יצירת אורגנואידי מעיים שמקורם ב-hiPSC עבור יישומים התפתחותיים ומידול מחלות
8 במרץ 2024
פרוטוקול זה מאפשר התמיינות של תאים פלוריפוטנטיים אנושיים לאורגנואידי מעיים. הפרוטוקול מחקה התפתחות אנושית תקינה על ידי התמיינות תאים לאוכלוסייה של אנדודרם סופי, אנדודרם של המעי האחורי ולאחר מכן אפיתל מעיים. זה הופך את הפרוטוקול למתאים לחקר התפתחות מעיים כמו גם יישומי מידול מחלות.
שיטה זו מספקת הוראות שלב אחר שלב כיצד לייצר אורגנואידי מעיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם על ידי התמיינות לאנדודרם סופי, לאחר מכן אפיתל מעיים אחורי, ולבסוף העברה לתנאי תרבית תלת-ממדיים. תוצאות שהתקבלו מאורגנואידי מעיים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם מדגימות יכולת תרגום גבוהה יותר מאשר נתונים מתרביות חד-תאיות, תוך שהן גם מעשיות יותר מאורגנואידים ראשוניים שמקורם ברקמות, שיכולים להיות קשים לשמירה בתרבית לטווח ארוך. עם יצירת תאי מעיים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מובחנים (iPSCs), השתמשו בפיפטה סרולוגית של 5 מיליליטר כדי לנתק את חד-שכבת התא מכל באר של צלחת 6 הקידוחים.
ולאגד את התאים בצינור יחיד של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. יש להשהות מחדש את הגלולה במדיום גדילת המעי בתוספת גורמי גדילה. ולהוסיף את הנפח המתאים של מטריצה חוץ-תאית בהתאם למספר הבארות המצופות.
הוסף 30 מיקרוליטר של השעיית התא למרכז המספר המתאים של בארות של צלחת 48 בארות. הבטחת מיקום ה- ECM במרכז הבאר חשובה מאוד ליציבות ארוכת הטווח של הדגימה הזו. אם ה-ECM נוגע בדופן הבאר, הוא עלול להתמוטט והדגימות עלולות ללכת לאיבוד.
מניחים את הצלחת באינקובטור תרבית התא למשך 5 דקות לפחות. כאשר המטריצה החוץ תאית שקעה, מוסיפים 300 מיקרוליטר של מצע גידול מעיים טרי בתוספת גורמי גדילה לכל באר, ומחזירים את הצלחת לאינקובטור תרבית התא. לאחר 48 שעות, השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבדוק את הבארות להיווצרות אורגנואידים.
לאחר 7 ימים של תרבות, שאפו את מדיה התרבות והחליפו אותה ב- DPBS קר כקרח. השתמש פיפטה סרולוגית 5 מיליליטר כדי לנתק מכנית את האורגנואידים ואת כדור המטריקס החוץ תאי מהצלחת. לאחר מכן, אגרו את האורגנואידים לתוך צינור צנטריפוגה יחיד של 15 מיליליטר.
אספו את האורגנואידים באמצעות צנטריפוגה ושאפו את הסופרנאטנט עד לראש שכבת ה-ECM הנראית לעין. השהה מחדש את הגלולה ב -15 מיליליטר של DPBS קר כקרח וצנטריפוגה את התאים שוב. לאחר שאיפת הסופרנאטנט כפי שהודגם, השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS קר כקרח והשתמש בפיפט P200 כדי לשבש ידנית את האורגנואידים השלמים.
אשר דיסוציאציה מלאה של האורגנואידים. סובבו את האורגנואידים המנותקים והשהו מחדש בנפח הנדרש של המטריצה החוץ-תאית לפני הציפוי על צלחת טרייה בת 48 בארות, כפי שהודגם בכך. לאחר מכן, להחזיר את הצלחת לאינקובטור במשך 5 דקות.
לאחר 5 דקות, להסיר את הצלחת מן האינקובטור ולהוסיף מדיה בסיסית המעי עם גורמי גדילה מעכב ROCK. החליפו מדיה כל 2-4 ימים. כדי לעורר תגובה דלקתית באורגנואידים של המעי, החליפו את הסופרנאטנט בכל באר של תרבית האורגנואידים ב-300 מיקרוליטר של מדיום בסיסי טרי שהוכן בתוספת 40 ננוגרם למיליליטר של TNF אלפא.
לאחר מכן, החזירו את הצלחת לאינקובטור תרבית התאים למשך 48 שעות כדי לשכפל סביבה פרו-דלקתית. ניתן לנטר ביטוי גנים במהלך התמיינות IPSC אנושית באמצעות סמנים פלוריפוטנטיים המתבטאים מאוד ביום 0 ומווסתים במהירות במהלך תהליך התמיינות אנדודרם סופי. ביום 2 להתמיינות, גנים אנדודרם סופיים צריכים להתחיל לבוא לידי ביטוי, והביטוי צריך להגיע לשיא ביום 3.
במהלך אפיון המעי האחורי, ביטוי CDX2 ו- HNF4alpha צריך להיות מושרה ולהגדיל עם הזמן. 48 שעות לאחר העברת גיליון תאים דו-ממדי, יריעות התאים אמורות להתחיל להתארגן אוטומטית למבנים ספרואידים תלת-ממדיים דחוסים יותר, שהם בתחילה קטנים, אך יגדלו בהדרגה בגודל ובמורכבות במהלך 7-10 ימי התרבית הבאים. אין להעביר את האורגנואידים עד שהם השיגו מורפולוגיית אורגנואיד ספרואידית ברורה עם אפיתל ברור ועם לומן הפונה לכיוון מרכז המבנה.
כאשר המבנים מגיעים לשלב זה, אימונוציטוכימיה יכולה להתבצע כדי לאשר את הביטוי של סמני מעיים, כגון villin ו- CDX2. כדי למדל דלקת, ניתן להוסיף TNF אלפא למדיום תרבית הרקמה למשך 24-48 שעות, מה שבדרך כלל גורם לביטוי של סמנים פרו-דלקתיים בשילוב עם ירידה בוויסות של סמני אפיתל במעי. אורגנואידי מעיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם יכולים לשמש לגילוי תרופות, מידול מחלות, עריכת גנים, מחקר של מיקרו-סביבה של הגידול, ופרופיל שעתוק ופרוטאומי, ואפיגנטי של כל מחלה מעניינת.
שיטה זו יכולה לסייע למעבדות רבות לבסס אורגנואידים במעי כמערכת מודל, ולספק להם שיטה נוספת למחקרם.
סקירה כללית
מחקר זה מתווה פרוטוקול לגזירה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לאורגנואידים של המעי, המדמים התפתחות אנושית נורמלית. השיטה מייצרת באופן יעיל אנדודרם סופי (definitive endoderm), אפיתל של המעי האחורי ובסופו של דבר מבני מעי תפקודיים, המתאימים לחקר התפתחות המעי ולמדלי מחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
- מידול מחלות
רקע
- ניתן להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לסוגי תאים שונים.
- אורגנואידים של המעי משמשים כמודל בעל יכולת תרגום קלינית גבוהה יותר בהשוואה לתרביות חד-תאיות.
- קיימים אתגרים בתחזוקה של אורגנואידים המופקים מרקמה ראשונית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גזירה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים (iPSCs) לאורגנואידים.
- תנאי תרבית תלת-ממדית ליציבות וצמיחה לטווח ארוך.
- ניטור ביטוי גנים ואימונוציטוכמיה לסמנים של המעי.
תוצאות עיקריות
- הפקה של אורגנואידים של המעי מתאי גזע פלוריפוטנטיים מוכוונית (iPSCs) בעלי מבנים אפיתליאליים ברורים.
- מידול מוצלח של תגובות דלקתיות באמצעות TNF alpha.
- ביטוי חסון של סממנים למעי אשר אושש באמצעות בדיקות שונות.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה ישימה ליצירת אורגנואידים של מעי אנושי.
- טכניקה זו משפרת את יכולות המחקר בתחומי גילוי תרופות ומידול מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אורגנואידים של מעי המופקים מ-hiPSC מספקים מערכת מודל ניתנת להרחבה, ניתנת לשחזור ורלוונטית לבני אדם עבור גילוי תרופות בשלבים מוקדמים ובחינת מנגנוני מחלה. יכולתם לשחזר ארכיטקטורה מורכבת של אפיתל המעי מאפשרת ביטחון חיזוי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מנגנוניים עבור פורטפוליו של מחלות גסטרו-אינטסטינליות. פלטפורמה זו תומכת ברצף תרגומי משלב הגילוי דרך המחקר הפרה-קליני, ומסייעת בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בהקשר תלת-ממדי פיזיולוגי רלוונטי של מעי אנושי.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות מידול של דיפרנציאציה וקיטוב של תאי אפיתל.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור מסלולים דלקתיים ופיברוטיים הרלוונטיים ל-IBD ולהפרעות קשורות.
- מספק פלטפורמה למחקרים השוואתיים המשתמשים ב-hiPSCs בריאים ובכאלה שהופקו מחולים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק תרביות אורגנואידים סטנדרטיות וניתנות להרחבה המתאימות לפיתוח בדיקות כמותיות.
- מאפשר מדידה הדירה של ביטוי גנים וסממנים חלבוניים באמצעות qPCR ואימונוציטוכמיה.
- תומך בסריקה של תגובות דלקתיות לציטוקינים ומתווכים חיידקיים במערכת מבוקרת.
- מאפשר מעבר (passaging) ותחזוקה הניתנים להרחבה, התומכים בזרימות עבודה בעלות תפוקה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מדמה פנוטיפים רלוונטיים למחלה, כולל תגובות דלקתיות ופיברוטיות, לצורך גילוי ביומרקרים תרגומיים.
- מאפשר התאמה של ממצאים in vitro לרקעים גנטיים של חולים לצורך תיקוף פרה-קליני.
- תומך בהתקדמות מותאמת-סיכון של תרופות מועמדות המכוונות לפתולוגיות של המעי.
- מקל על שילוב של אנליזות טרנסקריפטומיות, פרוטאומיות ואפיגנטיות לצורך מידול מקיף של המחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פלטפורמת האורגנואידים הזו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים, זיהוי מובילים (lead identification) ותיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת מערכת הניתנת לשחזור ובעלת רלוונטיות אנושית לבדיקת השערות ומחקרים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערת האפס ובהבהרת מסלולים בהתפתחות ובמחלות של המעי.
- סריקה: מספק אורגנואידים סטנדרטיים המוכנים לבדיקה לצורך הערכה כמותית של תגובות דלקתיות ופיברוטיות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה חזקה של ביטוי גנים וחלבונים להשוואה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מתאם מידול מחלות in vitro עם רקעים גנטיים של מטופלים לצורך גילוי סמנים ביולוגיים ומטרות טיפוליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר וניתנת להרחבה, הניתנת להתאמה לצרכי מחקר גסטרו-אינטסטינליים מגוונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של זרימות עבודה ומאפשר ייצור אורגנואידים הניתן לשחזור וניתן להרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות מסוג go/no-go ואת היעילות ההונית על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון ובקידום של תוכניות למחלות של מערכת העיכול.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות hiPSC, דיפרנציאציה וטיפול באורגנואידים תלת-ממדיים (3D).
- נדרשת גישה לתשתית ייעודית לתרביות תאים ולפלטפורמות אנליטיות עבור qPCR ואימונוציטוכימיה.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי דיפרנציאציה ומעבר (passaging) לצורך הדירות (reproducibility).
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור שורות hiPSC שונות או רקעים גנטיים ספציפיים למחלה.
- יציבות תרבית לטווח ארוך ויכולת הרחבה (scalability) תלויות בטיפול מדויק ב-ECM ובהוספת גורמי גדילה.
