מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לחלקיקים מוטסים לבדיקות רעילות
13 במאי 2020
המתוארת היא תרבות התא ושיטת החשיפה של מודל הסימפונות במבחנה לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לשאיפת חלקיקים לבדיקות רעילות.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לתרבית ולחשוף תאי אפיתל סימפונות אנושיים דרך האוויר. זהו מודל מציאותי יותר לחקר חשיפת הריאה לחלקיקים נשאפים. תאי הריאה התכוננו בשיטות אלה, כדי להידמות לסביבה האמיתית בריאה. התאים ייצרו ריר, ייצרו מחסום הדוק, ויישארו ברי קיימא למשך מספר שבועות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור השפעות רעילות של חלקיקים הנישאים באוויר. זה יכול לשמש גם לחקר מחלות זיהומיות של דרכי הנשימה ותרופות הנלקחות בשאיפה. כאשר מנסים פרוטוקול זה בפעם הראשונה, זכור שיצירת זריז וגמיש דורשת ידע של מומחה. זה גם דורש ציוד ייעודי למדידה. התחל בדילול התאים במדיום תרבית תאים מחומם מראש או CCM, לריכוז של 500,000 תאים למיליליטר להכנסות של 6 בארות. ו -250,000 תאים למיליליטר עבור תוספות של 12 בארות. מניחים צלחת תרבית תאים עם תוספות בתנאים אספטיים, וממלאים את הצד הצדדי הבסיסי ב-CCM מחומם מראש.לאחר ערבוב תרחיף התאים, פיפטה אותו על גבי הממברנה בתוספת תרבית התאים. מכסים את הצלחת ומדגרים אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. תרבו את התאים בתנאי שקיעה במשך שבעה ימים, כדי לאפשר להם להגיע למפגש, והחליפו את ה-CCM כל יומיים-שלושה. כדי למדוד את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתלית, השתמש בוולטוממטר אפיתל טעון, בתוספת סט אלקטרודות צ'ופסטיק. נקו את האלקטרודות עם 70% אתנול. מניחים את האלקטרודה הארוכה יותר באמצעי התרבות החיצוני, עד שהיא נוגעת בתחתית המנה. והאלקטרודה הקצרה יותר במדיה, מבלי לגעת בקרום. התחל לאסוף מדידות על התוספת הריקה ללא תאים. המתן עד שהמדידה תתייצב ורשום את ההתנגדות באוהם. מדידה זו היא ההתנגדות של קרום ההכנסה ללא תאים או התנגדות ריקה. חזור על המדידה עבור כל תוספת, והחסר את ההתנגדות הריקה כדי להשיג את ההתנגדות האמיתית, והכפל בשטח הפנים של התוספת. הסר את המדיום מהצד האפיקלי של התוספות והוסף CCM מחומם מראש לצד הבסיסי של הבאר. המדיום צריך לגעת בקרום מלמטה, אך לא לדלוף לחלק העליון של התוספת. תרבו את התאים בממשק האוויר-נוזל באינקובטור, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני במשך שבעה ימים. החלפת המדיום הבסיסי כל יומיים-שלושה. זמן קצר לפני החשיפה לחלקיקים, הכינו תרחיף ננו-חלקיקים של 1%. הרטיבו מראש את ה-NPs עם 96% אתנול. הוסף מים טהורים לריכוז סופי של 1% NPs.שים את הבקבוקון בכוס על קרח. סוניקציה של התרחיף למשך 16 דקות, הוסף ערבוב לבקבוק עם הפיזור, ואז חבר את הבקבוק למשאבה פריסטלטית באמצעות צינור קטן והתאם את הזרימה ל -25 מיליליטר לשעה. יום לפני החשיפה הפעילו את עמדת החשיפה האוטומטית או AES ואפשרו לארון להגיע לטמפרטורה של 37
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בפיתוח מודל סימולציה של סימפונות in vitro כדי לדמות חשיפה חוזרת בשאיפה לחלקיקים הנישאים באוויר לצורך בדיקות רעילות. תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים שהוצמחו מראים חיוניות לאורך זמן ויצירת ריר ריאליסטית, מה שהופך את המודל למתאים למחקרי רעילות ולמחקר על מחלות זיהומיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- רעילות
- ביולוגיה של מערכת הנשימה
- מודלים חוץ גופיים (in vitro)
רקע
- הצורך במודלים ריאליסטיים של חשיפה לריאות
- חשיבותן של חקירת חלקיקים שנשאפו
- יישומים במחקר של הולכת תרופות ומחלות זיהומיות
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקות תרבית תאים לתאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים
- תנאי תרבית בממשק אוויר-נוזל
- מדידת התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית
תוצאות עיקריות
- התאים יוצרים מחסום הדוק ומייצרים ריר
- החיוניות נשמרת למשך מספר שבועות בתנאים מבוקרים
- השיטה תוקפה לשימוש בהערכות רעילות
מסקנות
- המודל שפותח מדמה ביעילות חשיפה של הריאות לחלקיקים שנשאפו
- השלכות משמעותיות לבדיקות רעילות ומחקר נשימתי
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים ריאליסטיים של אפיתל ברונכיאלי in vitro הם קריטיים לבדיקות חיזויות של רעילות בשאיפה ולמחקר על הולכת תרופות למערכת הנשמימה. מערכת ממשק אוויר-נוזל (ALI) עם תאי Calu-3 מאפשרת מחקרי חשיפה חוזרים במינונים נמוכים הדמים באופן הדוק לתנאים בדרכי הנשימה האנושיות, ובכך תומכת בביטחון תרגומי גבוה יותר בהערכת תרכובים בשלבים מוקדמים. גישה זו נותנת מענה לצורך במודלים הניתנים לשחזור ובעלי רלוונטיות פיזיולוגית בשרשראות הפיתוח של תרופות ביו-פארמצבטיות למערכת הנשמימה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של השפעות תרכובות שאיפה על אפיתל דרכי הנשימה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי שמירה על צומתים הדוקים (tight junctions) וייצור ריreה לאורך תקופות ממושכות.
- מסייע בביטחון חיזוי בהערכות רעילות ובטיחות נשימתית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת מתוקפת וניתנת לשחזור למדידה כמותית של שלמות מחסום אפיתליאלי.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה עבור חשיפות חוזרות לחלקיקים בריכוז נמוך.
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות תרכובים נישואים באוויר תחת תנאי זרימה רציפה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם למודלים של דרכי נשימה הרלוונטיים למחלה עבור מחקרי סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי במערכות in vitro ועד לתהליכי עבודה של רעילות שאיפה פרה-קלינית.
- מפחית את הסיכון לנשירה בשלבים מאוחרים באמצעות מידול של תרחישי חשיפה ריאליסטיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
מודל סימפוני זה בממשק נוזל-אוויר (ALI) משתלב ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני עבור תרפיה נשימתית ורעילות בשאיפה.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על תפקוד מחסום דרכי הנשימה ורעילות של חלקיקים.
- סריקה: מספק מדדי התנגדות טרנס-אפיתליאלית וחיוניות כמותיים וניתנים לשחזור.
- אנליטיקה: מאפשר ניטור רציף של ריכוז החשיפה והמינון שניתן.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro למחקרי שאיפה פרה-קליניים עם נקודות סוף רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מספק פלטפורמה סטנדרטית הניתנת להתאמה למגוון מחקרים של חלקיקים ותרופות הנישאים באוויר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בבדיקות רעילות נשימתית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) עבור פרוטוקולים של חשיפה חוזרת.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת היעילות ההונית בפיתוח פורטפוליו של תכשירים נשימתיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של תרכובים ופורמולציות לשאיפה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים בממשק אוויר-נוזל (ALI) ובמדידת מחסום אפיתליאלי.
- נדרש מיכשור ייעודי לחשיפה בזרימה רציפה ולניטור התנגדות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית לפרוטוקולי חשיפה וניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה לסוגים וריכוזים שונים של חלקיקים נישאים באוויר, תחת מגבלות המודל.
- תלוי בשמירה על חיוניות התאים ושלמות הצמתים המהדקים (tight junctions) לאורך תקופות תרבית ממושכות.
