל התא הטורף בשלב ההתקפה, כמו גם בשלב מוקדם של שלב הצמיחה (איור 3). המעבר מן ההתקפה לשלב משוכפל היה הדמיה לא רק על ידי היווצרות bdelloplast המארח אלא גם על ידי המראה של replisome (מכונות שכפול), אשר סומן על ידי DnaN-mNeonGreen פלואורסצנט foci<strong class="xfi...

מוצג כאן פרוטוקול המתאר ניטור של מחזור החיים המלא של חיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצני זמן לשגות בשילוב עם כרית agarose ומנות הדמיה תא.

הדמיה חיה של מחזור החיים של החיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצני זמן לשגות

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

הדמיה חיה-תא Bdellovibrio בקטריובורוס כבר מאתגר בשל מחזור החיים המורכב של חיידקים טורפים אלה. הפרוטוקול שלנו מאפשר ניטור של שלבי מחזור החיים המלא בזמן אמת. למרות שהפרוטוקול שלנו מבוסס על זני שוויון ספציפיים, הוא עשוי להיות מותאם בקלות למגוון זנים חיידקיים כולל זנים פתוגניים.כדי להקים תרבות B.bacteriovorus, לשלב מיליליטר אחד של חיידקים מתורבתים טריים 24 שעות ביממה עם שלושה מיליליטר של תרבות טרף לילה בבקבוק 250 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר של חיץ היפים סידן בתוספת אנטיביוטיקה לפי הצורך. לאחר דגירה של 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס ו 200 מהפכות לדקה, לבדוק כי תאי הטרף כבר lysed באופן מלא על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פנים רכוב נוזלי. תאים רבים של B.bacteriovorus מרובי התקפה צריכים להיות נוכחים ואין תא E.coli או bdelloplast צריך להיות גלוי.מסננים את תרבות B.bacteriovorus באמצעות מסנן בגודל נקבובית 0.45 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר ולהשעות את הסינון בצנטריפוגה. ואז להשעות מחדש את גלולת B.bacteriovorus בשלושה מיליליטר של חיץ היפים סידן לצפיפות אופטית סופית ב 600 ננומטר של כ 0.2 ו דגירה החיידקים ב 30 מעלות צלזיוס ו 200 מהפכות לדקה במשך 30 דקות. כדי להכין את התאים המארחים, בחר מושבה אחת מן הזן המארח של עניין כדי להנהן את החיידקים ב 10 מיליליטר של מדיום YT בתוספת אנטיביוטיקה לפי הצורך עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 180 מהפכות לדקה.למחרת בבוקר להעביר שני מיליליטר של תרבות הלילה למבחנה שני מיליליטר ו גלולה התאים על ידי צנטריפוגה. ואז להשעות מחדש את גלולה ב 200 microliters של חיץ היפים סידן. חשוב מאוד להשעות מחדש את כל גלולת התא לאחר צנטריפוגה כדי לוודא שתא הטרף מופרד ברמת התא הבודד.כדי להכין את התאים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית לשגות בזמן, הראשון, לערבב 200 מיליגרם של כיתה מולקולרית פלואורסצנטי נמוך agarose עם 20 מיליליטר של חיץ היפים סידן ולהמיס את התעוררות במיקרוגל. יוצקים שלושה מיליליטר של אגרוז נמס לתוך צלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר ולאפשר אגרוז להתגבש. באמצעות מרית מיקרו מעבדה, להסיר בזהירות את כרית agarose מן המנה מבלי להפריע את הקוטב המרכזי של כרית מניחים את הצד התחתון כרית על כיסוי צלחת פטרי.מניחים חמישה מיקרוליטרים של ההשעיה מרוכזת תא המארח על כרית הפוכה ולהשתמש לולאת חיסון כדי להפיץ תאים בקוטב המרכזי. לאחר מכן להוסיף חמישה microliters של השעיה מרוכזת B.bacteriovorus על פני השטח מצופה התא המארח מבלי להתפשט במהירות להחזיר את הג'ל לצלחת התחתונה 35 מיליליטר זכוכית בצד העליון למטה. ואז לכסות את המנה עם מכסה.למיקרוסקופיית Time-Lapse Florescence של תרבות השיתוף, מניחים את המנה במחזיק צלחת פטרי כך שהמנה לא תזוז במהלך הניסוי ותמקם טיפה אחת של שמן טבילה על מטרת המיקרוסקופ ההפוך וירידה אחת בתחתית המנה. הר את המחזיק על שלב המיקרוסקופ בתוך תא המיקרוסקופ ההפוך ובתוכנות המיקרוסקופ הגדר את ההגדלה ל- 100X ואת עדשת הפוליכרום ל- GFP ו- Mcherry. באמצעות IPS בברייטפילד, לאתר את המטוס המוקד ולפתוח את המנהל חסר טעם.הזז את הבמה ולהשתמש בלחצן נקודות סימון כדי לאחסן את הקואורדינטות של לפחות 10 עמדות עניין. העבר את val המצלמה מ IPS לצג. הגדר את מישור המוקד ולחץ על לחצן נקודת ההחלפה בחוסר הטעם למנהל כדי לכייל כל נקודה.פתח את מעצב הניסויים וסמן תיבת ערימת מחלות. בחר את הערוצים הפלורסנטיים המתאימים ואת הגדרות האי כלילה אופטימלית ולהגדיר את המרווחים בין רכישת התמונה ואת הזמן הכולל של הניסוי. אפשר תחזוקת מוקד עבור המיקומים שנבחרו ובחר את תיקיית הנתונים שבה יש לשמור את קבצי התמונה באופן אוטומטי.בדוק מחדש את כל ההגדרות בבקרת תוכנת המיקרוסקופ והתחל את ניסוי לשגות הזמן. לאחר השעה הראשונה של הניסוי, בדקו שכל עמדות הבמה עדיין בפוקוס. כאשר הניסוי לשגות זמן הוא סיים, להסיר את צלחת פטרי להשליך את המנה 35 מילימטר עם כרית אגרוז על פי פרוטוקולי ביו בטיחות המתאימים.לעיבוד נתוני התמונה לשגות בזמן, להעביר את הנתונים הניסיוניים למחשב טעון עם תוכנת פיג'י ולפתוח תמונה בפיג'י. באפשרויות ייבוא בתבניות ביולוגיות, בחר מחסנית תצוגה עם היפר-סטאק. במצב צבע ללא הפרדות צבע, בחר שינוי גודל אוטומטי.על ידי גלילה בערימות התמונה להעריך אם התאים bdelloplasts נשאר להתמקד במהלך הניסוי. האם כתמי הפלואורסצנטי הירוקים מהדנ"א וירוק ה-mNeon נמצאים בתאי B.bacteriovorus בתוך bdelloplasts לאורך כל שלב הצמיחה והאם ניתן לדמיין את כל שלבי מחזור החיים הטורף. כדי לנתח B.bacteriovorus תא bdelloplast מסוים, להשתמש בכלי בחירה כדי לסמן את התא של עניין.לאחר מכן שכפל את האזור הנבחר. בתמונה המשוכפלת, לחצו על 'תהליך' ו'חלק' ולכל ערוץ פלואורסצנטי לחצו על תמונה, צבע, כלי ערוצים ובחרו בערוץ המעניין. לאחר מכן לחצו על חדות תמונה, כוונון ובהירות כדי להתאים את הבהירות והניגודיות של התמונה בכל ערוץ.להוספת סרגל קנה מידה, בחרו 'נתח', 'כלים' ו'סרגל שינוי קנה מידה'. להוספת חותמת זמן לתמונות, לחצו על 'תמונות', 'ערימות' ו'חותמת זמן'. לשמירת התמונות ששונו, בחרו TIF.לשמירת הנתונים כרצף תמונות, AVI להפקת סרט או PNG לשמירת תמונה בודדת של המסגרת הנוכחית. מערכת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תאי B.bacteriovorus בודדים ומספקת מידע רב ערך על כל שלב של מחזור החיים הטורף המורכב. היתוך mCherry גלולות מאפשר התא הטורף כולו להיות מסומן בשלב ההתקפה, כמו גם בשלב מוקדם של שלב הצמיחה.המעבר מההתקפה לשלב השכפול יכול להיות חזותי לא רק על ידי היווצרות bdelloplast המארח, אלא גם על ידי המראה של השיבה. השיבה מורכבת בקוטב התא הפולש ויותר מתשיב אחד ניתן לראות בתוך סיסם B.bacteriovorus גדל ככל שלב הרבייה מתקדם. לאחר מספר עותקים של הכרומוזום מסונתזים, השכפול הסתיים.לבסוף, התסיסה הרב-גרעינית עוברת ספיגה והתאים הצאצאים משתחררים מהלדלופלסטיק. התאים B.bacteriovorus צריך להיות חומר מספיק כדי לחפש באופן פעיל את הטרף שלהם ואת צפיפות התא כולו צריך להיות גבוה מספיק כדי לאפשר חיבור תא טורף. פלטפורמה זו עשויה להיות שימושית בניסויים מעורבים פתוגנים עמידים לתרופות מרובות כדי להקל על שיפורים בהנדסה הגנטית של B.bacteriovorus כמו אנטיביוטיקה בחיים ברפואה האנושית והווטרינרית.

live-cell-imaging-life-cycle-bacterial-predator-bdellovibrio

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לפקח על התנהגות תא בודד של חיידקים שונים בתוך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות זמן לשגות. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כיצד לנתח את תמונות מיקרוסקופ.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

מאמר זה מתאר את התהליך להכנת גרסה מתויגת-fluorescently של bacteriophage מבדה, זיהום...

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

מקור: Heering, J., et al.אינדוקציה של התמיינות תאית והדמיה של תאים בודדים של תאי שחיין ונחיל Vibrio parahaemolyticus ., J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים את הכנת תאי הנחיל ממושבת Vibrio parahaemolyticus להדמיה פלואורסצנטית. החיידקים מהונדסים גנטית כדי לבטא חלבון מתויג פלואורופור שמתמקם באופן חד קוטבי בתאי שחיין ודו קוטבי בתאי נחיל מוארכים, מה שמאפשר את ההתמיינות החזותית שלהם. כרית אגרוז מוכנה על שקופית מיקרוסקופ, שעליה מונח קטע מושבה ומוסר כדי להשאיר תאים דבקים, אשר מכוסים לאחר מכן בכיסוי...

הכנת תאי נחיל Vibrio parahaemolyticus להדמיה

מקור: שומאכר, ד., וסוגארד-אנדרסן, ל. הדמיית תאים חיים פלואורסצנטיים של מחזור התאים הצמחיים המלא של החיידק החברתי המתפתח באיטיות Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיית תאים חיים למעקב אחר מקורות כרומוזומים מסומנים פלואורסצנטית במהלך חלוקת תא חיידקים. הוא לוכד את דינמיקת הפרדת הכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה ופלואורסצנציה.

הדמיית טיים-לאפס של הפרדת כרומוזומים בחיידקים מסומנים פלואורסצנטית

מקור: Makowski, Ł., ואחרים. הדמיה של תאים חיים של טורף חיידקי Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בזמן-לפס. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים הדמיית פלואורסצנציה בזמן אמת של חיידק בדלוביבריו הטורף E. coli מקובע מתחת לכרית אגרוז, ומאפשר הדמיה בזמן אמת של שכפול תוך-תאי ושחרור צאצאים לצורך חקר טורף חיידקים ואינטראקציות בין מאכסן-פתוגנים.

דימות טיימלפס בתאי חיים של טורפות בקטריובורוס של Bdellovibrio על E. coli

מקור: ברזוזובסקי, ר. ס. ואחרים. מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תאים חיים לחקר מיקום חלבונים תת-תאיים ושינויים במורפולוגיה של תאים בחיידקים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה פלואורסצנציונית של תאים חיים כדי להמחיש שינויים מורפולוגיים בזמן אמת בחיידקים. הוא מפרט את השלבים הכרוכים בהדמיה, רכישת טיימ-לאפס ודקונבולוציה לקבלת תמונות ברזולוציה גבוהה בזמן אמת.

שינויים מורפולוגיים בהדמיית חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה של תאים חיים

Streptomyces מאופיינים במחזור חיים מורכב שהיה מאתגר מבחינה ניסויית למחקר באמצעים ביולוגיים של תאים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מחזור החיים השלם על ידי גידול Streptomyces venezuelae במכשיר מיקרופלואידי.

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם<em&gt; S. venezuelae</em&gt; מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic

הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים חיוניים.

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

תאים חיידקיים במרחב מאוד מאורגנים. כדי לבצע את הארגון הזה לאורך זמן בתאים Myxococcus xanthus גדל לאט, פותחה מלכודת קרינה פלואורסצנטית הדמיה לחיות תאים עם רזולוציה גבוהה ייתכן במשך מספר דורות. באמצעות שיטה זו, ייתכן הדינמיקה של חלבונים חשובים על כרומוזום סגרגציה ועל חלוקת התא יכול להיקבע.

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור את הדינמיקה לוקליזציה של חלבון subcellular ולנטר שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה ב subtilis מקרתגו ו סטיילוולוקוקוס.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

למדו לעקוב אחר מחזור החיים המורכב של החיידק הטורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה זמן-אמת. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה באינטראקציות טורף-טרף וניתוח התנהגות תאית בזמן אמת.

הדמיה חיה של מחזור החיים של החיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצני זמן לשגות

גלה סרטונים נוספים