בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

היתרון בשימוש בצנטריפוגה דיפרנציאלית לפרוטוקול זה הוא שהוא ניתן להרחבה בקלות עד ליטר ולכן אידיאלי לבידוד אקסוזומים מפיברובלסטים ראשוניים. ניתן להשיג אקסוזומים מטוהרים מסוגי תאים ורקמות שונים המבודדים ממודלים שונים של מחלות. האקסוזומים יכולים לשמש כסמנים ביולוגיים אבחנתיים.

מי שתדגים את ההליך הזה תהיה דיאנטה ואן דה ולקרט, מדענית ממעבדת ד'אזו כדי להתחיל, שקלו את שרירי העכבר ואז העבירו אותם לצלחת של 10 סנטימטרים. עבדו מתחת למכסה המנוע של בטיחות ביולוגית, טחנו את השרירים בעזרת אזמל ליצירת משחה דקה. העבירו את משחת השריר הטחון דק לצינור של 50 מיליליטר, והוסיפו תמיסת עיכול באמצעות פי 3.5 מהנפח למיליגרם רקמה.

דוגרים במשך 45 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. כדי לסייע בדיסוציאציה מוחלטת, מערבבים היטב את המתלה עם פיפטה של 5 מיליליטר כל 10 דקות. כדי להשבית את תמיסת העיכול, הוסף 20 מיליליטר של DMEM Complete לתרחיף התאים.

פיפטה דרך מסננת תאי ניילון בקוטר 70 מיקרומטר המונחת על צינור של 50 מיליליטר, ולאחר מכן שטפו את מסננת התאים עם 5 מיליליטר נוספים של DMEM Complete. צנטריפוגה את תרחיף התא ב -300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של DMEM Complete.

זרעו את התאים לתבנית של 10 סנטימטרים, ואז הניחו את המנה בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-3% חמצן. יש לשמור על תרביות הפיברובלסטים של שרירי השלד ברמת חמצן נמוכה כדי להבטיח תנאי אור פיזיולוגיים. רמת החמצן בשריר השלד היא כ -2.5%לאחר שהתאים מגיעים ל 100% מפגש, תרבית אותם למשך יום נוסף, ואז שטפו אותם עם PBS והוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת טריפסיניזציה.

לאחר דגירה של התאים במשך 10 דקות, הפסק את הטריפסיניזציה על ידי הוספת 10 מיליליטר של DMEM Complete. העבירו את תרחיף התאים לצינור של 50 מיליליטר, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב-300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב -20 מיליליטר של DMEM והשלימו את התאים לתוך צלחת של 15 סנטימטר.

אסוף את המדיום המותנה מהפיברובלסטים המתורבתים בצינור של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את המדיום המותנה ב-300 גרם למשך 10 דקות כדי לגלול את התאים החיים. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 50 מיליליטר וגלולו את התאים המתים על ידי צנטריפוגה של הצינור ב-2,000 גרם למשך 10 דקות.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור פוליפרופילן של 38.5 מיליליטר וצנטריפוגה את הצינור ב-10,000 גרם למשך 30 דקות כדי להסיר אברונים, גופים אפופטוטיים ושברי ממברנה. כדי לגלול את האקסוזומים, העבירו את הסופרנטנט לצינור אולטרה-שקוף של 38.5 מיליליטר, ואולטרה-צנטריפוגה ב-100,000 גרם למשך 1.5 שעות. השליכו בזהירות את הסופרנטנט והשאירו כמיליליטר אחד של מדיום מותנה.

שטפו את הכדור האקסוזומי ותלו אותו מחדש עד 30 מיליליטר PBS קר כקרח. צנטריפוגה את האקסוזומים שוב ב-100,000 גרם למשך 1.5 שעות. להשלמת הטיהור, הסר את הסופרנטנט על ידי פיפטינג, היזהר לא להפריע לכדור האקסוזומי.

שלב הגלולה האקסוזום יכול להיות רופף ולהתנתק בקלות. לכן, הסרת הסופרנטנט PBS צריכה להיעשות בזהירות רבה בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר. השעו מחדש את הגלולה ב-PBS קר כקרח באמצעות 25 מיקרוליטר לכל צלחת של 15 סנטימטר של פיברובלסטים.

לבסוף, מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA וקורא מיקרו-פלטות ב-562 ננומטר. פרוטוקול זה הוא שיטה עקבית וניתנת לשחזור לטיהור אקסוזומים. מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה מראה את הגדלים האחידים יחסית של אקסוזומים אלה.

הכתם החיסוני של ליזטים אקסוזומים מראה דפוס קנוני של ביטוי חלבון והיעדר מזהמי חלבון LDH וקלנקסין. אקסוזומים הופרדו על ידי שיפוע צפיפות סוכרוז, ושברים בודדים נבדקו על כתם מערבי עם נוגדנים נגד אליקס, CD9 ו-CD81. אקסוזומים שקעו באופן עקבי בשברים שלוש עד שש.

האקסוזומים הביו-אקטיביים המבודדים והמרוכזים יכולים לשמש לניתוחי מיקרוסקופ אלקטרונים וספקטרומטריית מסה, כמו גם לניסויי קליטה במבחנה וב-in vivo למחקרים פונקציונליים. פרוטוקול זה מתאים לבידוד אקסוזומים מתאים בעלי הפרשה נמוכה וניתן ליישם אותו כדי לחקור את מעורבותם של אקסוזומים במחלות פיברוטיות אנושיות.