בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

היי, אני כריס גלמבוטסקי. אני פרופסור לרפואה בקולג' לרפואה של אוניברסיטת אריזונה בפיניקס. ואני המנהל של המרכז התרגומי למחלות לב וכלי דם שנמצא גם כאן בפיניקס.

ברצוני להציג בפניכם היום שני אנשים שהולכים להדגים את הטכניקה החדשה שלנו, ד"ר אריק בלקווד, עמית הפוסט-דוקטורט הבכיר שלי וחבר סגל בהכשרה, ועמיתת המחקר הבכירה מיס אלינה בילאל. פרוטוקולי בידוד מיוציטים לבביים נוכחיים מגבילים את כמות התאים ואת כדאיות התאים בתרבית, ויוצרים מבוי סתום ניסיוני לקידום ההבנה שלנו בפיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של הלב. פרוטוקול זה נועד לא רק להאיץ את תהליך בידוד תאי הלב של עכברים בוגרים, אלא גם להגדיל את תפוקת התאים ואת הכדאיות של תאי לב פרוזדורים וחדרים בו זמנית מלב עכבר יחיד.

לטכניקה זו יש השלכות עמוקות על גילוי טיפולי וכי ניתן לאפיין טוב יותר מחלות כמו פרפור פרוזדורים ברמה ספציפית לסוג התא, מה שמאפשר זיהוי מטרות טיפוליות. אנו ממליצים לאנשים ללא ניסיון קודם במיקרוכירורגיה לתרגל את שלבי הוצאת אבי העורקים העולה והקנולציה בהרחבה לפני שהם מנסים את פרוטוקול הבידוד המלא. התחל בשימוש במספריים כדי לבצע חתך בעור בקו האמצע כדי לפתוח במהירות את החזה של עכבר C57 שחור 6J מורדם בן 10 שבועות מאמצע הבטן ללסת.

היכנס לצפק ונקה את הסרעפת על ידי דיסקציה קהה. חתכו את כלוב הצלעות עם חתכים לאורך דופן בית החזה בהיבט הצדדי של שני הצדדים וחתכו את הקשרים הסיביים בין הלב לדופן החזה. לאחר הסרה מלאה של כלוב הצלעות, השתמש במלקחיים קטנים ובמספריים כדי להרים בעדינות את הלב על ידי הקודקוד ולחשוף את ההיבט האחורי של הלב.

כדי להוציא את הלב, יש לנתח מיד את העורק התחתון באבי העורקים העולה ולהניח מיד את הלב במדיום זלוף לב קר כקרח. נתח במהירות את הרקמה שנותרה כדי לחשוף את אבי העורקים העולה והשתמש במלקחיים ובמספריים כדי לנקות את האזור המקיף את אבי העורקים מרקמה עודפת. השתמש במלקחיים עדינים כדי למקם את אבי העורקים הנקי שני מילימטרים על צינורית זלוף ולאבטח את הצינורית בתפר משי 5-0.

שטפו את הלב המכוסה במדיום זלוף לב בקצב זרימה של שלושה מיליליטר לדקה למשך ארבע דקות לפני המעבר למאגר העיכול למשך 15 עד 17.5 דקות. במהלך הדקות האחרונות של הזלוף, אספו שמונה מיליליטר מזרימת חיץ העיכול והעבירו את הלב מהצינורית לתוך צלחת תרבית פלסטיק של 60 מילימטר, ואז הסירו את עודפי הרקמה וטבלו את הלב ב-2.5 מיליליטר של מאגר העיכול. לבידוד תאי פרוזדורים, נתחו את הפרוזדורים הרחק מהלב והניחו את הפרוזדורים בצלחת תרבית פלסטיק של 30 מילימטר המכילה 750 מיקרוליטר של חיץ עיכול.

בעזרת מספריים כירורגיים עדינים יש לטחון ולהקניט את הפרוזדורים לפני ניתוח נוסף של הרקמה בעזרת מלקחיים עדינים מבלי לעורר או לפרק את סיבי השריר. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, המשיכו לערבב בעדינות ולנתק את הרקמה למשך 15 דקות. כל חמש דקות, התבונן בדיסוציאציה של מיוציטים פרוזדורים תחת המטרה פי 10 של מיקרוסקופ ברייטפילד.

ככל שהרקמה מתעכלת עוד יותר, המשך לערבב בעדינות ולנתק את הרקמה באמצעות קצה פיפטה סטרילי עם גודל נקבוביות קטן יותר לפני העברת תרחיף התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של שני מיליליטר. שטפו את צלחת ה-30 מילימטר עם 750 מיקרוליטר של מאגר עצירת מיוציטים של 37 מעלות צלזיוס ושלבו את המאגר עם מתלה התא. אפשר למיוציטים הפרוזדורים לשקוע על ידי כוח הכבידה ותסיסה עדינה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

כאשר נוצרה גלולה גלויה, צנטריפוגה את תרחיף התא והעבירו את הסופרנטנט שאינו מיוציט לתוך צינור חרוטי פוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר מבלי להפריע לגלולת מיוציט הפרוזדורים. צנטריפוגה את החלק הלא-מיוציטי והשעיית הגלולה הלא-מיוציטית ב-10 מיליליטר של DMEM בתוספת סרום עגל עוברי של 10%. לאחר הספירה, הנח את התאים שאינם מיוציטים בצפיפות הניסוי המתאימה לניתוח במורד הזרם, ולאחר מכן השהה מחדש את גלולת מיוציט הפרוזדורים המבודדת בריכוז הניסוי המתאים לזריעה על לוחות תרבית מצופים למינין.

לבידוד תאים חדריים, טחנו את רקמת הלב החדרית כפי שהודגם זה עתה עבור דגימת רקמת הפרוזדורים והעבירו את תרחיף התאים המתקבל לצינור חרוטי פוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר המכיל 2.5 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס מאגר עצירת מיוציטים אחד. שטפו את צלחת החיתוך עם 2.5 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס מאגר עצירת מיוציט אחד ושלבו את הכביסה עם מתלה התא. בעזרת פיפטת העברה סטרילית, המשיכו לערבב בעדינות ולנתק את הרקמה למשך ארבע דקות.

בסוף הדגירה, השתמש בכמות של 10 מיקרוליטר של התאים כדי לבדוק אם יש מיוציטים בצורת מוט. העבירו את מתלה התאים דרך מסנן ניילון סטרילי של 100 מיקרוליטר לתוך צינור חרוטי מפוליפרופילן בנפח 50 מיליליטר והשתמשו בשני מיליליטר ממאגר העיכול שנאסף בעבר כדי לשטוף את כל התאים שנותרו ממסנן הניילון הסטרילי. אפשר למיוציטים החדריים לשקוע על ידי כוח הכבידה למשך שש דקות בתסיסה עדינה עד שנוצרת גלולה גלויה בתחתית הצינור.

בעזרת קצה פיפטה סטרילי, העבירו את החומר שאינו מיוציט המכיל סופרנטנט לצינור חרוטי מפוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר מבלי להפריע לכדור המיוציט החדר ולצנטריפוגה את החלק שאינו מיוציטים. השעו מחדש את הגלולה שאינה מיוציטים ב-10 מיליליטר של DMEM בתוספת סרום עגל עוברי של 10% לספירה, וצלחו את התאים בריכוז המתאים לניתוח שלהם במורד הזרם, ולאחר מכן השעו מחדש את המיוציטים החדריים המבודדים בשני מיליליטר של מאגר עצירת מיוציטים שני לספירה. כדי להגדיר פרדיגמה מחודשת של סידן, הוסף 50 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי סידן כלורי לתרחיף תאי המיוציט החדר עם ערבוב יסודי לדגירה של ארבע דקות בטמפרטורת החדר.

בתום הדגירה מוסיפים לתאים עוד 50 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי סידן כלורי תוך ערבוב לדגירה נוספת של ארבע דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, טפל בתאים בדגירה אחת של ארבע דקות עם 100 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי סידן כלורי ודגירה אחת של ארבע דקות עם 80 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי סידן כלורי. לאחר הדגירה האחרונה, השעו מחדש את המיוציטים החדריים שטופלו בסידן בנפח מתאים של מדיום ציפוי מיוציטים חדריים על פי הניתוח המתוכנן שלהם במורד הזרם וזרעו את התאים על צלחות תרבית מצופות למינין.

לאחר שעה, יש להחליף את הסופרנטנט במדיום לשמירה על מיוציטים חדריים בתוספת 25 מיקרו-מולארי בלביסטטין. טרופונין T בשריר הלב הוא סמן של מיוציטים לבביים ומתבטא היטב בתרביות מיוציטים לבביים פרוזדוריים וחדריים כאחד. לעומת זאת, פפטיד נטריאורטי פרוזדורי ושרשרת קלה של מיוזין 2 באים לידי ביטוי חזק וספציפי בתרביות מיוציטים לבביים פרוזדוריים וחדריים בהתאמה.

סמני פיברובלסטים באים לידי ביטוי אך ורק בתרביות שאינן מיוציטים המבודדות הן מחדרי הפרוזדורים והן מחדרי החדרים. צביעה חיסונית של עכבר בוגר, פרוזדורים ומיוציטים חדריים של עכבר בוגר עבור סמן צינורית ה-T דיהידרופירידין וקולטן הריאנודין מדגימה צינוריות T שלמות לאורך הבידוד והתרבית ארוכת הטווח. ניתן להשתמש בדפוס הפסים הסרקומרי כדי להעריך את הטוהר והכדאיות של מיוציטים לבביים מבודדים בשילוב עם מורפולוגיה בצורת מוט וצביעה גרעינית עם TO-PRO-3.

כצפוי, מיוציטים לבביים חדריים הם גדולים, ומציגים אורך ממוצע של כ-150 מיקרומטר, ואילו מיוציטים לבביים פרוזדוריים הם בממוצע כ-75 מיקרומטר. יתר על כן, בניתוח צביעה חיסונית, מיוציטים לבביים פרוזדוריים מציגים ביטוי חזק של פפטיד נטריאורטי פרוזדורי בדפוס צביעה האופייני ללוקליזציה לרטיקולום האנדופלזמי ולגרגירי ההפרשה. בעוד שרירי פרוזדורים מפרישים פפטיד נטריאורטי פרוזדורי בתנאים בסיסיים, ההפרשה עולה בתגובה להפרשות.

יתר על כן, מיוציטים לבביים פרוזדורים מפרישים פפטיד נטריאורטי פרוזדורי והפרשה משותפת מעבדת רק חלק מההורמון ממצב המבשר שלו לפפטיד המוצר. הטעויות הנפוצות ביותר שניתן להימנע מהן כוללות אי שמירה על קור רוח של בעל החיים לפני ההקרבה, אי פינוי בועות אוויר ממערכת הזלוף, והמנתח עצמו או המנתח עצמו לא שומר על קור רוח. לאחר הליך זה, ניתן לבצע כל הליך ניסיוני נפוץ כולל בדיקת פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים וטיפול בסידן, אימונוציטוכימיה, תגובה היפרטרופית ומחקרי איתות, ומחקרי רפרפוזיה של איסכמיה.