Name: בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: למדו שיטה לבידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים מחדרי ופרוזדור לב עכבר בוגר. הפרוטוקול מגביר תפוקת תאים וחיוניות לחקר פיזיולוגיה ופתולוגיה לבבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.A.B. נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (1F31HL140850), קרן ARCS, Inc., סן דייגו פרק, והוא ריס-Stealy קרן המחקר פיליפס Gausewitz, MD חוקר של מכון הלב SDSU. E.A.B ו-A.S.B נתמכו על ידי קרן אינמורי. CCG על ידי (NIH) מעניק R01 HL135893, R01 HL141463 ו HL149931.

<ol><li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li>
<li>Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+of+adult+mice+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture.</a> Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Jin, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+decreases+myocardial+ischemia%2Freperfusion+damage+and+links+ER+stress+and+oxidative+stress+signaling+pathways+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">ATF6 decreases myocardial ischemia/reperfusion damage and links ER stress and oxidative stress signaling pathways in the heart.</a> Circulation Research. 120 (5), 862-875 (2017).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54012(2016).</li>
<li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes+for+Cell+Signaling+and+in+vitro+Cardiac+Hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), e51357(2014).</li>
<li>O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+cardiac+myocytes+for+signaling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22AfCS+Research+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies.</a> AfCS Research Reports. 1 (5), 1-9 (2003).</li>
<li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improvised+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">An improvised isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61 (1), 93-101 (2011).</li>
<li>Piper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 14 (7), 397-412 (1982).</li>
<li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal and aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688(2018).</li>
<li>Jansen, H. J., Rose, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Atrial+Myocytes+from+Adult+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59588(2019).</li>
<li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Cardiomyocyte+NLRP3+Inflammasome+Signaling+Promotes+Atrial+Fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhanced Cardiomyocyte NLRP3 Inflammasome Signaling Promotes Atrial Fibrillation.</a> Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).</li>
<li>Cha, Y., Redfield, M. M., Shen, W., Gersh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+Fibrillation+and+Ventricular+Dysfunction%3A+A+Vicious+Electromechanical+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Atrial Fibrillation and Ventricular Dysfunction: A Vicious Electromechanical Cycle.</a> Circulation. 109 (23), 2839-2843 (2004).</li>
<li>Issa, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+atrial+size+and+heart+failure+hospitalization+in+patients+with+diastolic+dysfunction+and+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Echography%22%5BJournal%5D)">Left atrial size and heart failure hospitalization in patients with diastolic dysfunction and preserved ejection fraction.</a> Journal of Cardiovascular Echography. 27 (1), 1-6 (2017).</li>
<li>de Bold, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+natriuretic+factor%3A+a+hormone+produced+by+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Atrial natriuretic factor: a hormone produced by the heart.</a> Science. 230 (4727), 767-770 (1985).</li>
<li>McGrath, M. F., de Bold, M. L., de Bold, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+function+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The endocrine function of the heart.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 16 (10), 459-477 (2005).</li>
<li>Doevendans, P. A., Daemen, M. J., de Muinck, E. D., Smits, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+phenotyping+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular phenotyping in mice.</a> Cardiovascular Research. 39 (1), 34-49 (1998).</li>
<li>Banerjee, I., Fuseler, J. W., Price, R. L., Borg, T. K., Baudino, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cell+types+and+numbers+during+cardiac+development+in+the+neonatal+and+adult+rat+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Determination of cell types and numbers during cardiac development in the neonatal and adult rat and mouse.</a> American Journal of Physiology. 293, 1883-1891 (2007).</li>
<li>Jugdutt, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+remodeling+after+infarction+and+the+extracellular+collagen+matrix%3A+when+is+enough+enough%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough.</a> Circulation. 108, 1395-1403 (2003).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiac+progenitors+that+survive+in+the+ischemic+human+heart+after+ventricular+myocyte+death%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiac progenitors that survive in the ischemic human heart after ventricular myocyte death.</a> Scientific Reports. , 7(2017).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485, 599-604 (2012).</li>
<li>Limana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bcl-2+overexpression+promotes+myocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6257-6262 (2002).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+cardiac+cellular+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2015).</li>
<li>Chen, W., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+inflammatory+and+fibrogenic+pathways+in+heart+failure+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging.</a> Heart Failure Reviews. 15, 415-422 (2010).</li>
<li>Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contracture+and+the+calcium+paradox+in+the+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Contracture and the calcium paradox in the rat heart.</a> Circulation Research. 61 (4), 560-569 (1987).</li>
<li>Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+to+adult+mouse+cardiomyocytes+is+selectively+influenced+by+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium.</a> Journal of Gene Medicine. 5 (9), 765-772 (2003).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

איכות התאים המבודדים באמצעות ההליך המתואר כאן, כפי שנקבע על ידי תשואת התא ובריאות כללית של התאים בתרבות, תלויה בגורמים רבים לשליטה. החל עם העכבר עצמו, זה תועד כי הלחץ שהוטל על החיה יכול להשפיע לרעה על תשואת התא ואת הכדאיות בתרבות, ככל הנראה בשל עודף קורטיזול מערכתי, קטכולאמינים, ואת המצב hypercontractile של רקמת לב2,5,7. מסיבות אלה, יש לנקוט צעדים כדי למנוע הבהבת החיה לפני ההקרבה. אמצעים אלה כוללים כיסוי הכלוב של החיה והגבלת זמן מחוץ vivarium לפני ההקרבה. הפרין וברביטורטים רבים המשמשים בדרך כלל המתת חסד יכולים להשפיע על מסלולי איתות; לפיכך, יש להתאים אישית את השיטה האופטימלית של המתת חסד בהתאם. לגיל החיה יש השפעה ניכרת על האיכות והכדאיות של תאים מבודדים, ככל הנראה עקב הצטברות מתקדמת של פיברוזיס ביניים המתרחשים במקביל לתהליך ההזדקנות, אשר יכול להשפיע על עיכולרקמות 25. בנתונים שאינם מוצגים כאן, בעוד שהשיטה המתוארת לעיל פועלת בעכברים בני עד 78 שבועות, איכות התאים הייתה נמוכה יותר בבעלי חיים מבוגרים אלה.
הצעד הקריטי ביותר בתהליך הבידוד המתואר, כמו גם פרוטוקולים אחרים הכוללים מנגנון לנגנדורף לזלוף מדרדר, הוא הקנציה והזלוף הראשוני של הלב. לקבלת תוצאות אופטימליות, הזמן מ explantation לב כדי שימורים של העורקים העולה חניכה של זלוף צריך לקחת לא יותר מ 90 s. בנוסף לזמן, שני גורמים חשובים נוספים הם עומק הצינורית ואפשרות להכניס אמבולי אוויר ממנגנון הזלוף. לפיכך, יש לקדם את הצינורית לתוך אבי העורקים העולה כדי לא להיכנס לשורש אבי העורקים ולחסום את שסתום אבי העורקים, אשר יפגע בזלוף כלי הדם הכליליים.
במהלך תהליך העיכול, חשוב לבדוק באופן קבוע את קשיחות הלב, כדי למנוע חשיפה ממושכת לקולאזנאז אנזים העיכול, אשר מפחית סובלנות סידן מיוציטים לב. הפרוטוקול שתואר לעיל להחזרת סידן לתרביות מיוציטים חדריות מבודדות נועד להגביל מוות מיוציטים לבביים באמצעות זרם סידן בלתי הולם באמצעות ערוצי סידן המופעלים בחנות. יש לציין כי החזרת הסידן החורגת לא צריכה להתבצע עבור תרבויות מיוציטים בין-תאיות מבודדות, שכן זה יקדם מוות תאי במהלך תרבות לטווח קצר וארוך12. לאמצעי זהירות נוספים, מאגרי זלוף ועיכול המשמשים כאן כוללים את מעכב התכווצות שריר הלב butanedione monoxime (BDM) כדי למנוע היפרcontraction של מיוציטים מבודדים, כמו גם את פרדוקס הסידן, שניהם משפיעים על הכדאיות myocyte26. עם זאת, יש לציין את המעבר מ- BDM לבביסטין, שכן הוא הסוכן האנטי-התכווצות המועדף בשמירה על מדיה עבור מיוציטים לבביים מבודדים. בנתונים שאינם מוצגים, blebbistatin מעניק כדאיות רבה יותר לתרבות ארוכת טווח של מיוציטים לבביים מבודדים.
מיד לאחר הבידוד, חשוב לשקול את ההשלכות של תרבות ארוכת טווח של תאי לב, במיוחד מיוציטים. הבידוד הלבבי שאינו מיוציטים ופרוטוקול culturing המתואר כאן מבוסס על שיטות נפוצות המנצלות את הצפיפות ותכונות הדבק השונות של תאי לב שונים. היתרון של מיוציטים שאינם מיוציטים הוא פוטנציאל ההתרחבות הגבוה שלהם בתרבות; לפיכך, שלא כמו מיוציטים לבביים, הם נוחים להנצחה. עם זאת, ידוע כי culturing תנאים, כולל תוספי בינוני עם FBS, יכול להשפיע על תפקוד מיוציטים לב27. המדיה התרבותית המתוארת כאן נועדה לייעל את הכדאיות ולהגביל את ההפרעות התפקודיות, במיוחד עבור מיוציטים בין-וסתיים מבודדים. בעוד שלא נצפתה יכולת התכווצות לקויה במיציטים לבביים מבודדים לאחר התרבות בהיעדר תוספי blebbistatin, מחקרים המתמקדים באלקטרופיזיולוגיה, התכווצות, ותא יחיד אחר באיתות מולקולרי מבוסס vivo צריכים להתבצע זמן קצר לאחר הבידוד, כאשר המבנה הסרקומי והחתימה המולקולרית עדיין מחקים את זה של הלב שלם.
מאפיין בולט של מיוציטים פרוזדורים הוא היכולת שלו לאור ירח כתא אנדוקריני עם יכולת הפרשה עצומה, בנוסף לתפקודם המתכווץ. בתנאים פיזיולוגיים, מיוציטים פרוזדוריים מייצרים כמויות גדולות של ANP, המאוחסן ברשתית האנדופלזמית ובגרגרי הפרשה גדולים בעלי ליבה צפופה הצפויים לאקסוציטוזיס מוסדר עם קבלתגירוי 16,17. בעוד שמחקרי מיוציטים אסציוניים מבודדים רבים מתמקדים בתכונות האלקטרופיזיולוגיות הייחודיות שלהם, זהו המחקר הראשון שמתכנן מדיה תרבותית. זה מאפשר הכדאיות לטווח ארוך, כמו גם קידום של הפונקציות המתוחזקות של תכונות אנדוקריניות והתכווצות של מיוציטים אסטראליים. שיטה חדשנית זו עבור culturing, כמו גם בידוד בו זמנית של כל סוגי התאים מתוך תאים אבריים חדריים מלב עכבר יחיד, יהיה שימושי ויעיל למחקרים על המאפיינים הפיזיולוגיים והפתופיזיולוגיים של מיוציטים בין אבות וחדריים כאחד.

תרבות התאים העיקרית היא משאב אינטגרלי המציע סביבה מבוקרת למחקרים מכניסטיים מפורטים של תפקוד מיוציטים לבביים. בשל האופי העמיד יותר שלהם וקלות הבידוד, ארוסת עכברוש יילודים ומיוציטים חדריים היו המקור המשותף לתרביות תאים כאלה1. עם זאת, מיוציטים של עכברים בוגרים חדריים (AMAMs ו- AMVMs) רצויים מאוד למחקרים במבחנה, מכיוון שהמאפיינים המולקולריים והתפקודיים שלהם מחקים טוב יותר את אלה של תאי לב בוגרים. לכן, הם הפכו רלוונטיים למחקרים הקשורים פתולוגיות לב, שרובם מתפתחים אצל מבוגרים2.
יתר על כן, הזמינות והשימוש במודלים של עכברים מהונדסים ומחלות מרחיבים את התועלת של מיוציטים לבביים בוגרים מבודדים. פרוטוקולים לבידוד ותרבות העכבר AMVMs למחקרים קצרי טווח וארוכי טווח תוארו בפרסומים קודמים רבים2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. לשם השוואה, פרוטוקולים מעטים תוארו לבידוד של AMAMs. יתר על כן, אלה המתוארים מותאמים בעיקר למחקרים חריפים של תאים מבודדים טריים, ללא פרוטוקול culturing לטווח ארוך המתואר עד כה11,12,13. ככזה, פרוטוקולי בידוד AMAM לא נועדו לספק את השירות ואת צדדיות של פרוטוקולים שפורסמו עבור הבידוד והתרבות של AMVMs. יתר על כן, בעוד המחקרים החלוציים לבידוד של AMAMs ו- AMVMs הוכיחו תושייה, אין פרוטוקולים לבידוד ותרבות אופטימליים בו זמנית של AMAMs ו- AMVMs, מה שמוביל לשימוש יעיל בלב כולו לכל הכנה.
עד כה, פרוטוקולי בידוד AMAM ו- AMVM שפורסמו לא תוכננו לבידוד בו זמנית של שני סוגי התאים, מכיוון שלרוב המחקרים על תפקוד פרוזדור וחדר יש מיקוד ספציפי לתא. לדוגמה, AMAMs משמשים בעיקר כדי ללמוד אלקטרופיזיולוגיה מיוציטים פרוזדורים, בין היתר בגלל העניין פרפור פרוזדורים (AF), הפרעות קצב הלב הנפוצות ביותר בארה"ב. עם זאת, AF אינה מחלה המשפיעה על atria בבידוד, וזה כבר מעורב כבעל תפקיד סיבתי קל עד חמור תפקוד לקוי של החדר השמאלי14. יתר על כן, אלקטרוקרדיוגרמות מחולים עם אי ספיקת לב עם שבר פליטה משומר (HFpEF) הוכיחו כי גודל האבסורד השמאלי הוא אחד המנבאים החזקים ביותר עבור רגישות לאי ספיקת לב15.
בנוסף לתפקידו באלקטרופיזיולוגיה והתכווצות, האטריום הוא גם איבר אנדוקריני, מפריש קרדיוקינים (כלומר, פפטיד נטריורי פרוזדורי [ANP]) המווסת באופן הומיאוסטטי את לחץ הדם ואת נפח16,17. יתר על כן, ANP (ככל הנראה מ myocytes אבריאלי) יש תפקיד מגן בולט אנטי היפרטרופי מיוציטים חדריים16,17. אמנם יש השלכה חזקה של תקשורת נוירוהורמונלית בין atria ו ventricles במצבי מחלה שונים, המנגנונים שבבסיס תקשורת זו לא נחקרו במלואם. נקודה זו באה לידי ביטוי עוד יותר על ידי גל המחקר המתמקד 1) התפקיד של שאינם מיוציטים (במיוחד fibroblasts לב ותאי החיסון) בלב החולה ו 2) איך שיפוץ לב כפונקציה של מחלה משפיע ישירות על הכדאיות מיוציטים לב ותפקוד לב גלובלי18,19,20,21,22. לכן, לימוד תאי לב הן atria והן חדרים היא גישה הכרחית כדי לקבל תמונה מלאה יותר של תפקידם פתופיזיולוגיה לב.
הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד הסימולטני של מיוציטים ובלתי מיוציטים בין-חדריים ולא מיוציטים מלב עכבר יחיד בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. בנוסף, שיטה זו היא הראשונה לתאר את התנאים האופטימליים הדרושים לשמירה על תרבויות של מיוציטים לב פרך, כמו תנאים לשמירה על תרבויות של מיוציטים חדריים כבר פורסמו.

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>1 ליטר מאגר מעוטר במים</td><td>Radnoti</td><td>120142-1</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>5-0 חוט תפר משי</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>תא תאימות למלכודת בועות</td><td>Radnoti</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד נטול מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>קרניטין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C9500</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 2</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>קריאטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C0780</td><td></td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D2915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1; 1X)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 - מלקחיים עדינים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent micropscpe</td><td>Olympus X70</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (מופעל בחום)</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td>Lot # 206018</td></tr><tr><td>מספריים עדינים -</td><td>Sharp Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Brainps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>מגדלי סרט Fine</td><td>Science Tools</td><td>28030-04</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer (Bright-Line)</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Inosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין-טרנספרין-סלניום-X</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>איזוטמפ 105 אמבט מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC0858659</td><td></td></tr><tr><td>איזוטמפ 3006</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-874-182</td><td></td></tr><tr><td>Joklik שונה מינימום חיוני מדיה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M-0518</td><td></td></tr><tr><td>למינין ( טבעי, עכבר)</td> <td>Gibco</td><td>1795024</td><td>Lot # 1735572</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C / L משאבה קומפקטית במהירות משתנה בערוץ יחיד</td><td>קול-פאלמר</td><td>EW-77122-24</td><td></td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי (MEM 1X)</td> <td>Gibco</td><td>12350-039</td><td></td></tr><tr><td>ביולוגיה מולקולרית</td><td>כיתה קורנינג</td><td>מים 46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>עט סטרפטוקוקוס גלוטמין (100X)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיצים - 6 מ"מ כלי</td><td>מדע עדינים</td><td>15020-15</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T-8691</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

הבידוד והפולחן של מיוציטים לבביים מעכברים היו חיוניים לקידום ההבנה של פיזיולוגיה לבבית ופתופיזיולוגיה. בעוד בידוד מיוציטים מלבבות עכבר יילודים הוא פשוט יחסית, מיוציטים מהלב המורין הבוגר הם המועדפים. הסיבה לכך היא כי בהשוואה לתאי יילודים, מיוציטים בוגרים מדויק יותר recapitulate תפקוד התא כפי שהוא מתרחש בלב הבוגר vivo. עם זאת, מבחינה טכנית קשה לבודד מיוציטים לב עכבר בוגר בכמויות הדרושות ואת הכדאיות, אשר תורם למבוי סתום ניסיוני. יתר על כן, נהלים שפורסמו הם ספציפיים לבידוד של מיוציטים פרוזדוריים או חדריים על חשבון תאים פרוזדוריים חדריים שאינם מיוציטים. המתוארת כאן היא שיטה מפורטת לבידוד מיוציטים לבביים הן דרך האשורית והן החדרית, יחד עם מיוציטים לא-מיוציטים בין-מסלוליים חדריים, בו זמנית מלב עכבר יחיד. כמו כן מסופקים הפרטים עבור שיטות culturing תא ספציפי אופטימלי, אשר לשפר את הכדאיות של התא ותפקוד. פרוטוקול זה נועד לא רק לזרז את התהליך של בידוד תאי לב מורין למבוגרים, אלא גם כדי להגדיל את התשואה ואת הכדאיות של תאים לחקירות של תאי לב פרוזדוריים חדריים.

לב עכבר C57b6/j בן 10 שבועות מוביל בדרך כלל ל-75,000-150,000 מיוציטים א-טריים ו-1.0-1.5 x 106 מיוציטים חדריים, השווה לתשואה משוערת של 30%-50% עבור מיוציטים18,19. במהלך ומיד לאחר בידודים, מיוציטים לב קיימא צריך להופיע מוט בצורת ולא התכווצות. רוב מיוציטים לב מבודדים צריך להתאים את המורפולוגיה, המהווה אינדיקציה של זלוף יעיל. מורפולוגיה בצורת מוט יכולה גם להיות מנבא של הכדאיות. הפרוטוקול נועד לשפר את התשואה ואת הכדאיות של מיוציטים ולא מיוציטים מבודדים מלב עכבר חולה. יתר על כן, זה נבדק במודל של אי ספיקת לב הנגרמת על ידי עומס לחץ (נתונים לא מוצגים).
כדי לאשר בידוד הולם וניתן לשכפול של מיוציטים ולא מיוציטים מרקמת אבות ורקמות חדריות, התאים נצפו וצולמו בימים שונים בתרבות(איור 2). בנוסף, בוצעה תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך (qRT-PCR) כדי למדוד את רמות התמלילים שהיו ספציפיים לסוג התא. טרופונין T שריר הלב(Tnnt2)הוא סמן של מיוציטים לבביים והתבטא בחוזקה הן בתרביות מיוציטים לבביות הן מבחינה משפטית והן בתרבויות מיוציטים לבביות חדריות(איור 3A). לעומת זאת, פפטיד נטריורטי פרך (Nppa, אשר מתבטא בדרך כלל אך ורק מיוציטים לב פרך למבוגרים בתנאים פיזיולוגיים) ושרשרת אור מיוסין 2 (Myl2, שהוא גן ספציפי myocyte חדרית) באו לידי ביטוי באופן חזק במיוחד בתרבויות מיוציטים לב מפרזדוריים חדריים, בהתאמה (איור 3B, C).
סמני פיברובלסט, פקטור שעתוק 21 (Tcf21), קולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות הדם A (Pdgfra), ואשכול סמן תאים המופק ממונוציטט של התמיינות 68 (Cd68) באו לידי ביטוי אך ורק בתרבויות שאינן מיוציטים המבודדות הן מתאים פרוזדורים והן מחדרים חדריים (איור 3D-F). ההערכה היא כי שאינם מיוציטים להתפשר ~ 65% של כל תאי הלב וכי רוב אלה מקורם שושלת פיברובלסט או מונוציטים נגזר18,19,23,24. לפיכך, סמנים עבור שני שושלת אלה נבחרו להיות ייצוגיים, בהתחשב בהתעניינות באוכלוסיות הסלולר האלה במחקרים של מודלים ואטימולוגיות שונות של פתולוגיה לבבית.
חיסון של AMAMs ו- AMVMs עבור סמן t-tubule דיהידרופרידין (DHPR, שהוא ערוץ סידן תלוי מתח (L)-סוג) כמו גם קולטן ריאנודין (RYR2) הפגין t-tubules שלמים לאורך בידוד ותרבות לטווח ארוך (איור 4A,B). השפע של DHPR ולוקליזציה שהיה אופייני וייחודי למיוציטים אבריאליים חדריים הצביעו על נוכחותם של צינוריות. יתר על כן, קולוקליזציה של DHPR עם RYR2 immunostaining היה אינדיקטור של מבני דיאלאד שלמים. אימונוסטין עבור החלבון סרקומרי אלפא-actinin במיצ'יטים לב פרוזדוריים חדריים הביא דפוס פסים סרקומריים הצפוי. דפוס הפסים הסרקומי שימש להערכת הטוהר והכדאיות של מיוציטים לבביים מבודדים בשילוב עם צורה מורפולוגית בצורת מוט וכתמים גרעיניים עם TOPRO-3 (איור 4C,D; סגול ואדום). כצפוי, מיוציטים לבביים חדריים היו גדולים, והפגינו אורך ממוצע של ~ 150 מ"מ, ואילו מיוציטים לב פרך בממוצע ~ 75 מ"מ. יתר על כן, על ניתוח immunostaining, מיוציטים לב פרטלי (אבל לא מיוציטים לב חדריים) הציג ביטוי חזק של פפטיד נטריורטית פרזדורית (ANP) בתבנית מכתימה האופיינית לוקליזציה לרטיקולום אנדופלזמי וגרגרי הפרשה (איור 4C, D;ירוק).
מאפיין ייחודי מיוציטים לב אסטראלי הוא הסיווג שלה כתא אנדוקריני בנוסף לתא התכווצות. בעוד מיוציטים פרוזדורים מפרישים ANP בתנאים בסיסיים, הפרשת עולה בתגובה secretagogues (כלומר, אגוניסט אלפא-adrenergic, פנילפרין [PE]). יתר על כן, מיוציטים לב פרוזדורים להפריש ANP ושיתוף הפרשת לעבד חלק ההורמון ממצב מבשר שלה (Pro-ANP, 15 kD) לפפטיד המוצר (ANP 3kD)16,17. יכולת הפרשה זו ניתן לכמת באמצעות זיהוי immunoblot של ANP במדיה של מיוציטים לב אצטריים מבודדים בתגובה לטיפול PE חריפה (איור 4E). הפרשה זו ויכולת העיבוד של מיוציטים לב פנים נמצאה רגישה לתנאי culturing. לכן, זה הכרחי כי מדיום ציפוי מיוציטים פרסלי הוא בתוספת דקסמתזון, אינסולין, transferin, סלניום.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig1.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של זלוף לב מדרדר, עיכול ובידוד תאים. המוצגים הם השלבים העיקריים המעורבים בבידוד תאים הן מתאי האשכים והן מחדרי החדר בו זמנית מלב עכבר יחיד. (A) לב עכבר יחיד הוא משומר במהירות דרך העורקים העולה ו perfused באופן מדרדר. (B)הלב מופרד לרקמות פרוזדוריות חדריות להמשך עיכול והפרדה פיזית. (C) לאחר עיכול הולם, התאים מופרדים באמצעות סינון הכבידה לתוך סך של ארבעה שברים תאיים כי הם תרבותיים לניסויים הבאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig2.jpg"> איור 2: ניתוח מורפולוגי של מיוציטים לבביים מבודדים בחדרים ולא מיוציטים בתרבות. (A) מיוציטים בין-תאיים של עכבר בוגר מבודד (AMAMs),(B)עכבר בוגר שאינו מיוציטים (AMANMs), (C) מיוציטים חדריים של עכבר בוגר (AMVMs), או (D) ) עכבר בוגר שאינו מיוציטים (AMVNMs) היו מצופים ב 5 x 105 תאים / תא על ארבעה תאים (1.7 ס"מ 2 ) שקופיותזכוכיתבמדיה מצופה בהתאמה. תמונות שלב התקבלו בימים המצוינים בתרבות באמצעות מטרה 10x תחת מיקרוסקופ epifluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig3.jpg"> איור 3: ניתוח qRT-PCR מייצג של תרביות תאים מבודדות. RNA חולץ מיוציטים לב מבודדים טריים ולא מיוציטים, ורמות mRNA עבור סמני גנים ספציפיים לתאים נקבעו על ידי qRT-PCR4. (A) Tnnt2, טרופונין שריר הלב T (סמן מיוציטים לב); (B) Nppa, פפטיד נטריורטי מטריורי (סמן מיוציטים מטריאלי); (C) Myl2, שרשרת אור מיוסין 2 (סמן מיוציטים חדרי); (D) Tcf21, פקטור שעתוק 21 (סמן פיברובלסט); (E) Pdgfra, קולטן גורם גדילה נגזר טסיות הדם A (סמן פיברובלסט); (F) Cd68, אשכול של בידול 68 (סמן תא נגזר מונוציט). הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (*p ≤ 0.05 שונה מכל הערכים האחרים, כפי שנקבע על ידי ANOVA ואחריו הניתוח שלאחר הוק של ניומן קאול). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig4.jpg"> איור 4: ניתוח מורפולוגי ופונקציונלי מייצג של מיוקטי לב פרוזדוריים חדריים מבודדים. (A)AMAMs או (B) AMVMs היו מצופים ב 5 x 105 תאים / תא על ארבעה תאים (1.7 ס"מ2)שקופיות זכוכית במדיית ציפוי בהתאמה במשך 1 שעות כדי לאפשר הידבקות. זה היה ואחריו גם הזנה מחדש של מדיה ציפוי מיוציטים פרך או שינוי מיוציטים חדרית שמירה על מדיה בתוספת blebbistatin עבור 16 שעות נוספות. תרבויות תוקנו לאחר מכן אז immunostained עבור RYR2 (סגול), DHPR (ירוק), וכתם גרעיני TOPRO-3 (אדום). (C)AMAMs או (D) AMVMs היו מבודדים מצופים, לאחר מכן immunostained עבור a-actinin (סגול), ANP (ירוק), ו TOPRO-3 (אדום). מוצגות שתי תמונות מייצגות עבור כל סוג תא. (E)AMAMs היו מצופים ב 5 x 105 תאים / גם על צלחת תרבות 12 גם עבור 16 שעות במדיה ציפוי מיוציטים atrial. AMAMs טופלו לאחר מכן עבור 0.5 שעות עם הרכב או secretagogue ANP (פנילפרין, 50 מ"מ) לפני המדיה נאספו ונתון לניתוח immunoblot עבור ANP. לפני ניתוח immunoblot, דגימות מדיה היו צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר ולהבטיח כי ANP שנצפה היה תוצאה של הפרשה פעילה של AMAMs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

היי, אני כריס גלמבוטסקי. אני פרופסור לרפואה בקולג' לרפואה של אוניברסיטת אריזונה בפיניקס. ואני המנהל של המרכז התרגומי למחלות לב וכלי דם שנמצא גם כאן בפיניקס.ברצוני להציג בפניכם היום שני אנשים שהולכים להדגים את הטכניקה החדשה שלנו, ד"ר אריק בלקווד, עמית הפוסט-דוקטורט הבכיר שלי וחבר סגל בהכשרה, ועמיתת המחקר הבכירה מיס אלינה בילאל. פרוטוקולי בידוד מיוציטים לבביים נוכחיים מגבילים את כמות התאים ואת כדאיות התאים בתרבית, ויוצרים מבוי סתום ניסיוני לקידום ההבנה שלנו בפיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של הלב. פרוטוקול זה נועד לא רק להאיץ את תהליך בידוד תאי הלב של עכברים בוגרים, אלא גם להגדיל את תפוקת התאים ואת הכדאיות של תאי לב פרוזדורים וחדרים בו זמנית מלב עכבר יחיד.לטכניקה זו יש השלכות עמוקות על גילוי טיפולי וכי ניתן לאפיין טוב יותר מחלות כמו פרפור פרוזדורים ברמה ספציפית לסוג התא, מה שמאפשר זיהוי מטרות טיפוליות. אנו ממליצים לאנשים ללא ניסיון קודם במיקרוכירורגיה לתרגל את שלבי הוצאת אבי העורקים העולה והקנולציה בהרחבה לפני שהם מנסים את פרוטוקול הבידוד המלא. התחל בשימוש במספריים כדי לבצע חתך בעור בקו האמצע כדי לפתוח במהירות את החזה של עכבר C57 שחור 6J מורדם בן 10 שבועות מאמצע הבטן ללסת.היכנס לצפק ונקה את הסרעפת על ידי דיסקציה קהה. חתכו את כלוב הצלעות עם חתכים לאורך דופן בית החזה בהיבט הצדדי של שני הצדדים וחתכו את הקשרים הסיביים בין הלב לדופן החזה. לאחר הסרה מלאה של כלוב הצלעות, השתמש במלקחיים קטנים ובמספריים כדי להרים בעדינות את הלב על ידי הקודקוד ולחשוף את ההיבט האחורי של הלב.כדי להוציא את הלב, יש לנתח מיד את העורק התחתון באבי העורקים העולה ולהניח מיד את הלב במדיום זלוף לב קר כקרח. נתח במהירות את הרקמה שנותרה כדי לחשוף את אבי העורקים העולה והשתמש במלקחיים ובמספריים כדי לנקות את האזור המקיף את אבי העורקים מרקמה עודפת. השתמש במלקחיים עדינים כדי למקם את אבי העורקים הנקי שני מילימטרים על צינורית זלוף ולאבטח את הצינורית בתפר משי 5-0.שטפו את הלב המכוסה במדיום זלוף לב בקצב זרימה של שלושה מיליליטר לדקה למשך ארבע דקות לפני המעבר למאגר העיכול למשך 15 עד 17.5 דקות. במהלך הדקות האחרונות של הזלוף, אספו שמונה מיליליטר מזרימת חיץ העיכול והעבירו את הלב מהצינורית לתוך צלחת תרבית פלסטיק של 60 מילימטר, ואז הסירו את עודפי הרקמה וטבלו את הלב ב-2.5 מיליליטר של מאגר העיכול. לבידוד תאי פרוזדורים, נתחו את הפרוזדורים הרחק מהלב והניחו את הפרוזדורים בצלחת תרבית פלסטיק של 30 מילימטר המכילה 750 מיקרוליטר של חיץ עיכול.בעזרת מספריים כירורגיים עדינים יש לטחון ולהקניט את הפרוזדורים לפני ניתוח נוסף של הרקמה בעזרת מלקחיים עדינים מבלי לעורר או לפרק את סיבי השריר. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, המשיכו לערבב בעדינות ולנתק את הרקמה למשך 15 דקות. כל חמש דקות, התבונן בדיסוציאציה של מיוציטים פרוזדורים תחת המטרה פי 10 של מיקרוסקופ ברייטפילד.ככל שהרקמה מתעכלת עוד יותר, המשך לערבב בעדינות ולנתק את הרקמה באמצעות קצה פיפטה סטרילי עם גודל נקבוביות קטן יותר לפני העברת תרחיף התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של שני מיליליטר. שטפו את צלחת ה-30 מילימטר עם 750 מיקרוליטר של מאגר עצירת מיוציטים של 37 מעלות צלזיוס ושלבו את המאגר עם מתלה התא. אפשר למיוציטים הפרוזדורים לשקוע על ידי כוח הכבידה ותסיסה עדינה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.כאשר נוצרה גלולה גלויה, צנטריפוגה את תרחיף התא והעבירו את הסופרנטנט שאינו מיוציט לתוך צינור חרוטי פוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר מבלי להפריע לגלולת מיוציט הפרוזדורים. צנטריפוגה את החלק הלא-מיוציטי והשעיית הגלולה הלא-מיוציטית ב-10 מיליליטר של DMEM בתוספת סרום עגל עוברי של 10%. לאחר הספירה, הנח את התאים שאינם מיוציטים בצפיפות הניסוי המתאימה לניתוח במורד הזרם, ולאחר מכן השהה מחדש את גלולת מיוציט הפרוזדורים המבודדת בריכוז הניסוי המתאים לזריעה על לוחות תרבית מצופים למינין.לבידוד תאים חדריים, טחנו את רקמת הלב החדרית כפי שהודגם זה עתה עבור דגימת רקמת הפרוזדורים והעבירו את תרחיף התאים המתקבל לצינור חרוטי פוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר המכיל 2.5 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס מאגר עצירת מיוציטים אחד. שטפו את צלחת החיתוך עם 2.5 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס מאגר עצירת מיוציט אחד ושלבו את הכביסה עם מתלה התא. בעזרת פיפטת העברה סטרילית, המשיכו לערבב בעדינות ולנתק את הרקמה למשך ארבע דקות.בסוף הדגירה, השתמש בכמות של 10 מיקרוליטר של התאים כדי לבדוק אם יש מיוציטים בצורת מוט. העבירו את מתלה התאים דרך מסנן ניילון סטרילי של 100 מיקרוליטר לתוך צינור חרוטי מפוליפרופילן בנפח 50 מיליליטר והשתמשו בשני מיליליטר ממאגר העיכול שנאסף בעבר כדי לשטוף את כל התאים שנותרו ממסנן הניילון הסטרילי. אפשר למיוציטים החדריים לשקוע על ידי כוח הכבידה למשך שש דקות בתסיסה עדינה עד שנוצרת גלולה גלויה בתחתית הצינור.בעזרת קצה פיפטה סטרילי, העבירו את החומר שאינו מיוציט המכיל סופרנטנט לצינור חרוטי מפוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר מבלי להפריע לכדור המיוציט החדר ולצנטריפוגה את החלק שאינו מיוציטים. השעו מחדש את הגלולה שאינה מיוציטים ב-10 מיליליטר של DMEM בתוספת סרום עגל עוברי של 10% לספירה, וצלחו את התאים בריכוז המתאים לניתוח שלהם במורד הזרם, ולאחר מכן השעו מחדש את המיוציטים החדריים המבודדים בשני מיליליטר של מאגר עצירת מיוציטים שני לספירה. כדי להגדיר פרדיגמה מחודשת של סידן, הוסף 50 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי סידן כלורי לתרחיף תאי המיוציט החדר עם ערבוב יסודי לדגירה של ארבע דקות בטמפרטורת החדר.בתום הדגירה מוסיפים לתאים עוד 50 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי סידן כלורי תוך ערבוב לדגירה נוספת של ארבע דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, טפל בתאים בדגירה אחת של ארבע דקות עם 100 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי סידן כלורי ודגירה אחת של ארבע דקות עם 80 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי סידן כלורי. לאחר הדגירה האחרונה, השעו מחדש את המיוציטים החדריים שטופלו בסידן בנפח מתאים של מדיום ציפוי מיוציטים חדריים על פי הניתוח המתוכנן שלהם במורד הזרם וזרעו את התאים על צלחות תרבית מצופות למינין.לאחר שעה, יש להחליף את הסופרנטנט במדיום לשמירה על מיוציטים חדריים בתוספת 25 מיקרו-מולארי בלביסטטין. טרופונין T בשריר הלב הוא סמן של מיוציטים לבביים ומתבטא היטב בתרביות מיוציטים לבביים פרוזדוריים וחדריים כאחד. לעומת זאת, פפטיד נטריאורטי פרוזדורי ושרשרת קלה של מיוזין 2 באים לידי ביטוי חזק וספציפי בתרביות מיוציטים לבביים פרוזדוריים וחדריים בהתאמה.סמני פיברובלסטים באים לידי ביטוי אך ורק בתרביות שאינן מיוציטים המבודדות הן מחדרי הפרוזדורים והן מחדרי החדרים. צביעה חיסונית של עכבר בוגר, פרוזדורים ומיוציטים חדריים של עכבר בוגר עבור סמן צינורית ה-T דיהידרופירידין וקולטן הריאנודין מדגימה צינוריות T שלמות לאורך הבידוד והתרבית ארוכת הטווח. ניתן להשתמש בדפוס הפסים הסרקומרי כדי להעריך את הטוהר והכדאיות של מיוציטים לבביים מבודדים בשילוב עם מורפולוגיה בצורת מוט וצביעה גרעינית עם TO-PRO-3.כצפוי, מיוציטים לבביים חדריים הם גדולים, ומציגים אורך ממוצע של כ-150 מיקרומטר, ואילו מיוציטים לבביים פרוזדוריים הם בממוצע כ-75 מיקרומטר. יתר על כן, בניתוח צביעה חיסונית, מיוציטים לבביים פרוזדוריים מציגים ביטוי חזק של פפטיד נטריאורטי פרוזדורי בדפוס צביעה האופייני ללוקליזציה לרטיקולום האנדופלזמי ולגרגירי ההפרשה. בעוד שרירי פרוזדורים מפרישים פפטיד נטריאורטי פרוזדורי בתנאים בסיסיים, ההפרשה עולה בתגובה להפרשות.יתר על כן, מיוציטים לבביים פרוזדורים מפרישים פפטיד נטריאורטי פרוזדורי והפרשה משותפת מעבדת רק חלק מההורמון ממצב המבשר שלו לפפטיד המוצר. הטעויות הנפוצות ביותר שניתן להימנע מהן כוללות אי שמירה על קור רוח של בעל החיים לפני ההקרבה, אי פינוי בועות אוויר ממערכת הזלוף, והמנתח עצמו או המנתח עצמו לא שומר על קור רוח. לאחר הליך זה, ניתן לבצע כל הליך ניסיוני נפוץ כולל בדיקת פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים וטיפול בסידן, אימונוציטוכימיה, תגובה היפרטרופית ומחקרי איתות, ומחקרי רפרפוזיה של איסכמיה.

simultaneous-isolation-culture-atrial-myocytes-ventricular-myocytes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים את בידודו של myocytes פרוזדורי אדם אשר יכול לשמש לתאיים...

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

שיטות הם הפגינו לבידוד של מיוציטים צומת sinoatrial (Sams) מעכברים בוגרים ללימודי electrophysiology צמד תיקון או הדמיה. תאים מבודדים ניתן להשתמש ישירות או יכול להישמר בתרבות להתיר ביטוי של חלבונים של עניין, כגון עיתונאים מקודדים גנטית.

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

כמה פרוטוקולים פותחו ותיארו לבידוד של סוגי תאים לב שונים של הלב חולדה. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של איכות גבוהה תאים מרכזיים של תאים לב (cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת, הפחתת עלויות הניסוי.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

הפרוטוקול הזה משמש כדי לבודד פרפור לב בודד מהלב של העכבר המבוגר באמצעות הגישה העיכול קטע. גישה זו משמשת כדי לבודד את הפרפור הימני או השמאלי, שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את פרפור מיציט אלקטרופיזיולוגיה במחקרים הדבקת מהדק.

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טרנס-תירטוי ותרבות ארוכת טווח של עכבר בוגר וקרדיומיוציטים של חולדות.

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

פרוטוקול זה מתאר שינויים בשיטת לנגנדורף כולל עומק שינון אבי העורקים לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרזדורים חדריים מעכברים בוגרים.

שינויים בשיטת לנגנדורף לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרשים בוגרים

למדו שיטה לבידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים מחדרי ופרוזדור לב עכבר בוגר. הפרוטוקול מגביר תפוקת תאים וחיוניות לחקר פיזיולוגיה ופתולוגיה לבבית.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

גלה סרטונים נוספים