Name: מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לחלקיקים מוטסים לבדיקות רעילות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: למדו ליצור מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר מתאי אפיתל קוציים אנושיים לבדיקות רעילות חוזרות של חלקיקים מוטסים. השיטה מאפשרת חקר מציאותי של חשיפת הריאות לאורך מספר שבועות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו ממומנת על ידי סיורים פרויקט האיחוד האירופי (כלים מעוגנים פיזיולוגית עבור סיכון ננו מציאותי aSsessment) ומשרד הבריאות, הרווחה והספורט ההולנדי (פרויקט V/050012). ברצוננו להודות לד"ר איבון סטאל וד"ר יאן ואן בנת'ם על הביקורתיים שכתבו את כתב היד.

<ol><li>Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Adverse+Effects+of+Inhaled+Nanoparticles+by+Realistic+In+Vitro+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (2), 49(2017).</li>
<li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+exposures+to+acute+and+lifetime+concentrations+of+inhaled+silver+nanoparticles+by+two+different+in+vitro+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22The+Beilstein+Journal+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches.</a> The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).</li>
<li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dose-controlled+system+for+air-liquid+interface+cell+exposure+and+application+to+zinc+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 6, 32(2009).</li>
<li>Paur, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+cell+exposure+studies+for+the+assessment+of+nanoparticle+toxicity+in+the+lung-A+dialog+between+aerosol+science+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Aerosol+Science%22%5BJournal%5D)">In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology.</a> Journal of Aerosol Science. 42 (10), 668-692 (2011).</li>
<li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air-Liquid+Interface+In+Vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research%3A+Consensus+Workshop+and+Recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+in+vitro+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations.</a> Applied in vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li>
<li>Loret, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air-liquid+interface+exposure+to+aerosols+of+poorly+soluble+nanomaterials+induces+different+biological+activation+levels+compared+to+exposure+to+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions.</a> Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 58(2016).</li>
<li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+airway+epithelial+cells+%28calu-3%29%3A+a+model+of+human+respiratory+function%2C+structure%2C+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).</li>
<li>Braakhuis, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+future+of+in+vitro+models+to+study+translocation+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles.</a> Archives in Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).</li>
<li>Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimised+Human+Cell+Culture+Model+for+Alveolar+Epithelial+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport.</a> PLoS One. 11 (10), 0165225(2016).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+Airway+Epithelial+Models+for+Immunological+Co-Culture+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 170 (1), 1-21 (2016).</li>
<li>Jeong, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+for+predicting+acute+inhalation+toxicity+by+using+a+Calu-3+epithelium+cytotoxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576(2019).</li>
<li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Research%22%5BJournal%5D)">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmacology Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).</li>
<li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of Virological Methods. 174 (1-2), 144-149 (2011).</li>
<li>Vitrocell. Vitrocell® Automated Exposure Station. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1">https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1</a> (2019).</li>
<li>Mülhopt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+testing+of+combustion+aerosols+at+the+air-liquid+interface+with+a+self-contained+and+easy-to-use+exposure+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Aerosol+Science%22%5BJournal%5D)">Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system.</a> Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).</li>
<li>Vitrocell. VITROCELL® Cloud for the exposure to liquid aerosols. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system">https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system</a> (2019).</li>
<li>Endes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+testing+strategy+towards+mimicking+the+inhalation+of+high+aspect+ratio+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 40(2014).</li>
<li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+bioactive+delivery+of+aerosolized+drugs+to+human+pulmonary+epithelial+cells+cultured+in+air-liquid+interface+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (4), 526-535 (2014).</li>
<li>Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carcinogenic+action+of+crystalline+silica%3A+a+review+of+the+evidence+supporting+secondary+inflammation-driven+genotoxicity+as+a+principal+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism.</a> Critical Reviews in Toxicology. 41 (9), 756-770 (2011).</li>
<li>Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+review+of+the+genotoxicity+of+respirable+crystalline+silica%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 23(2018).</li>
<li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanistic+review+of+silica-induced+inhalation+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Inhalation+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity.</a> Inhalation Toxicology. 27 (8), 363-377 (2015).</li>
<li>Sayes, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+the+dose+metric+for+inhalation+toxicity+studies%3A+short-term+study+in+rats+with+engineered+aerosolized+amorphous+silica+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Inhalation+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles.</a> Inhalation Toxicology. 22 (4), 348-354 (2010).</li>
<li>Driscoll, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+response+to+inhaled+silica+or+titanium+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 111 (2), 201-210 (1991).</li>
<li>Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+lung+lesions+in+rat+after+chronic+exposure+to+crystalline+silica%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Work%2C+Environment+and+Health%22%5BJournal%5D)">Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica.</a> Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, Suppl 2 27-29 (1995).</li>
<li>Peeters, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-induced+NLRP3+inflammasome+activation+in+vitro+and+in+rat+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs.</a> Particle and Fibre Toxicology. 11, 58(2014).</li>
<li>Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subchronic+inhalation+toxicity+of+amorphous+silicas+and+quartz+dust+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats.</a> Food and Chemical Toxicology. 29 (5), 341-354 (1991).</li>
<li>Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-day+inhalation+toxicity+study+of+three+types+of+synthetic+amorphous+silicas+in+Wistar+rats+and+post-exposure+evaluations+for+up+to+3+months%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months.</a> Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).</li>
<li>Cho, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mediators+induced+by+intratracheal+instillation+of+ultrafine+amorphous+silica+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles.</a> Toxicology Letters. 175 (1-3), 24-33 (2007).</li>
<li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+silver-nanoparticles+and+silver-ions+to+lung+cells+in+vitro+at+the+air-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface.</a> Particle and Fibre Toxicology. 10 (1), 11(2013).</li>
<li>Mülhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+toxicity+determination+by+in+vitro+exposure+at+the+air+liquid+interface+with+an+integrated+online+dose+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Conference+Series%22%5BJournal%5D)">Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement.</a> Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008(2009).</li>
<li>van Ravenzwaay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+fate+and+effects+of+three+particles+of+different+surface+properties%3A+nano-TiO%282%29%2C+pigmentary+TiO%282%29+and+quartz%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz.</a> Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).</li>
<li>Henderson, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+inflammatory+response+of+the+lung+to+inhaled+versus+instilled+particles+in+F344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+and+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats.</a> Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת תאי אפיתל הסימפונות האנושיים תחת ALI וחשיפת מודל הסימפונות הזה לתרסיסים או גזים. היתרון של שימוש בתאי Calu-3 הוא שהם יוצרים צמתים הדוקים, נשארים מונולאייר, מסוגלים לעמוד בזרימת האוויר, וניתן לתרבת במשך שבועות ב- ALI, בניגוד לסוגי תאים רבים אחרים (למשל, 16HBE, H292 ו- BEAS-2B). שימוש בתחנת החשיפה האוטומטית® VITROCELL (AES) יש את היתרון כי התאים יכולים להיחשף בתנאים מציאותיים ורלוונטיים כמו ריכוזים נמוכים ניתן להחיל באמצעות זרימת אוויר רציפה.
מערכות זרימה מתמשכות, כגון AES, יש יתרונות לעומת שימוש במערכות ענן3,32, אשר משתמשים ערפילית אחת של השעיה. הזרימה הרציפה מציאותית יותר ומשתנים רבים כמו קצב זרימה, לחות וטמפרטורה נשלטים. בנוסף, ניתן לשפר את התצהיר באמצעות שדה חשמלי. לבסוף, מאפייני תרסיס כמו גודל, ריכוז מספרים ומסה מנוטרים באינטרנט. החיסרון הוא שמערכות זרימה מתמשכות מורכבות יותר בהשוואה למערכות ענן. לכן, חשוב להפעיל ניסויי הכנה המתמקדים במאפייני החלקיקים של התרסיס והמינון המועבר על הכנס. ריכוז ההתחלה הראשוני של החלקיקים והגדרות AES לאחר מכן ניתן להתאים כדי להשיג את המינון הרצוי על התאים33. בהתאם לסוג החלקיקים הנבדקים, שיטת ייצור התרסיס יכולה להיות שונה. השימוש בתצהיר אלקטרוסטטי תלוי בסוג החלקיקים ופועל בצורה הטובה ביותר עבור חלקיקים מתכתיים. עבור חלקיקים עם מטען משטח חיובי שדה אלקטרוסטטי שלילי צריך להיות מיושם ולהיפך.
בחירת ריכוזי חשיפה יכולה להיות קשה עבור כל ניסוי חשיפה לנוזל אוויר. עבור חשיפות DQ12, המטרה הייתה להשיג מינון מצטבר כולל של 1 מיקרוגרם / ס"מ2 לאחר 3 שבועות חשיפה, 5 ימים בשבוע, 4 שעות ליום. מינון זה דומה מינונים שגרמו השפעה vivo21,25,27,32,33. בעת ביצוע החשיפות, הייתה שונות מסוימת בין ימי חשיפה שונים. למרות המינון שהופקד בפועל של 1.6 מיקרוגרם / ס"מ2 הוא גבוה יותר מאשר 1 מיקרוגרם / ס"מ2 כי היה מיועד, המינון יכול להיות נמוך מדי כדי לצפות בהשפעות במודל Calu-3. רק הבדלים קלים בתגובת TEER, הכדאיות והציטוקינים נצפו בין החשיפה לאוויר נקי לחשיפה ל-DQ12, והבדלים אלה לא היו מובהקים סטטיסטית. הסבר לתצפית כי חשיפה DQ12 במשך 3 שבועות לא לגרום השפעות משמעותיות בתאי Calu-3 היא כי מקרופאגים היו חסרים ממודל Calu-3. ייתכן, לאחר DQ12 ספיגת מקרופאגים לייצר ציטוקינים proinflammatory שעלולים להשפיע על תאים Calu-3. הסבר נוסף הוא כי אצווה DQ12 ששימש לניסויים לא היה תגובתי כצפוי. בעת שימוש ב- LPS כחומר בקרה חיובי, Calu-3 מראה תגובה, כפי שנמדד על ידי עלייה במהדורת LDH ועלייה במהדורת TNF-α. הדבר מצביע על כך שהמודל יכול לזהות רעילות.
מודל התא Calu-3 יש יתרונות רבים, כפי שנדון בסעיף התוצאות. יתר על כן, כאשר תרבותי במשך זמן רב יותר ב ALI, התאים Calu-3 יכול לגדול מבנים דמויי ריסים / ריסים13 לייצר ריר11,12,13. למרות יתרונות אלה, למודל יש מגבלות ביחס לרלוונטיות הפיזיולוגית שלו. קווי התא Calu-3 מקורם אדנוקרצינומה, ואילו 16HBE ו BEAS-2B מקורם רקמה בריאה. למרבה הצער, השניים האחרונים אינם מתאימים לחשיפה חוזרת ונשנית של ALI מכיוון שהם אינם נשארים מונולייר יציב לאורך זמן. מגבלה נוספת של מודל Calu-3 היא שהוא מייצג רק סוג תא יחיד. בריאה האנושית קיימים סוגי תאים מרובים המקיימים אינטראקציה ומגיבים באופן שונה לחשיפה. חלקיקים בשאיפה יפקידו באזורים שונים של הריאות בהתאם לגודל האווירודינמי שלהם. כאן החלקיקים יוצרים קשר עם מחסום תא האפיתל, כפי שמחקה מודל קאלו-3. בריאה האנושית, מקרופאגים מכתשיים נמשכים לחלקיקים, בולעים אותם ומנקים אותם מהריאות. מקרופאגים גם ממלאים תפקיד חיוני בתגובה הדלקתית לחשיפה לחלקיקים. לכן, נעשים מאמצים להרחיב את מודל Calu-3 על ידי הוספת מקרופאגים ראשוניים כדי לחקות את מחסום הריאות מקרוב יותר. החיסרון של מקרופאגים הוא שהם נשארים קיימא רק במשך כ 7 ימים כאשר תרבותי על גבי תאים Calu-3 ב ALI. לכן, יש לקרוא מקרופאגים מדי שבוע כדי להפוך את מודל Calu-3 הנוכחי למודל שיתוף פעולה. אופטימיזציה של פרוטוקול coculture הוא כרגע מתמשך.
בהתחשב לעיל, מודל הסימפונות Calu-3 הוא מודל מתאים לחשיפה חוזרת ונשנית אירוסולים של חומרים מסיסים חלקית כגון כימיקלים מעשן סיגריות LPS. חומרים מסיסים אלה לגרום לעלייה משמעותית בתגובות ציטוקינים בתאי Calu-3. לבדיקת חלקיקים בלתי מסיסים כגון פליטת דיזל ו- DQ12, יש צורך במודל קוקולטורה, מכיוון שהמאקרופאג'ים ממלאים תפקיד מכריע באינדוקציה של אפקטים על ידי חשיפה לחלקיקים.
לחשיפות המתוארות, נעשה שימוש בקרומים עם נקבוביות 3.0 מיקרומטר. הסיבה העיקרית לבחירת סוג זה של הכנסה היא כי ניתן לבדוק את טרנסלוקציה של ננו. בעת שימוש קטן יותר 0.4 מיקרומטר נקבובית גודל, agglomerates חלקיקים לא יוכלו לחצות את קרום הכנס. החיסרון בשימוש בגודל נקבובי גדול הוא שהתאים זקוקים לזמן ארוך יותר כדי לגדול במקביל וכי קשה יותר לדמיין את המורפולוגיה של התאים באמצעות מיקרוסקופיה קלה. כדי לבדוק שהתאים אכן יוצרים קו monolayer של מפגש, על ה- TEER להיות >1,000 Ω x ס"מ2 לפני תחילת החשיפה.
יחד, מודל הסימפונות Calu-3 המוצג כאן מתאים לשימוש לחשיפה חוזרת ונשנית לתרסיסים, לפחות עד 3 שבועות. המודל יכול לעמוד להיות תרבותי וחשוף באמצעות זרימת אוויר רציפה והוא מסוגל לזהות רעילות אפיתל הסימפונות.

הריאות פגיעות לחשיפה לשאיפה לחלקיקים הנישאים באוויר. כדי להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של חלקיקים הנישאים באוויר, חלה התקדמות בפיתוח מערכות חשיפה לממשק נוזלי אוויר (ALI)1,2,3,4,5. מערכות החשיפה של ALI מאפשרות מודלי חשיפה רלוונטיים ומציאותיים יותר בהשוואה לחשיפה מסורתית שקועה באמצעות מדיום תרבותי המשנה את המאפיינים והקינטיקה של החלקיקים6. מערכות החשיפה של ALI מציבות דרישות ספציפיות במודלים של תרבות התאים, שכן למודלים אין מדיום תרבותי ולכן חומרים מזינים בצד האפור. מודלים רבים של תאים מושפעים לרעה על ידי להיות תרבותי וחשוף באוויר (למשל, ייבוש) ורק להישאר קיימא במשך כמה ימים. זה מגביל את תנאי החשיפה שניתן להשתמש בהם במודלים אלה: בדרך כלל ריכוזים גבוהים יחסית מוחלים בתוך פרק זמן קצר כענן (כלומר, טיפות המכילות חלקיקים, אשר מתיישבים במהירות). תנאי ניסוי כאלה אינם משקפים חשיפה ריאלית ארוכת טווח לריכוזים נמוכים של חלקיקים; לפיכך, ניתן להטיל ספק ברלוונטיות של התוצאות. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פרוטוקול התרבות והחשיפה למודל הסימפונות המורכב מקו תאי האפיתל הסימפונות האנושי Calu-37 היה אופטימיזציה.
רוב דגמי הריאות במבחנה המשמשים לחשיפה ל- ALI מכילים קווי תאים אחרים כגון A549, BEAS-2B ו- 16HBE14o- (16HBE) או תאים ראשיים כבסיס8. קווי תאים אלה יש את החיסרון כי הם נשארים קיימא רק כמה ימים כאשר מתורבת על עלי. בנוסף, חלק מקווי תאים אלה מתגברים כאשר הם מתרבים לתקופה ארוכה מ -5 ימים. לבסוף, תאי A549 מפספסים צמתים הדוקים פונקציונליים ולכן אינם יכולים ליצור מחסום הדוק הדרוש כדי לחקות את הריאות9,10. תאי אפיתל ראשוניים עשויים להיות אפשרות טובה לחשיפה ALI כפי שהם יכולים להיות תרבותיים ב ALI במשך שבועות. עם זאת, תאים ראשוניים שונים מאצווה לאצווה, קשים יותר לתחזוקה, והם יקרים יותר בהשוואה לקווי תאים, מה שהופך אותם פחות מתאימים לבדיקות רעילות וסינון. בעת השוואת קווי תא אפיתל אנושיים שונים (16HBE, Calu-3, H292 ו- BEAS-2B), רק תאי Calu-3 ממלאים את כל הקריטריונים הדרושים לחשיפה מציאותית וחוזרת על עצמה של ALI: הם נשארים בני קיימא במשך שבועות בעודם מתרבים ב- ALI, מספקים שלמות מחסום גבוהה, אינם מגזימים, וקלים לתרבות ולתחזוקה. תאים Calu-3 מקורם אדנוקרצינומה והם מסוגלים לייצר ריר11,12. ישנם חוסר עקביות בשאלה אם התאים יכולים לפתח ריסונים11,13. תאים Calu-3 הם גם מודל מתאים ללמוד וירוס סיניסיטיאלי בדרכי הנשימה (RSV) זיהומים להדביק תאי אפיתל דרכיהנשימה ciliated 14.
מלבד דגם התא, מערכת חשיפה אוטומטית (AES) משמשת לחשיפה לנוזל האוויר לתרסיסים15,16. ל- AES יש את היתרון שהוא משתמש בזרימת אוויר רציפה כדי לחשוף את דגם התא לתרסיסים. זאת בניגוד למערכות חשיפה אחרות לנוזלי אוויר, שבדרך כלל משתמשות בריכוזים גבוהים יחסית בתוך פרק זמן קצר כענן (כלומר, טיפות המכילות חלקיקים שמתיישבים במהירות)17,18,19. מערכות ענן אלה אינן משקפות חשיפה ריאלית ארוכת טווח לריכוזים נמוכים של חלקיקים. על ידי החלת זרימת אוויר רציפה באמצעות AES, מודל התא יכול להיחשף לריכוז נמוך של חלקיקים על פני תקופה ארוכה יותר, המשקף תנאי חשיפה מציאותיים. יתרון נוסף על פני מערכות ענן הוא של- AES יש אפשרות לחבר מכשירי אפיון חלקיקים, המאפשרים מדידה של גודל החלקיקים, ריכוז המספרים והמסה לאורך זמן. מגבלה של AES היא שהיא משתמשת בזרימות אוויר גבוהות יחסית בין 10 מ"ל לדקה ו 100 מ"ל / דקה.

<table><tbody><tr><td>0.01 M NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>0.1M (x10) PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-059</td><td></td></tr><tr><td>2',7'-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883</td><td></td></tr><tr><td>3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride)</td><td>Abcam</td><td>ab141525</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>15290</td><td></td></tr><tr><td>תחנת חשיפה אוטומטית</td> מגיב התפשטות <td>תאי Vitrocell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CPC</td><td>TSI inc., סנט פול מינסוטה, ארה"ב</td><td>3022</td><td></td></tr><tr><td>ערכת זיהוי ציטוטוקסיות LDH</td><td>Roche</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>DQ12</td><td>IOM</td><td></td><td>ננו-חומרים</td></tr><tr><td>ELISA Ready-SET-Go</td><td>Fischer Scientific</td><td>88-8086-86, 88-7399-88</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, ארה"ב</td><td>EVOM2-STX2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Greiner bio-one</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>מפצל זרימה</td><td>TSI inc., סנט פול, מינסוטה, ארה"ב</td><td>דגם 3708</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין דיאצטט (F-DA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>אולימפוס</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>בקרי זרימת מסה</td><td>MFC, ברונקהורסט, הולנד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול (דרגה אנליטית)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>מיקרובאלאנס</td><td>Sartorius, גטינגן, גרמניה</td><td>ME-5</td><td></td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי (MEM) + GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc. </td><td>41090</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>OPS</td><td>TSI inc., סנט פול, מינסוטה, ארה"ב</td><td>3339</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוקוס</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ.</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום חינם MEM</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>מים טהורים</td><td>Merck</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>SMPS</td><td>TSI בע"מ, סנט פול מינסוטה, ארה"ב</td><td>3936</td><td></td></tr><tr><td>זרבובית ריסוס</td><td>שליק, קובורג, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנני טפלון</td><td>Pall</td><td>R2PJ46</td><td></td></tr><tr><td>TEOM</td><td>Rupprecht & Patashnick NY, ארה"ב</td><td>סדרה 1400</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית רקמות</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>690175, 658175 660175</td><td></td></tr><tr><td>Transwell מוסיף</td><td>קורנינג</td><td>3460, 3462</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>טריפטן כחול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לחלקיקים מוטסים לבדיקות רעילות

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

לבדיקות רעילות של חלקיקים הנישאים באוויר, פותחו מערכות חשיפה לממשק נוזלי אוויר (ALI) לבדיקות חוץ גופיות על מנת לחקות תנאי חשיפה מציאותיים. זה מציב דרישות ספציפיות על מודלים תרבות התא. סוגי תאים רבים מושפעים לרעה מחשיפה לאוויר (למשל, התייבשות) ונשארים בני קיימא רק לכמה ימים. זה מגביל את תנאי החשיפה שניתן להשתמש בהם במודלים אלה: בדרך כלל ריכוזים גבוהים יחסית מוחלים כענן (כלומר, טיפות המכילות חלקיקים, אשר מתיישבים במהירות) בתוך פרק זמן קצר. תנאי ניסוי כאלה אינם משקפים חשיפה מציאותית לטווח ארוך לריכוזים נמוכים של חלקיקים. כדי להתגבר על מגבלות אלה השימוש בקו תא אפיתל הסימפונות האנושי, Calu-3 נחקר. תאים אלה יכולים להיות תרבותיים בתנאי ALI במשך מספר שבועות תוך שמירה על מורפולוגיה בריאה מונולייר יציב עם צמתים הדוקים. בנוסף, מודל סימפונות זה מתאים לבדיקת ההשפעות של חשיפות חוזרות ונשנות לריכוזים נמוכים ומציאותיים של חלקיקים הנישאים באוויר באמצעות מערכת חשיפה של ALI. מערכת זו משתמשת בזרימת אוויר רציפה בניגוד למערכות חשיפה אחרות של ALI המשתמשות בערפילית אחת המייצרת ענן. לכן, מערכת הזרימה הרציפה מתאימה לחשיפה חוזרת וממושכת לחלקיקים הנישאים באוויר תוך ניטור רציף של מאפייני החלקיקים, ריכוז החשיפה והמינון המועבר. יחד, מודל הסימפונות הזה, בשילוב עם מערכת החשיפה לזרימה רציפה, מסוגל לחקות תנאי חשיפה מציאותיים וחוזרים ונשנים לשאיפה שניתן להשתמש בהם לבדיקת רעילות.

מאמר זה מספק שיטה לפולחן וחשיפת תאי אפיתל הסימפונות האנושיים ב- ALI המחקה תנאי חשיפה מציאותיים וחוזרים ונשנים לשאיפה שניתן להשתמש בהם לבדיקת רעילות. המאפיינים של מודל התא ושל מערכת החשיפה חיוניים להשגת מודל חשיפה לשאיפה מציאותית שניתן להשתמש בו לחשיפות חוזרות ונשנות. התוצאות על מאפיינים אלה מוצגות להלן.
דרישות ובחירה של מודל התא
בעת בחירת מודל תא מתאים, יש לקחת בחשבון את המאפיינים הבאים:
<ol><li>מודל התא צריך להיות מסוגל ליצור monolayer confluent עם צמתים הדוקים מתפקדים כדי לחקות את מחסום הריאות.</li>
<li>דגם התא אמור להציג ביצועים מיטביים כאשר הוא נחשף שוב ושוב לאוויר ממוזג (טמפרטורה ולחות).</li>
<li>מודל התא צריך להגיב לחשיפה.</li>
</ol>מחקר זה התחיל עם ארבעה קווי תא אפיתל אנושיים שונים: 16HBE, Calu-3, H292, ו BEAS-2B. כל אלה נמצאים בשימוש נרחב עבור בדיקות רעילות של ננו וכימיקלים. מתוך ארבעת קווי התאים, רק תאי Calu-3 מילאו את כל הדרישות לעיל. התאים יצרו מונולייר עם צמתים הדוקים (איור 3) שנשאר מחסום יציב לאורך זמן כפי שנמדד על ידי TEER, בעוד שקווי התאים האחרים לא יצרו מחסום או הראו ירידה בתפקוד המחסום כאשר הם מתרבים ב- ALI (איור 4). בנוסף, H292 ו- BEAS-2B נטו לגדול יתר על הרה לשכבות תאים מרובות כאשר הם מתורבתים לתקופה ארוכה יותר. פולחן התאים השקוע המסורתי ופולחן ALI היו שונים מאוד, כי אצל החומרים המזינים של ALI היו זמינים רק מהצד הבזולטרלי והתאים נחשפו לתנאים יבשים בצד הקופי. תנאים אלה יכולים לגרום ללחץ על מודלים התא, אשר ניתן לראות על ידי מדידת הכדאיות של התא לאורך זמן. קווי התאים 16HBE, H292 ו- BEAS-2B הראו כולם שחרור LDH מוגבר כאשר הם מתרבים ב- ALI, בעוד שתאי Calu-3 הראו שחרור LDH קל בלבד (איור 5).
לאחר מכן נבדקה תגובת מודל קאלו-3 לחומרים. כחומר שליטה חיובי, LPS ניתנה באמצעות ערפיליות לצד האפי של המודל. המינון שהופקד היה 0.25 מיקרוגרם / ס"מ2. תאי קאלו-3 הראו תגובה לליפוליסכריד (LPS) על ידי עלייה בשחרור LDH ובשחרור אלפא של גורם נמק הגידול (TNF-α)(איור 6).
לבסוף, המונולאייר קאלו-3 נחשף לננו-חומרים של סיליקה קוורץ (DQ12) (IOM, אדינבורו). סיליקה גבישית יכולה לגרום לסיליקוזיס ועלולה גם לגרום לגידולים בריאות. לכן, הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן (IARC) סיווגה סיליקה גבישית כקבוצה I מסרטן אנושי20. מנגנון הפעולה של סיליקה גבישית נחשב באמצעות אינדוקציה של דלקת מתמשכת הנגרמת על ידי משטח תגובתי שלה21,22,23. מספר מחקרי vivo הן בחולדות והן בעכברים מדווחים על אינדוקציה של שינויים דלקתיים והיסטופטולוגיה, כולל גידולים ופיברוזיס, לאחר חשיפה לשאיפה לסיליקה גבישית24,25,26,27,28,29. כל ההשפעות הללו נצפו לאחר חשיפה חוזרת ונשנית ו/או מעקב ארוך טווח. מודל Calu-3 שימש כדי לחקור אם התצפיות ממחקרי in vivo ניתן לחקות באמצעות מודל במבחנה שיכול להיחשף שוב ושוב על עלי.
Calu-3 תאים נחשפו במשך 3 שבועות רצופים, 5 ימים בשבוע, 4 שעות ביום כדי DQ12. המינון שהופקד נמדד באמצעות QCM. המינון המופקד הממוצע היה 120 ng / cm2 ליום, עם מנה מצטברת של 1.6 מיקרוגרם / ס"מ2, בדומה למינונים גרימת השפעה vivo. מאפייני חלקיקים אחרים מוצגים בטבלה 1. לאחר 3 שבועות של חשיפה, DQ12 לא גרם להשפעות משמעותיות ב- TEER, בכדאיות התא ובשחרור חלבון כימותרפי מונוציט 1 (MCP-1), בהשוואה לבקרת האוויר הנקי (איור 7). ככל שצפויה רעילות רבה יותר של DQ12 בהתבסס על נתוני in vivo, תגובתיות החלקיקים נבדקה באמצעות בדיקה תאית על פי הפרוטוקול הממוטב במסגרת GRACIOUS של פרויקט האיחוד האירופי (תוצר 5.3). התגובה של אצוות DQ12 הייתה נמוכה מהצפוי (איור 8), סדרי גודל נמוכים יותר בהשוואה לחלקיקי הבקרה החיוביים פחמן שחור (CB). חוסר תגובתיות זה עשוי להסביר את היעדר תגובת רעילות במודל Calu-3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig01.jpg"> איור 1: תחנת החשיפה האוטומטית (AES). הדמות השמאלית מראה את החלק החיצוני של הארון עם לוח המגע. ל- AES שלוש רמות עם מודולי חשיפה: הרמה העליונה לחשיפות לאוויר נקי, והרמה האמצעית והתחתונה לחשיפות אירוסול. האיור הנכון מציג את מודול החשיפה שבו ממוקמים תוספות עם תאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig02.jpg"> איור 2: ייצוג סכמטי של כיוונון החשיפה. משמאל לימין: 1) המתלה ENM מחובר זרבובית ספריי באמצעות משאבה peristaltic; 2) באמצעות אוויר דחוס זרבובית ספריי ערפילית המתלים ENM ובאמצעות תא ערבוב האירוסולים מובלים AES; 3) רגע לפני הכניסה ל- AES, מכשירי אפיון אירוסול מחוברים: SMPS, OPS, CPC ו- TEOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig03.jpg"> איור 3: תמונה מייצגת של תאי Calu-3 לאחר שהתבצבות בממשק הנוזלי-אוויר (ALI) למשך 10 ימים. פלואורסצנטי מיקרוסקופיה תמונה של תאים Calu-3 לאחר culturing ב ALI במשך 10 ימים. חלבון צומת הדוק ZO-1 מוכתם בירוק, גרעינים של התאים מוכתמים בכחול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig04.jpg"> איור 4: התנגדות חשמלית טרנספיתליאלית (TEER) של ארבעה קווי תאים שונים במהלך תקופת תרבות של 21 ימים. ערכי TEER של 16HBE, Calu-3, H292 ו- BEAS-2B כאשר הם מתורבתים במשך 21 יום: 7 הימים הראשונים שקועים, ולאחר מכן 14 ימים ב- ALI. ערכי TEER תוקנו עבור התנגדות הרקע של ההוספה והוכפלו על-ידי שטח הפנים של ההוספה. הסימנים ופסי השגיאה מייצגים את הערך הממוצע ואת סטיית התקן של שש הוספות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig05.jpg"> איור 5: שחרור LDH של ארבעה קווי תאים שונים במהלך תקופת תרבות של 21 ימים. שחרור LDH של 16HBE, Calu-3, H292 ו- BEAS-2B כאשר הוא מתורבת במשך 21 ימים: 7 ימים שקועים, ואחריו 14 ימים ב- ALI. ערכי LDH המוצגים הם יחסיים למהדורת LDH המרבית לכל סוג תא. הסימנים ופסי השגיאה מייצגים את הערך הממוצע ואת סטיית התקן של חמש הוספות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig06.jpg"> איור 6: השפעות תאיות בתאי Calu-3 החשופים ל- LPS. תאים Calu-3 נחשפו באמצעות ערפילית ענן ל 0.25 מיקרוגרם / ס"מ2 LPS. (A)המרת WST-1. (B)שחרור LDH. (C)שחרור TNF-α לאחר חשיפה LPS. הסימנים ופסי השגיאה מייצגים ערכים ממוצעים וסטיות תקן של שלוש הוספות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig07.jpg"> איור 7: השפעות תאיות בתאי Calu-3 החשופים לננו-חומרים DQ12. Calu-3 תאים נחשפו במשך 3 שבועות (4 שעות ליום, 5 ימים בשבוע) כדי DQ12 nanomaterials, על 120 ng / cm2 ליום, מינון מצטבר של 1.6 מיקרוגרם / ס"מ2. (A) ערכי TEER. (B)שחרור LDH. (C)MCP-1 שחרור לאחר חשיפה DQ12. כל הסימנים וקווי השגיאה מייצגים ערכים ממוצעים וסטיות תקן של שלוש הוספות עבור הפקדים ושש הוספות עבור החשיפה ל- DQ12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig07large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig08.jpg"> איור 8: תגובתיות תאית של DQ12. DQ12 היה דגירה עם 2ʹ,7ʹ-Dichlorofluorescein Diacetate (DCFH-DA) בדיקה כדי לזהות תגובתיות פני השטח שלה. כשליטה חיובית, חלקיקי פחמן שחור (CB) נכללו. בהשוואה ל- CB, DQ12 יש תגובתיות משטח נמוך מאוד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig08large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מסת חלקיקים (μg/m3)</td>
			<td>מספר חלקיקים (#/cm3)</td>
			<td>גודל חלקיק ניידות (nm)</td>
			<td>סטיית תקן גיאומטרית</td>
			<td>גודל חלקיק אופטי (μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2969 (418)</td>
			<td>83983 (10215)</td>
			<td>66.6</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.1 (1.3)</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מאפייני חשיפה DQ12. ערכים מוצגים כממוצע עם סטיית תקן בסוגריים מרובעים.

המתוארת היא תרבות התא ושיטת החשיפה של מודל הסימפונות במבחנה לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לשאיפת חלקיקים לבדיקות רעילות.

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לתרבית ולחשוף תאי אפיתל סימפונות אנושיים דרך האוויר. זהו מודל מציאותי יותר לחקר חשיפת הריאה לחלקיקים נשאפים. תאי הריאה התכוננו בשיטות אלה, כדי להידמות לסביבה האמיתית בריאה. התאים ייצרו ריר, ייצרו מחסום הדוק, ויישארו ברי קיימא למשך מספר שבועות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור השפעות רעילות של חלקיקים הנישאים באוויר. זה יכול לשמש גם לחקר מחלות זיהומיות של דרכי הנשימה ותרופות הנלקחות בשאיפה. כאשר מנסים פרוטוקול זה בפעם הראשונה, זכור שיצירת זריז וגמיש דורשת ידע של מומחה. זה גם דורש ציוד ייעודי למדידה. התחל בדילול התאים במדיום תרבית תאים מחומם מראש או CCM, לריכוז של 500,000 תאים למיליליטר להכנסות של 6 בארות. ו -250,000 תאים למיליליטר עבור תוספות של 12 בארות. מניחים צלחת תרבית תאים עם תוספות בתנאים אספטיים, וממלאים את הצד הצדדי הבסיסי ב-CCM מחומם מראש.לאחר ערבוב תרחיף התאים, פיפטה אותו על גבי הממברנה בתוספת תרבית התאים. מכסים את הצלחת ומדגרים אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. תרבו את התאים בתנאי שקיעה במשך שבעה ימים, כדי לאפשר להם להגיע למפגש, והחליפו את ה-CCM כל יומיים-שלושה. כדי למדוד את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתלית, השתמש בוולטוממטר אפיתל טעון, בתוספת סט אלקטרודות צ'ופסטיק. נקו את האלקטרודות עם 70% אתנול. מניחים את האלקטרודה הארוכה יותר באמצעי התרבות החיצוני, עד שהיא נוגעת בתחתית המנה. והאלקטרודה הקצרה יותר במדיה, מבלי לגעת בקרום. התחל לאסוף מדידות על התוספת הריקה ללא תאים. המתן עד שהמדידה תתייצב ורשום את ההתנגדות באוהם. מדידה זו היא ההתנגדות של קרום ההכנסה ללא תאים או התנגדות ריקה. חזור על המדידה עבור כל תוספת, והחסר את ההתנגדות הריקה כדי להשיג את ההתנגדות האמיתית, והכפל בשטח הפנים של התוספת. הסר את המדיום מהצד האפיקלי של התוספות והוסף CCM מחומם מראש לצד הבסיסי של הבאר. המדיום צריך לגעת בקרום מלמטה, אך לא לדלוף לחלק העליון של התוספת. תרבו את התאים בממשק האוויר-נוזל באינקובטור, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני במשך שבעה ימים. החלפת המדיום הבסיסי כל יומיים-שלושה. זמן קצר לפני החשיפה לחלקיקים, הכינו תרחיף ננו-חלקיקים של 1%. הרטיבו מראש את ה-NPs עם 96% אתנול. הוסף מים טהורים לריכוז סופי של 1% NPs.שים את הבקבוקון בכוס על קרח. סוניקציה של התרחיף למשך 16 דקות, הוסף ערבוב לבקבוק עם הפיזור, ואז חבר את הבקבוק למשאבה פריסטלטית באמצעות צינור קטן והתאם את הזרימה ל -25 מיליליטר לשעה. יום לפני החשיפה הפעילו את עמדת החשיפה האוטומטית או AES ואפשרו לארון להגיע לטמפרטורה של 37

an-air-liquid-interface-bronchial-epithelial-model-for-realistic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תאים אפיתל ריאתי יכול להיות מבודד דרכי הנשימה של עכברים תרבותי בממשק אוויר נוזלי כמודל של אפיתל הנשימה מובחן. פרוטוקול מתואר לבידוד, culturing וחשיפת תאים אלה לעשן סיגריות המיינסטרים, כדי ללמוד התגובות מולקולרית רעלן זה סביבתיים.

בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי

פרוטוקול זה נועד להדגים שיטת חשיפה של תרביות תאים לכימיקלים רעילים בשאיפה. חשיפה של ממשק אוויר נוזלי מובחן תרבויות (עלי) של תאי אפיתל דרכי הנשימה מספקת מודל ייחודי של חשיפת דרכי הנשימה לגזים רעילים כגון כלור. בכתב יד זה אנו מתארים השפעה של חשיפת כלור בתרבויות ממשק אוויר הנוזלי של תאי האפיתל ותרבות שקועה של שריר לב. במבחנה מערכות חשיפה לאפשר מחקרים מכניסטית חשובים להעריך מסלולים כי אז יכול להיות מנוצל כדי לפתח סוכנים טיפוליים חדשניים.

בדגם תרבית תאים במבחנה לרעילה בשאיפת בדיקות כימיות

מטרת פרוטוקול זה היא לחשוף מודלים תלת-ממדיים של רקמות הסימפונות והאף האורגנוטיפיים האנושיים לעשן סיגריות מיינסטרים (CS) בממשק אוויר-נוזל. לאחר מכן נחקרת ההשפעה של CS על הרקמות באמצעות בדיקת פעילות ציטוכרום P450, מדידת פעימות ריסים וגישה של ביולוגיה מערכתית.

הערכת השפעה של חשיפה חוזרת ונשנית של דוגמניות תרבות רקמות Organotypic 3D הסימפונות ובאף לעשן סיגריות שלמות

נעשה שימוש בליתוגרפיה רכה כדי לייצר מודל מייצג בקנה מידה אמיתי של דרכי נשימה ריאתיות המתרחבות ומתכווצות מעת לעת, ומחקות תנועת נשימה פיזיולוגית. פלטפורמה זו משחזרת זרימות אצינריות נשימתיות על שבב, וצפויה להקל על חקירה ניסויית של דינמיקת אירוסול בשאיפה ושקיעה באצינוס הריאתי.

מודל Microfluidic של Biomimetically נשימה ריאתי acinar איירווייס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע חשיפות תרסיס סלולרי נייד ולמדוד את תגובת תאי. השיטה משתמשת בתאים, גדל הממשק אוויר נוזלי, מחקה ויוו פיזיולוגיה. תגובה תאית nanoparticle נחושת אירוסולים נצפתה כמו לחץ חימצוני באמצעות הדור מינים חמצן תגובתי cytotoxicity כמו שחרור לקטט דהידרוגנאז.

חדש נייד במבחנה חשיפה קלטת לדיגום אירוסול

אנו מציגים חזקה, להעברה וניבוי מערכת חשיפה מחוץ למערכת להקרנה וניטור של חלקיקים מוטס בנוגע לרעילות חריפה של הריאות שלהם על ידי חשיפת מעובד בתאי הריאה האנושיים בממשק האוויר-נוזלי (ALI).

הערכת הרעלת שאיפת חריפה של חלקיקי מוטס על ידי חשיפת תאי ריאה אנושיים בממשק האוויר-נוזלי

אנו מתארים פרוטוקול עבור מודל תלת מימדי של שיתוף תרבות של דרכי הנשימה הנגועות, באמצעות CFBE41o- תאים, מקרופאגים THP-1, ו פסאודומונס aeruginosa, הוקמה בממשק אוויר נוזלי. מודל זה מספק פלטפורמה חדשה כדי לבדוק בו זמנית יעילות אנטיביוטיקה, פונקציית מחסום אפיתל, סמנים דלקתיים.

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

מוצג כאן פרוטוקול לבידוד מונוציט דם אנושי ראשי, כמו גם ההבידול שלהם לתוך מקרופאגים ותאים דנדריטיים והרכבה עם תאים אפיתל לתוך מודל ריאות אנושי רב תאי. תגובות ביולוגיות של cocultures המורכבים תאים חיסוניים מובדלים או חדוציטים מבודדים טריים או מופשרים, עם חשיפה לגירוייםדלקתיים, מושווים.

מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים

מוצגת כאן שיטה ניתנת לשחזור, משתלמת וחזקה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל סימפונות ראשוניים עבור ביו-בנקאות לטווח ארוך ויצירת תאי אפיתל ממוינים על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל.

בידוד תאי אפיתל של הסימפונות מרקמת ריאה שנכרתה לצורך ביו-בנקאות והקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל ממוינות היטב

תרבית ממשק אוויר-נוזל משמשת בדרך כלל לפיתוח אפיתל דרכי נשימה פסאודוסטרטי על ידי התמיינות תאי אפיתל סימפונות אנושיים תקינים ראשוניים המחקים את הצד האפי של נתיב האוויר של הריאה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול קל לקביעת איכותו על ידי ניטור תכונותיו הביופיזיקליות, כגון תפקוד ריסוני ושלמות הממברנה.

קביעת תפקוד ריסני ואטימות הממברנה של אפיתל דרכי הנשימה הריאה הפסאודוסטרטי

אנו מקימים מודל מבחנה סטנדרטי לחקר חשיפה לאדי קנאביס בממשק אוויר-נוזל. מודל זה מספק גישה שיטתית לבחינת ההשפעות של קנאביס מאודה, תוך התייחסות לעניין הגובר במכשירי אידוי קנאביס כחלופה לעישון.

במבחנה חשיפות קנאביס של תאי אפיתל ריאה בממשק אוויר-נוזל

למדו ליצור מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר מתאי אפיתל קוציים אנושיים לבדיקות רעילות חוזרות של חלקיקים מוטסים. השיטה מאפשרת חקר מציאותי של חשיפת הריאות לאורך מספר שבועות.

מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לחלקיקים מוטסים לבדיקות רעילות

גלה סרטונים נוספים