Name: זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: למד זיהוי ציליה ראשית בפיברובלסטים באמצעות צביעת אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת חקר השפעת גורמים חיצוניים על מבנה ותפקוד הציליה בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה של הרפובליקה הצ'כית - תוכנית פיתוח ארגונית ארוכת טווח היבטים רפואיים של נשק להשמדה המונית של הפקולטה למדעי הבריאות הצבאית, אוניברסיטת ההגנה; משרד החינוך, הנוער והספורט, צ'כיה (פרויקט מחקר ספציפי מס': SV/ FVZ201703) ו-PROGRES Q40/06. תודה גם לדניאל דיאז על עזרתו האדיב בתיקון בשפה האנגלית.

1. הכנת מדיה תרבות, פתרונות ומנות
<ol><li>Autoclave את כיסויי (22 x 22 מ"מ). הכינו 6 צלחות טובות. להפשיר סרום עוף עוברי (FBS) ופניצילין אנטיביוטי / סטרפטומיצין ולחמם את טמפרטורת התרבות בינונית לחדר (RT). השתמש ב- trypsin-EDTA (0.25%) ו- 1 PBS (פוספט אגירה תמיסת מלח עם סידן ומגנזיום) כדי לעבור את התאים.</li>
	<li>להכין טרי 4% paraformaldehyde (PFA) ב dH2O (800 מ"ג של PFA ב 20 מ"ל של dH2O). PFA חייב להיות מוכן טרי לכל ניסוי. מערבבים ומחמים את התמיסה ב-55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות במכסה המנוע. להתקרר ב RT. להוסיף 1 M נתרן הידרוקסיד עד הפתרון מתבהר (pH = 7.2–7.4). יש לאחסן ב-4°C עד שבוע אחד. הערה: PFA רעיל; תמיד ללבוש ציוד מגן אישי הולם ולהתכונן בשכונה כימית.</li>
	<li>להכין 500 מ"ל של מדיה תרבות, DMEM (Dulbecco של שונה הנשר של מדיום) המכיל 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 2% גלוטמין.</li>
	<li>להכין 13 מ"ל של 1% פתרון ג'לטין ב dHסטרילי 2O (130 מ"ג של ג'לטין ב 13 מ"ל של dH2O). השתמש 2 מ"ל של 1% ג'לטין עבור כל באר בצלחת 6 באר. תמשיך להיות סטרילי.</li>
	<li>נקה את מכסה המנוע של זרימת ה למינאר באמצעות 70% אתנול. מניחים את החומר הנדרש בתוך מכסה המנוע של זרימת ה למינאר לפני תחילת הניסוי.</li>
</ol>2. תרבות תאים להכתמת אימונוציטוכימיה
<ol><li>להפשיר את התאים (במחקר זה C2C12, MEF, NHLF, ופיברובלסטים בעור) באמצעות טכניקות סטנדרטיות וצלחת אותם במבחנות T75 בתוספת ~ 10-12 מ"ל של התקשורת המוכנה. דגירה ב 37 °C / 5% CO2/ 90% לחות יחסית (RH) עד התאים להגיע 70% confluence.</li>
	<li>מוציאים את התאים מהאינקובטור ומניאים אותם בכסה המנוע של זרימת ה למינאר. הסר את מדיית התרבות ושטוף את התאים לזמן קצר פי 2 עם PBS אחד. הוסף ~ 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתוך בקבוקון T75 דגירה ב 37 ° C עבור ~ 5 דקות. בדוק מעת לעת את המיקרוסקופ ההפוך כדי לפקח על ניתוק התא. הערה: זמן הדגירה תלוי בקו התא ולכן יש לקבוע אותו באופן אמפירי.</li>
	<li>בעדינות respenpent התאים ב 10 מ"ל של מדיה תרבות, pipetting בזהירות כדי ליצור מתלה תא יחיד. יש לשטוף את הבקבוקון שוב במידת הצורך.</li>
	<li>הנח את מתלי התא בצינור חסונים 50 מ"ל וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב ~ 200 x g. לשמן את supernatant, להוסיף 10 מ"ל של מדיה תרבות, בעדינות respenpen את הכדור. קח 20 μL של מתלה התא ולערבב יחס 1:1 עם טריפאן כחול לספור ציטומטר בעקבות השיטה הסטנדרטית.</li>
	<li>מניחים כיסוי אחד בתוך כל באר של צלחת 6 באר באמצעות פינצטה. לכסות את כיסויי עם ג'לטין על ידי שפיכת ~ 2 מ"ל לתוך בארות. כך יעזור לתאים לצרף את הכיסויים. מסירים את תמיסת הג'לטין ולתת לאוויר להתייבש לכמה דקות. כיסויי הכיסוי מוכנים כעת לטיפוח התאים. התחל את הטיפוח מיד.</li>
	<li>זרע 100,000 פיברובלסטים לתוך כל באר ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה תרבות. דגירה התאים במשך 24 שעות ב 37 ° C / 5% CO2/ 90% RH. בשלב זה, ניתן לטפל בתאים בהתאם לצרכי המשתמש. טיפולים כדי לגרום ciliation תוארו בעבר4,5. הערה: מספר הזרעה הראשוני תלוי בזמן ההכפלה של התאים ויש לקבוע אותו בהתאם.</li>
</ol>3. כתמי חיסון של סיליה ראשונית במבחנה
<ol><li>לחמם את 4% paraformaldehyde ל RT. להכין פיפטות פסטר, 1x PBS (RT), מיכל פסולת, 15 מ"ל צינורות חסינים, micropipettes (0.5-10 μL, 20-200 μL, ו 100-1,000 μL) וטיפים. קח את התאים מהאינקובטור והניח אותם על הספסל. הערה: אין צורך לבצע את הליך ההכתמה בתנאים סטריליים. כל הפתרונות חייבים להיות ב-RT.</li>
	<li>הסר מדיה מכל באר. השאר את כיסוי הכיסוי בתוך הבאר. בעדינות רבה לשטוף את התאים 3x עם 2 מ"ל של 1x PBS. באמצעות פיפטה פסטר, להוסיף 2 מ"ל של 4% PFA לתוך כל באר כדי לתקן את התאים. דגירה במשך 10 דקות ב- RT. הסר את PFA ולשטוף 3x עם PBS 1x. הערה: השתמש תמיד בנפח מספיק כדי לכסות את כל כיסוי במהלך תקופות הדגירה. לעולם אל תיתן לתאים להתייבש. לעולם אל תשפוך את הפתרונות ישירות על מכסה.</li>
	<li>הכן 0.5% Triton X-100 ב- 13 מ"ל של 1x PBS 10 דקות לפני השימוש. מוסיפים 2 מ"ל לכל באר. דגירה במשך 15 דקות. יש לשטוף בעדינות פי 4 עם PBS אחד. הערה: Triton X-100 אינו מסיס PBS ב RT. לחמם את פתרון 0.5% Triton X-100 כדי 37 ° C באמבט מים כדי להמיס אותו.</li>
	<li>להפשיר סרום עז 5 דקות לפני השימוש. לדלל את סרום העזים ב 1x PBS ביחס 1:20 כפתרון חסימה. להוסיף 150 μL לכל כיסוי ותרגם במשך 20 דקות ב RT. הערה: להאריך את תקופת החסימה עד 60 דקות במידת הצורך. אין לשטוף את התאים לאחר חסימה עם סרום עזים.</li>
	<li>להפשיר את הנוגדנים העיקריים (כלומר, נגד אצטילאט אלפא טובלין ואנטי גמא טובלין) 5 דקות לפני השימוש. לדלל את הנוגדנים בנפרד ב 1x PBS כדלקמן: עכבר נגד אצטילאט אלפא טובלין ביחס 1:800 וארנב נגד גמא טובלין ביחס 1:300. הסר את פתרון החסימה. אל תתרחץ. להוסיף 150 μL של שני דילולנים נוגדנים לכיסויים ומדגם במשך 60 דקות ב RT. הערה: אם דגירה בן לילה להשתמש 500-1,000 μL של פתרונות נוגדנים העיקריים, לאטום את צלחת 6 באר עם סרט פרפין, ולאחסן ב 4 ° C. לחלופין, להשתמש 150 μL של נוגדנים דגירה בתא לחות.</li>
	<li>הסר את הנוגדנים הראשיים. לשטוף את כיסויי בעדינות רבה 3x עם 2 מ"ל של PBS 1x. הכן את הנוגדנים המשניים ב- PBS 1x על-ידי דילול נפרד של כבשים Cy3 נגד עכבר ואלכסה Fluor488 עז נגד ארנב ביחס 1:300. להוסיף 150 μL של שני דילולנים משניים לכיסויים. דגירה במשך 45 דקות ב RT בחושך. הערה: דגירה בחושך כדי למנוע פוטו-בליך. שילובים אחרים של נוגדנים משניים יכולים לשמש כצורך.</li>
	<li>הכן פתרון DAPI (4', 6-diamidino-2-פנילידול) בהתאם להוראות היצרן. לאחסן את האליציטוטים העודפים ב-20°C. דילול 10 μL מ aliquot מניות (1:5,000) ב 50 מ"ל של 1x PBS. הוסף 2 מ"ל של דילול זה לכיסויים. דגירה במשך 5 דקות ב RT בחושך. הערה: חשוב לערר את התאים בחושך כדי למנוע פוטו-בליך. ניתן לאחסן את דילול DAPI ב- 4 °C למשך עד חודש אחד.</li>
	<li>הכן 2 מחטים, שקופיות, פינצטה, ומדיה הרכבה. תייג את השקופיות.</li>
	<li>הסר את פתרון DAPI מהבארות. לשטוף 3x עם 1pBS. הצבת טיפה אחת של מדיה טעינה בכל שקופית. השתמש במחט כדי להרים בעדינות את הכיסוי מתחתית הבאר. הפוך את כיסוי הכיסוי באמצעות הפינצטה והינו אותו בעדינות על טיפת המדיה ההרכבה. בזהירות להסיר את כל בועות.</li>
	<li>הגן על השקופיות מפני אור ואחסן אותן למשך הלילה ב- 4°C.</li>
	<li>השתמש מיקרוסקופ פלורסנט או confocal עם הגדלה גבוהה כדי לדמיין את cilia הראשי. הערה: ניתן לאחסן את השקופיות בחושך ב- 4 °C למשך עד חודשיים.</li>
</ol>

<ol><li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+primary+cilia%3A+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells%2C+but+a+%22sleeping+beauty%22+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Primary+cilia%22">Primary cilia</a>. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).</li>
<li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li>
<li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li>
<li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).</li>
<li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li>
<li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+show+a+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li>
<li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption%2C+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li>
<li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase%2C+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li>
<li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cilium%3A+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li>
<li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autophagy-Cilia+Axis%3A+An+Intricate+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905(2019).</li>
<li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtt%2C+C+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).</li>
<li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li>
<li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+%28ACDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1(2019).</li>
<li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKim%2C+JH+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22">Biochimica et Biophysica Acta</a>. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).</li>
<li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer%3A+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li>
<li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li>
<li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).</li>
<li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5(2017).</li>
<li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11(2015).</li>
<li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li>
</ol>

למחברים אין מהלחשוף.

מספר מחברים תיארו שיטות מגוונות לזיהוי סיליה ראשית, לעתים גם מתארים שיטות קיבעון שונות שיכולות להשפיעעל הגילוי שלהם 6,20,21,22. ללא קשר, קשה למצוא פרוטוקול מלא וישיר לזיהוי. הזמינות המוכנה של שיטה כזו תהיה ללא ספק של סיוע רב לחקר חקירת cilia העיקרית, במיוחד בשלבים מוקדמים של מחקר או לשיטה מהירה וקלה כדי לבדוק את הנוכחות של cilia הראשי בקו התא הנבחר. לכן, פרוטוקול זה מתואר בפירוט רב ככל האפשר לז...

cilia העיקריים הם חושיים, בודדים, קרום כבול, מבנים לא מוזגים הקשורים צנטריול אמו של התא. cilia העיקרי נמצאים על רוב תאי החוליות למעט תאי דם אדומים, adipocytes1, ו hepatocytes2. cilia הראשי נוצרים כמו אקסואנם מוארך מורכב על ידי microtubules, שהרכיב העיקרי שלהם הוא α-tubulin. האקסואנם גדל מגוף הבסאלי, המוערך מ-0.0. אורכו של cilia הראשי משתנה בין 2-10 μm; עם זאת, ממדיו יכולים להשתנות במהלך גליצילציה, רעב, היפוקסיה, מתח ציטוקוקס, או לאחר חשיפה לקרינהמיוננת 3,4,,5,6,7. בדרך כלל, תאים יש רק סיליום ראשוני אחד, אשר מעורב morphogenesis ותא איתות מסלולים חשובים להתפשטות תאיםובידול 8,9.
cilia הראשי מוסדרים באופן דינמי במהלך התקדמות מחזור התא, במיוחד במהלך שלבי G0/G1, וororbed לפני הזנת מיטוזה בתהליך המשויך deacetylation טובלין בתיווך HDAC6 (histone deacetylase 6)10. הרגע המדויק של ספיגת cilia הראשי תלוי סוג התא ואת הביטוי של גנים המעורבים ישירות בתהליך זה, כגון אורורה A, Plk1, TcTex-111,,12,13. בהתאם לסוג התא, cilia הראשי לבטא סוגים שונים של קולטנים, ערוצי יון, ומסלולי איתות פעילים. אלה כוללים את קולטני האיתות החשובים ביותר המשפיעים על התפשטות והישרדות, EGFR, PDGFR ו- FGFR. כלולים גם כמה מסלולי איתות שעשויים להשפיע על הפונקציה של איברים אחד או יותר, כולל קיפוד, חריץ, ו Wnt. הודות קולטנים אלה ומסלולי איתות, cilia הראשי גם לבצע פונקציה chemosensory. פונקציה זו מאפשרת cilia הראשי לזהות ליגנדים ספציפיים עבור חריץ, הורמונים, וחומרים פעילים ביולוגית כגון סרוטונין או somatostatin. פונקציות ספציפיות אחרות המוצגות על ידי cilia ראשוני של אורכים שונים כוללים תגובה לשינויים בטמפרטורה, כוח המשיכה, osmolality14.
Cilia הראשי ניתן לדמיין באמצעות שיטות שונות, כגון הדמיה חיה, מיקרוסקופאלקטרון שידור, הדמיה 3D, או על ידי תוכנה לזיהוי אוטומטי של cilia הראשי5,15,16,17. עם זאת, שיטות אלה הן מאוד מיוחדים ומתמשך מחקר צריך בסיסי, מהיר, ושיטות קלות להכתים cilia הראשי בכל שלב של המחקר. מתואר היא שיטה קלה ושימושית לזיהוי cilia הראשי בתאים תרבותיים.

<table><tbody><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>TPP</td><td>92406</td><td>מידות 128x86x22 מ"מ</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-546-047</td><td>AffiniPure F (ab')? שבר עז נגד ארנב IgG</td></tr><tr><td>נגד טובולין וגמא;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>ארנב פוליקלונלי אנטי עכבר IgG2a</td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td>Myoblast (עכבר)</td></tr> <tr><td>Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2181</td><td>אנטי עכבר IgG (מולקולה שלמה) F(ab&prime;)2 שבר&ndash; נוגדן Cy3 המיוצר בכבשים</td></tr><tr><td>Dapi (4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s נשר שונה וחריף; s בינוני</td><td>Thermo Scientific</td><td>11960044</td><td>גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין, Gibco</td></tr><tr><td>Dulbecco ' s פוספט חוצץ</td><td>מלח סיגמא-אולדריץ</td>' <td>D8662</td><td>עם MgCl2 ו-CaCl2, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000044</td><td>מסונן סטרילי, Gibco</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEF</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1039</td><td>פיברובלסטים עובריים של עכבר</td></tr><tr><td>טובולין חד-שבטי נגד אצטילציה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>נוגדן טובולין מונוקלנטי אנטי-אצטיל המיוצר בעכבר</td></tr><tr><td>NHLF</td><td></td><td>Lonza CC-2512</td><td>פיברובלסטים ראשוניים של הריאות (אנושיים)</td></tr> <tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>אבקת</td><td></td><td></td><td></td> פרפורמלדהיד סיגמא-אולדריץ' 158127-500G</tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0781</td><td>10,000 יחידות פניצילין ו-10 מ"ג סטרפטומיצין למ"ל ב-0.9% NaCl, סינון סטרילי</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>פיברובלסטים בעור</td><td>מוענק באדיבות מאוניברסיטת צ'ארלס, הפקולטה לרפואה ב-Hradec Kr&aacute; אוהב וקוטר;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מרובע מחליקים</td><td>Thermo Scientific</td><td>22X22-1.5</td><td>זכוכית בורוסיליקט, 22x22 מ"מ, מרובע</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200072</td><td>מסנן סטרילי, Gibco</td></tr></tbody></table>

זיהוי פשוט של cilia הראשי על ידי אימונולוסץ

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

cilia הראשי מוסדרים באופן דינמי במהלך התקדמות מחזור התא, במיוחד במהלך שלבי G0/G1 של מחזור התא, להיות resorbed לפני המיטוזה. ניתן לדמיין cilia הראשי עם שיטות מתוחכמות מאוד, כולל מיקרוסקופאלקטרונים שידור, הדמיה 3D, או שימוש בתוכנה לזיהוי אוטומטי של cilia הראשי. עם זאת, כתמי חיסון של cilia הראשי יש צורך לבצע שיטות אלה. פרסום זה מתאר פרוטוקול לזיהוי קל של cilia הראשי במבחנה על ידי הכתמת אצטילאט אלפא טובולין (אקסואנם) וגמא טובולין (גוף בזל). פרוטוקול כתמים חיסוני זה הוא פשוט יחסית ומביא לתמונות באיכות גבוהה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד ארבעה קווי תאים (C2C12, MEF, NHLF, ופיברובלסטים בעור) המבטאים cilia ראשי תוקנו, immunostained, ותמונה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal.

הכתמה החיסונית של cilia הראשי הוא הליך פשוט יחסית שתוצאות תמונות באיכות גבוהה. בניסויים אלה, פיברובלסטים המבטאים cilia ראשוני תוקנו, immunostained, ותמונה במיקרוסקופ פלורסנט או confocal בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל. הסיליום הראשי זוהה באמצעות אצטילאט α-טובלין ו ơ-tubulin. ההערכה של cilia הראשי יכול להתבצע ברמות שונות וכל שינוי בהקשר זה יכול להיות קשור לחשיפה לקרינה מיוננת, חילוף חומרים של תאים (למשל, רעב), או טיפול כימי (למשל, cytostatics)5,,18.
<p class="jov...

סיליה העיקרית היא מבנים extracellular הקשורים centriole. זיהוי cilia ראשוני על ידי כתם immunofluorescent הוא הליך פשוט יחסית שתוצאות תמונות באיכות גבוהה מאוד. בפרוטוקול זה, פיברובלסטים המבטאים cilia ראשוני תוקנו, immunostained, ותמונה במיקרוסקופ פלורסנט או confocal.

זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מהיר וקל של הוסים ראשוניים בתאים מתורבתים, במגוון מאמצי מחקר. השיטה יכולה להיות מנוצלת בהפרעה המשפיעה על הגופים הבסיסיים של cilia העיקרי. הליך זה יכול להיות מיושם גם על הכתמת cilia ראשוני ברקמה מוטבעת פרפין או עבור ניסויים אחרים שבהם יש צורך פלואורסצנטיות.התחל על ידי autoclaving 22 על ידי 22 מילימטר כיסוי מחליק, והכנת חומרים לניסוי. להפשיר FBS וסטרפטומיצין פניצילין, לחמם את התרבות בינוני לטמפרטורת החדר. מעבר התאים עם טריפסין EDTA ו PBS.הכינו פתרון טרי של 4% פרפורמלדהיד, מדיום תרבותי ו-1% ג'לטין, לפי הוראות כתב היד. לאחר מכן נקו את מכסה המנוע לזרימת למינאר עם 70% אתנול, והניחו את כל החומרים הדרושים בפנים. פרפורמלדהיד מסוכן ביותר.PPE הנכון צריך להיות משוחק בכל עת, וזה צריך להיות מטופל רק ברדס כימי. לאחר גידול התאים הרצויים ל 70% confluence להסיר אותם מן החממה, ולמקום אותם מכסה המנוע לזרימה למינארית. הסר את מדיום התרבות ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.מוסיפים כשני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לבקבוק התרבות, ו דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. בדוק את התאים מעת לעת במיקרוסקופ ההפוך כדי לפקח על הניתוק. כאשר התאים התנתקו בעדינות resuspend אותם 10 מיליליטר של מדיום תרבות, צינורות בזהירות כדי ליצור השעיה תא יחיד.העבר את ההשעיה התא לצינור חרוט 50 מיליליטר וצנטריפוגה אותו ב 200 פעמים G'for חמש דקות. Decant העל-טבעי ואז להוסיף 10 מיליליטר של תרבות בינונית, בעדינות resuspend את גלולה. קח 20 microliters של המתלה התא ומערבבים אותו עם כחול trypan ביחס נפח של אחד לאחד.ואז לספור את התאים באמצעות hemocytometry סטנדרטי. מניחים להחליק כיסוי בתוך כל באר של צלחת שש היטב, ולכסות את החלקת הכיסוי עם שני מיליליטר של תסמעיל ג'לטין, אשר יסייע לתאים המחוברים להחליק את הכיסוי. מוציאים את הג'לטין ותנו לצלחת להתייבש באוויר לכמה דקות.זרעים 100, 000 fibroblasts לתוך כל באר ולהוסיף שני מיליליטר של תרבות בינונית. לאחר מכן הדגירה את התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוז פחמן דו חמצני, ו 90% לחות יחסית. לאחר הדגירה לטפל בתאים כדי לגרום ciliation.מחממים את הפרפורמלדהיד 4% לטמפרטורת החדר, ומכינים פיפטיות מרעה, ABS, מיכל פסולת, צינורות חרוטיים 15 מיליליטר, מיקרו פיפטים וטיפים. קח את התאים מהאינקובטור, והצב אותם על ספסל המעבדה. הסר מדיה מכל באר, והשאיר את פתק הכיסוי.בעדינות לשטוף את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS. לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של 4%PFA לתוך כל באר כדי לתקן את התאים. הדגירה את הצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר את PFA, ולחזור על לשטוף עם PBS.מוסיפים שני מיליליטר של 0.5% טריטון X-100 לכל באר, ו דגירה את הצלחת במשך 15 דקות. ואז לשטוף את בארות ארבע פעמים עם PBS. כדי להפוך את פתרון החסימה, להפשיר סרום עז במשך חמש דקות, ולדלל אותו PBS ביחס של 1 עד 20.הוסיפו 150 מיקרוליטרים של פתרון זה לכל תלוש כיסוי, והם דגירה של הצלחת במשך 20 דקות. להפשיר את הנוגדנים העיקריים במשך חמש דקות, ולדלל אותם בנפרד PBS, כמתואר בכתב היד טקסט. הסר את פתרון החסימה מתלי הכיסוי והוסף 150 מיקרוליטרים של שני פתרונות הנוגדנים.ואז לה הדגירה את הצלחת במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הנוגדנים העיקריים בעדינות לשטוף את הכיסוי מחליק שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS. לדלל Cy3 כבשים נגד עכבר ו פלואור אלקסה 488 עז נגד ארנב ב PBS, ביחס של אחד עד 300, ולהוסיף 150 microliters של שני פתרונות נוגדנים משניים להחליק את הכיסוי.הכן פתרון DAPI עובד על ידי דילול 10 microliters של המניה ב 50 מיליליטר של PBS, ולהוסיף שני מיליליטר של דילול זה לתעודות הכיסוי. דגירה הצלחת במשך חמש דקות בחושך, בטמפרטורת החדר. לפני הנחת החלקות הכיסוי על השקופיות, הכן שני מחטים, פינצטה ומדיית הרכבה ותייג את כל השקופיות.הסר את פתרון DAPI מן בארות, ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS. שים טיפה אחת של מדיית טעינה בכל שקופית. השתמש במחט כדי להרים בעדינות את החלקת המכסה מתחתית באר.ואז להפוך אותו בעדינות למקם אותו על טיפת מדיה הרכבה באמצעות פינצטה. בזהירות להסיר את כל הבועות. הגן על המגלשות מפני אור ואחסן אותן במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.למחרת השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי עם הגדלה גבוהה כדי לדמיין את הוסטליה העיקרית. פרוטוקול זה שימש לתיקון כשל חיסוני, ולתדמית קווי תאים שונים המבטלים דימויים ראשוניים. כאשר myoblasts העכבר נחשפו קרינה מייננת במינונים שונים, נמצא כי מינונים גבוהים יותר לגרום את המראה של מספר רב של cilia ראשוני.בעוד מינונים נמוכים גרמו המראה של cilia ראשוני יחיד. באופן דומה, כאשר פיברובלסטים ריאות אנושיים הקרינו במינון נמוך, cilia ראשוני יחיד זוהו על ידי immunofluorescence. עלייה ב- cilia העיקרי נצפתה פיברובלסטים עובריים עכבר כי היו מורעבים, הוכחת כי מתח מטבולי משפיע על האירועים של cilia העיקרי.כאשר פיברובלסטים בעור טופלו עם 120 טוקסורובין ננו-מולארי, הם הביעו סיליום ראשוני יחיד. מינונים גבוהים יותר לגרום את המראה של שכבות ראשוניות מרובות. פיברובלסטים שטופלו ב-1.25 ננומולרים מטילול גם הביעו סיליום ראשוני יחיד.אבל פעמים רבות לא זוהו לאחר הטיפול במינונים גבוהים יותר. בעת פתיחת פרוטוקול זה הקפד לפעול בהתאם לכל תקנות PPE. זכור את צרכי התרבות של קו התאים שלך של בחירה ובחר את הנוגדנים שלך בזהירות.הליך זה לא יכול להיות מלווה ישירות על ידי הליכים אחרים, שכן התאים הם בלתי הפיך. במקום זאת, יש לתכנת ניסויים מקבילים.

simple-detection-of-primary-cilia-by-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ניתוח של אינטראקציה nanoparticle עם אוכלוסיות מוגדרות של תאי מערכת החיסון על ידי cytometry זרימה.

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

ריסים של נוירונים חושי ריח מכילים חלבונים של מפל העברת האותות, אך ניתוח מרחבי מפורט של התפלגותם קשה בהקפאות. אנו מתארים כאן גישה אופטימלית לתיוג הר שלם והדמיה פנים של חלבונים ריסניים.

הר תיוג כל צילה במערכת חוש הריח העיקרית של עכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על זיהוי אימונוהיסטולוגי של חלבון c-FOS, טכניקה קלאסית המשמשת לזיהוי אוכלוסיות עצביות המעורבות בתגובות פיזיולוגיות ספציפיות in vivo ו-ex vivo.

חלבון C-FOS איתור immunohistological: כלי שימושי כסמן של מסלולים מרכזיים המעורבים בתגובות פיסיולוגיות ספציפיות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; Ex Vivo</em

לאחרונה אנחנו ממופה המיקומים מרחבי תלת מימדי (3D) של נתיבי תחבורה חלבונים שונים translocating בתוך ראשי cilia בתאים חיים. כאן זה פרטים נייר את הגדרת הניסוי, התהליך של דגימות ביולוגיות, הניתוחים נתונים עבור קרינה פלואורסצנטית הרזולוציה סופר 3D הדמיה הגישה לאחרונה המוחלת בחיים cilia העיקרי.

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

השימוש בבינה מלאכותית (Ai) לניתוח תמונות מתגלה כגישה חזקה, פחות מוטה ומהירה בהשוואה לשיטות נפוצות. כאן אימנו את Ai לזהות אברון תאי, ריסים ראשוניים, ולנתח תכונות כגון אורך ועוצמת הכתמים באופן קפדני ושחזורי.

גישות בינה מלאכותית להערכת ריסים ראשוניים

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורציה במבחנה לשחזור עבור מניפולציה גנטית של מבשרי תאי גרגר המוח הקטן העיקרי (GCPs) כי הוא חסכוני, יעיל, קיימא. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים גם שיטה פשוטה למחקר מולקולרי של מסלולי איתות קיפוד תלויי ציליום ראשוניים בתאי GCP ראשוניים.

שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה הוא קל יחסית לביצוע, מהיר, חסכוני, ובידיים מנוסות, כלי אמין במידה ניכרת לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית, שאמורה להיות זמינה בכל מרכז המעורב באבחון ובטיפול במחלות ריאה קשות.

ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית

שיטה זו מתארת את ניצול האות האנדוגני במודל עכבר טרנסגני ARL13B-CENTRIN-2 להדמיית ריסים ראשוניים באתרם, בתלת מימד על פני שטחים גדולים של רקמה מינרלית, מאיסוף רקמות ועד לניתוח ארגון הריסים. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם גם על סוגים אחרים של רקמות.

הדמיה נפחית וניתוח ריסים ראשוניים ברקמת שריר ושלד באמצעות מודל העכבר ARL13B-CENTRIN-2

הפרעות למינופתיה מובילות לעתים קרובות לשינויים במעטפת הגרעין, מה שעלול לגרום לבליבינג גרעיני ודליפה. מחקר זה מציג שיטה אימונופלואורסצנטית להדמיית הלמינה הגרעינית יחד עם DNA דו-גדילי (dsDNA), המספקת אמצעי להערכת מבנה ושלמות גרעין בתאי יונקים.

איתור בלב גרעיני ודליפת DNA בתאי יונקים על ידי אימונופלואורסצנציה

למד זיהוי ציליה ראשית בפיברובלסטים באמצעות צביעת אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת חקר השפעת גורמים חיצוניים על מבנה ותפקוד הציליה בתאים חיים.

זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ

גלה סרטונים נוספים