Name: חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: למדו את פרוטוקול smFISH דו-צבעי לחקר קינטיקת שעתוק ופירוק mRNA בחיידקי Escherichia coli. שיטה זו מאפשרת עיבוד מקבילי של 48 דגימות תוך שמונה שעות ומספקת תובנות לגבי דינמיקת שעתוק בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול זה פותח על ידי ס.ק. במהלך מחקר הפוסט-טוקטורלי שלה במעבדה של ד"ר כריסטין ג'ייקובס-וגנר במכון הרפואי הווארד יוז והמכון למדעי המיקרוביאלית באוניברסיטת ייל. אנו מודים לד"ר ג'ייקובס-וגנר וחברי המעבדה שלה על תשומות שונות במהלך פיתוח השיטה וללורה טרוייר על הקריאה הביקורתית של כתב היד. ס.ק. מכירה בתמיכה מתכנית חוקרי סריל; K.V. מכיר בתמיכתו של ג'יימס מלומד Preble מחקר פרס מאוניברסיטת אילינוי.

<ol><li>Bervoets, I., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+versatility+and+complexity+of+bacterial+gene+regulation+mechanisms%3A+opportunities+and+drawbacks+for+applications+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).</li>
<li>Epshtein, V., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+RNA+polymerase+molecules+in+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation.</a> Science. 300 (5620), 801-805 (2003).</li>
<li>Vogel, U., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+chain+elongation+rate+in+Escherichia+coli+depends+on+the+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).</li>
<li>Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+dystrophin+gene+requires+16+hours+to+be+transcribed+and+is+cotranscriptionally+spliced%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced.</a> Nature Genetics. 9, 184(1995).</li>
<li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16, 1128(2009).</li>
<li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li>
<li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li>
<li>Pérez-Ortín, J. E., Medina, D. A., Chávez, S., Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+you+mean+by+transcription+rate%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">What do you mean by transcription rate.</a> BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li>
<li>Kuchina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+single-cell+RNA+sequencing+by+split-pool+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding.</a> BioRxiv. , 869248(2019).</li>
<li>Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotic+single-cell+RNA+sequencing+by+in+situ+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing.</a> Nature Microbiology. , (2020).</li>
<li>Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Montero Llopis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).</li>
<li>So, L. -h, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).</li>
<li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li>
<li>Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+architecture+dictates+cell-to-cell+variability+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression.</a> Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).</li>
<li>Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantitative+measurement+of+transcriptional+kinetic+parameters+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo.</a> Nucleic Acids Research. 44 (18), 142(2016).</li>
<li>Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Distance+Cooperative+and+Antagonistic+RNA+Polymerase+Dynamics+via+DNA+Supercoiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling.</a> Cell. 179 (1), 106-119 (2019).</li>
<li>Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+transcription+at+a+single+gene+copy+reveals+hidden+drivers+of+bacterial+individuality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality.</a> Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).</li>
<li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJoo%2C+C+%22Labeling+DNA+%28or+RNA%29+for+single-molecule+FRET%22">Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET</a>. 2012 (9), Cold Spring Harbor. 1005-1008 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Standard+Ethanol+Precipitation+of+DNA+in+Microcentrifuge+Tubes%22">Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes</a>. 2006 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 4456(2006).</li>
<li>Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li>
<li>Adesnik, M., Levinthal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+and+degradation+of+lactose+operon+messenger+RNA+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).</li>
<li>Campbell, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+for+rifampicin+inhibition+of+bacterial+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase.</a> Cell. 104 (6), 901-912 (2001).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaj%2C+A+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Walter, N. G. 472, Academic Press. 365-386 (2010).</li>
<li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+an+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).</li>
<li>Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoffitt%2C+JR+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. 572, Academic Press. 1-49 (2016).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+gene+expression+in+live+cells%2C+one+protein+molecule+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.</a> Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).</li>
<li>Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+mRNA+degradation+and+transcript+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli.</a> Molecular Systems Biology. 11 (1), 781(2015).</li>
<li>Vogel, U., Sørensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreasing+transcription+elongation+rate+in+Escherichia+Coli+exposed+to+amino+acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation.</a> Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+and+translation+contribute+to+gene+locus+relocation+to+the+nucleoid+periphery+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.</a> Nature Communications. 10 (1), 5131(2019).</li>
<li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li>
<li>Fontenete, S., Guimarães, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+melting+temperatures+in+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+procedures+using+thermodynamic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).</li>
<li>Sepúlveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+gene+regulation+in+individual+cells+reveals+rapid+switching+between+promoter+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states.</a> Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> eLife. 5, 13065(2016).</li>
<li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן, אנו הציגו פרוטוקול SMFISH למדידת קינטיקה mRNA ב E. coli. בפרוטוקולים SMFISH שפורסמו בעבר עבורחיידקים 23, תאים נשמרו בצינורות עד סוף הפרוטוקול, כל כך עד שהם מוכנים להדמיה. אמנם יש לו יתרונות רבים, כגון איגוד מינימלי לא ספציפי של בדיקות פלורסנט על משטח כיסוי23, קשה לעקוב אחר פרוטוקולים אלה כאשר יש דגימות רבות מניסוי קורס זמן. ראשית, נפח גדול יחסית של תאים (>1 מ"ל) צריך להיות נדגים ואפילו לקצור לפני קיבעון. שנית, דגימות התא צריך להיות צנטריפוגה מספר פעמים כדי להחליף פתרונות ולשטוף לאחר שלב הכלאה. בפרוטוקול שלנו, נפח קטן (<1 מ"ל) של תרבות מעורב ישירות עם פתרון תיקון בצינור 1.5 מ"ל, עוזר במהירות "להקפיא" את מצב התא ברגע הדגימה. כמו כן, תאים להישאר מחוברים אל פני השטח לאורך כל ההליך, פתרונות שונים ניתן להחליף במהירות על ידי שאף נוזלים עם מערכת סינון ואקום ויישום טיפות פתרון בבת אחת עם פיפטה רב ערוצית. הבדל זה הופך את הפרוטוקול שלנו ליתרון רב כאשר מספר גדול של דגימות צריך להיות מעובד בבת אחת. באמצעות הפרוטוקול שלנו, 12-48 דגימות ניתן לטפל בו זמנית ואת הליך FISH כולו ניתן להשלים בתוך ~ 8 שעות, על כמות דומה של זמן הדרוש עבור כמה דגימות(איור 2). למרות שהשתמשנו בביטוי lacZ ב E. coli כדוגמה, הפרוטוקול ישים באופן נרחב גנים שונים מינים חיידקיים עם שיקולים שנדונו להלן.
עבור גנים שונים, הדבר הראשון שיש לקחת בחשבון הוא גשושי SMFISH. אחד יכול לעצב בדיקות oligonucleotide אריח mRNA של עניין (איור 1A)13. בגישת בדיקה זו "ריצוף", כל בדיקה היא ~ 20 בסיס ארוך מתויג עם פלואורופור ב 5 ' או 3 ' terminus. אסטרטגיה זו נוחה כמו אין צורך מניפולציה גנטית. לחלופין, ניתן להוסיף חזרה דו-צמדית של רצף של כ-20 bp, זר לרצף הגנומי (לדוגמה, מערך של רצף lacO ב-Caulobacter crescentus14),ניתן להכניס לאזור הלא מתורגם של גן עניין, ובדיקה אחת המשלים ליחידה החוזרת משמשת לסימון הגישה mRNA ("מערך"; איור 1B). בשני המקרים, פלואורופורים מרובים לקשט mRNA, נותן אות פלואורסציה מוגבר שניתן להבדיל בקלות מבדיקה אחת שאינה קשורה באופן ספציפי בתוך תא.
אם לבחור גישות "ריצוף" או "מערך" תלוי בפקד השלילי, מדגם שבו איגוד לא ספציפי של בדיקות נבדק כי זה חסר mRNA היעד. עבור בדיקות ריצוף(איור 1A),זן מוטציה ללא גן של עניין או מצב, שבו הגן אינו מתעתק (למשל, דיכוי של lacZ)יכול לשמש שליטה שלילית לבדיקת איגוד לא ספציפי של בדיקות. עבור SmFISH מבוסס מערך (איור 1B), זן מסוג פראי חסר המערך יכול לשמש כפקד שלילי מכיוון שהוא אינו מכיל אתרי איגוד עבור הגששים.
תנאי הכלאה אופטימליים עשויים להיות תלויים רצפי בדיקה ואפילו הבחירה של צבעי פלואורופור. ייעלנו את מצב ההיברידיזציה עבור ערכות בדיקה lacZ על ידי שמירה על טמפרטורת הכלאה ב 37 °C ובדיקת ריכוזים שונים של ערכות בדיקה formamide בפתרון הכלאה. ריכוזים גבוהים יותר של formamide נוטים להפחית הן לא ספציפית וכריכהספציפית 26,35. אנו ממליצים לשנות באופן שיטתי את ההיברידיזציה ואת תנאי השטיפה שלה תוך שמירה על זמן היברידיזציה וטמפרטורה זהה. ככל שהמצב מחמיר יותר, הן לא ספציפית והן ירידה מחייבת ספציפית(איור 6). חשוב למצוא נקודה שבה הכריכה הלא ספציפית מתחילה להגיע מתחת לסף מקובל מבלי להתפשר עוד יותר על כריכה ספציפית. לדוגמה, השתמשנו ברמת האות שהושגה ללא גששים ("אין גששים") בשם סף(איור 6).
שיטת SmFISH בשני צבעים המסויגת שני אזורים נפרדים של mRNA מוגבלת לגנים ארוכים. כדי למדוד את קצב ההתרבות שעתוק, ניצלנו את העובדה כי lacZ הוא ארוך (3075 bp) ואת הביטוי שלה יכול להיות מושרה על ידי IPTG. כאשר גן קצר, קשה לעצב שתי ערכות בדיקה ריצוף (ליד 5' ו 3 ' קצוות) ולפתור את העיכוב בזמן בין הופעות של 5 ' לעומת 3 ' mRNA אזורים. במקרה זה, אפשר לספור mRNAs המתפתח במצב יציב על ידי smFISH ולנתח את התפלגותם עם מודל אנליטי שיש לו את קצב של תמלול תמלולים כפרמטר מתאים 20. כמו כן, כאשר גן של עניין אינו בלתי ניתן לסיבה, ניתן לטפל בתאים עם rifampicin בזמן אפס למדוד את השינוי הזמני באזורים 5 ' ו 3 ' mRNA. העיכוב מהירידה של אות mRNA 5 ' לזה של אות mRNA 3 ' לאחר מכן יכול לשמש כדי לחשב את קצב ההתארה שעתוק כפישנעשה בעבר 31.
לבסוף, פרוטוקול SmFISH הוא רב-תכליתי ותו לא ניתן לשלב אותו עם ערכות תיוג אחרות. בעבר, לוקוס DNA היה חזותי יחד עם mRNAs על ידי שילוב mRNA דגים עם או DNA FISH14 או פלורסנט כתב-מפעילמערכת 20. מוצרי חלבון ניתן לדמיין על ידי ביצוע immunofluorescence יחד עם mRNA FISH14,36. כמו כן, ניתן לשלב אותו עם מיקרוסקופיתסופר-רזולוציה תלת מימדית 37 כדי לדמיין mRNAs בכל שלושת הממדים38,39.

זרימת המידע הגנטי מ-DNA ל-mRNA וחלבון היא אחד התהליכים הסלולריים הבסיסיים ביותר, שהרגולציה שלהם חשובה לכושר תאי1. מספר mRNAs בתא נקבע על-ידי שני תהליכים דינמיים, שעתוק והשפלה של mRNA. עם זאת, איך שעתוק והשפלה mRNA מוסדרים בזמן ובמרחב של תא אחד נשאר לא לגמרי מובן, בעיקר בשל המחסור בשיטות ניסיוניות כדי למדוד כמותית הקינטיקה שלהם vivo.
שיטות המבוססות על mRNAs הכולל שחולצו מאוכלוסייה של תאים, כגון כתם צפוני, RT-PCR, רצף RNA, ומיקרו-מערך ביטוי גנים, יכול למדוד את ההבדל היחסי ברמות mRNA והיה בשימוש נרחב כדי לנתח את קצב התאווותשעתוק 2,3,,4,5 או שיעורהשפלהmRNA 6,7., עם זאת, הם אינם מספקים את המספר המוחלט של mRNAs לכל תא, ולכן, הם אינם מתאימים לתביעת קצב אתחול שעתוק8. כמו כן, מאחר mRNAs מופקים מאוכלוסייה של תאים, התפלגות מרחבית של mRNAs בתוך תא יחיד ואת השונות של מספרי עותק mRNA בין תאים אין אפשרות למדוד.
רצף RNA מהדור הבא בתאים בודדים (scRNAseq) יכול לכמת את מספר mRNAs לכל תא בקנה מידה גנומי9. עם זאת, קשה להשתמש בטכניקה זו כדי למדוד קינטיקה שעתוק, בשל אתגרים עם הכנת מדגם ועלות גבוהה. בפרט, היישום של scRNAseq לחיידקים היה קשה מבחינה טכנית בשל שפע mRNA נמוך10,11.
פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב- situ hybridization (smFISH) מבוססת על הכלאה של גשושים בעלי תווית פלורסנטית חד-גדילית אשר רצפיהם משלימים את mRNA היעד שלעניין 12,13. הרעיון של הכלאה ספציפית לרצף דומה לזה המשמש כתם צפוני או RT-PCR, אבל הכלאה נעשית ב- situ בתוך תאים קבועים, כדי לשמר את התיור המקומי של mRNAs. האות של mRNA יחיד מוגבר באמצעות גששים רבים, ~ 20 נוקלאוטידים (nt) באורך, הכלאה לחלקים שונים של mRNA (איור 1A)13. בגישה זו "ריצוף" גשושית, מספר הגששים הדרושים כדי לזהות mRNA יחיד קובע מגבלה נמוכה יותר על אורך mRNA שניתן לומר. לחלופין, mRNA של עניין עשוי להיות תעתיק התמזגו למערך שאינו קידוד של רצפי מפעיל Lac טנדם, כך עותקים מרובים של בדיקה lacO תיוגנתנת להכלאה mRNA יחיד (איור 1B)14.
SmFISH שימש לכמת את מספר mRNAs לכל תא במצב יציב (כלומר, כאשר סינתזה וריקבון נמצאים באיזון) ולנתח את ממוצע ושונות של mRNAs בקרב תאיםחיידקיים 15,16,17. לאחרונה, SmFISH הוחל לכמת מספרי mRNA במצב לא יציב, מיד לאחר אינדוקציה או דיכוי של ביטוי גנים ב E. coli18,19,20. השינויים הזמניים במספרי עותק mRNA המוחלט שימשו לאחר מכן לחישוב קצב אתחול שעתוק, ההתארה, וסיום, כמו גם את קצב ההשפלה mRNA. עבור יישום זה, הליכי SmFISH קונבנציונליים יכולים להיות מסורבלים כי ישנן דגימות רבות, כל אחד מייצג נקודת זמן אחת, כי צריך לעבור שלבים חילופי מאגר מרובים (כלומר, צנטריפוגציה ושטיפה). כאן, אנו מתארים פרוטוקול smFISH, שבו שלבי טיפול מדגם הם פשטו באופן דרמטי על ידי כך שיש תאים דבוקים על פני השטח של כיסוי ועל ידי שאיפה נוזלים עם מערכת סינון ואקום14,19. באמצעות הביטוי lacZ ב- E. coli כדוגמה, זרימתהעבודה המלאה (איור 2)מדגימה, כולל ניתוח תמונה ( איור 3 ) המניב את הקינטיקה vivo של שעתוק(אתחול,התאווה וסיום) והשפלה mRNA, השתנות מתא לתא בביטוי mRNA, ומיקום mRNA. אנו צופים כי הפרוטוקול ישים באופן נרחב לבדיקה בקינטיות vivo ויציקה של mRNAs אחרים במין חיידקים שונים.

<table><tbody><tr><td><חזק>זן חיידקי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MG1655</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>כימיקלים, פפטידים ואחרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34851</td><td>UPLC מאגר B</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>פישר כימיקל</td><td>A661-500</td><td>כדי להפוך את M9 לבינוני</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td>הכלאת בדיקה</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>Acros Organics</td><td>349610250</td><td>להכנת M9 בינוני</td></tr><tr><td>חומצת קסמינו</td><td>BD Difco</td><td>223050</td><td>להכנת M9 בינוני</td></tr><tr><td>Cy3B NHS ester</td><td>GE Healthcare Life</td><td>Sciences PA63101</td><td>פלואורופור לבדיקות FISH</td></tr><tr><td>Cy5 NHS ester</td><td>GE Healthcare Life מדעים</td><td>PA15101</td><td>פלואורופור לבדיקות FISH</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרן סולפט</td><td>Millipore</td><td>S4030</td><td>הכלאת בדיקה</td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>פישר כימיקל</td><td>D16</td><td>לדיכוי הביטוי של lacZ</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td>להמסת פלואורופורים</td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td>היברידיזציה של בדיקה</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>בשימוש בטיהור DNA, ליזה וניקוי כיסויים</td></tr><tr><td>בדיקות FISH</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>רצפים מתפרסמים ב ref#16</td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>לאד תעשיות מחקר</td><td>20295</td><td>קיבוע</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>אמריקן ביו</td><td>AB00600</td><td>בדיקה הכלאה, טרום הכלאה ושטיפה</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>אמריקנביו</td><td>AB00751-01000</td><td>להכנת M9 בינוני</td></tr><tr><td>איזופרופילתיו-ובטא;-גלקטוזיד (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529019</td><td>lacZ אינדוקציה</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>פישר כימיקל</td><td>M65-500</td><td>לייצור M9 בינוני</td></tr><tr><td>2-ניטרופניל ובטא;-D-fucopyranoside (ONPF)</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-216258</td><td>lacZ דיכוי</td></tr><tr><td>Picodent twinsil 22</td><td>Picodent</td><td>1300 1000</td><td>איטום</td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8920</td><td>לטיפול במשטח הכיסוי</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP366-500</td><td>לייצור PBS</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP362-500</td><td>לייצור PBS ו-M9 בינוניים</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td>כדי לעצור את התחלת השעתוק</td></tr><tr><td>מאגר מלוח-נתרן ציטראט (SSC)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM9763</td><td>בדיקה הכלאה, טרום-הכלאה ושטיפה</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP328-500</td><td>צימוד פלואורופור-בדיקה</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP358-1</td><td>לטיהור DNA, PBS ו-M9 נתרן</td></tr><tr><td>פוספט בינוני די-בסיסי</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP332-500</td><td>לייצור PBS ו-M9 נתרן</td></tr><tr><td>פוספט בינוני מונו-בסיסי</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP329-500</td><td>להכנת מאגר נתרן פוספט</td></tr><tr><td>Super PAP Pen</td><td>Invitrogen</td><td>8899</td><td>סמן הידרופובי לכיסויים</td></tr><tr><td>מיקרוספירות TetraSpek</td><td>Invitrogen</td><td>T7280</td><td>בקרות עבור רישום רב-ערוצי</td></tr><tr><td>תיאמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1270</td><td>לייצור M9 בינוני</td></tr><tr><td>טריאתילאמוניום אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>90358</td><td>UPLC מאגר A</td></tr><tr><td>קומפלקס ריבונוקלאוזיד ונדיל (VRC)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>94742</td><td>הכלאת בדיקה וקדם-הכלאה</td></tr> <tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 עמוד</td><td>Waters</td><td>Acquity BEH C18 עמוד</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה משטח</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>חממת משטח</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer F1.5</td><td></td></tr><tr><td>חממה (תנור)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>51030514</td><td>הסעת כוח הכבידה</td></tr><tr><td>מערכת טיהור מים</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q התייחסות</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td></td></tr><tr><td>בניין</td><td></td><td>גז חנקן</td><td>לייבוש כיסויים ומגלשות זכוכית</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity UPLC מערכת</td><td></td></tr><tr><td>ואקום ושואב</td><td>בניין</td><td></td><td>שואב עשוי בקבוק סינון עם זרוע צד.</td></tr><tr><td>רכז הוואקום</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td>Centrivap; לייבוש דגימות שנאספו מ-UPLC.</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>Genie-2 SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אמבט מים</td><td>ניו ברונסוויק</td><td>Innova 3100</td><td>קריטי לניסויים במסלול הזמן</td></tr><tr><td>סוניקטור אמבט מים</td><td>VWR</td><td>97043-960</td><td>לניקוי כיסויים ומגלשות זכוכית</td></tr> <tr><td><חזק>כלים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td>צינורות לובינד DNA</td></tr><tr><td>1000-uL קופסת קצה פיפטה</td><td>דנוויל סיינטיפיק</td><td>P1126</td><td>קופסה ריקה לאחר שימוש בכל הטיפים</td></tr><tr><td>צנצנת קופלין</td><td>SPI</td><td>01240-AB</td><td>לניקוי כיסויים ושקופיות זכוכית</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-230</td><td>24x60 No1</td></tr><tr><td>קצות פיפטה מסוננים</td><td>דנוויל סיינטיפיק</td><td>P1121,P1122,P1126</td><td>SHARP&reg; קצות מחסום מדויקים</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>SPI</td><td>K35a</td><td>לטיפול בכיסויים נקיים ומגלשות זכוכית</td></tr><tr><td>מגלשת זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>כפפות</td><td>Microflex</td><td>MK-296-M</td><td></td></tr><tr><td>צינור רב ערוצי</td><td>Eppendorf</td><td>2231300045</td><td>לשימוש בשלב הכביסהפיפט</td></tr> <tr><td></td><td>גילסון</td><td>P1000, P200, P20</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ריאגנטים</td><td>MTC Bio</td><td>P8025-1S</td><td>לשימוש בשלב הכביסה מסנן</td></tr> <tr><td>מזרק (0.22 אום)</td> <td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>טיימר</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תוכנה ואלגוריתמים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013 ומעלה</td><td>https://www.mathworks.com</td></tr><tr><td>MicrobeTracker או Oufti</td><td></td><td></td><td>https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker</td></tr><tr><td colspan="4">https://oufti.org/</td></tr> <tr><td>Stellaris Probe Designer</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer</td></tr><tr><td><חזק>מיקרוסקופ</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD מצלמה</td><td>Hamamatsu פוטוניקה</td><td>Orca-II-ER</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 מסנן סט</td><td>Chroma</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 סט מסננים</td><td>Chroma</td><td>49006</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td>עבור ניגודיות פאזה ואפי פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>מקור עירור פלואורסצנטי</td><td>Lumencor</td><td>SOLA-E</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Elements תוכנה</td><td>Nikon</td><td></td><td>תוכנה השולטת בהגדרת המיקרוסקופ</td></tr><tr><td>ניגודיות פאזה 100x אובייקטיבית</td><td>Nikon</td><td>Plan Apochromat (NA 1.45)</td><td></td></tr><tr><td>רצף בדיקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA אוליגוס עם שינוי אמינו C6 בקצה 5'</td><td>Biosearch Technologies Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lacZ1</td><td></td><td>GTGAATCCGTAATCATGGTC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ2</td><td></td><td>TCACGACGTTGTAAAACGAC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ3</td><td></td><td>ATTAAGTTGGGTAACGCCAG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ4</td><td></td><td>TATTACGCCAGCTGGCGAAA</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ5</td><td></td><td>ATTCAGGCTGCGCAACTGTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ6</td><td></td><td>AAACCAGGCAAAGCGCCATT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ7</td><td></td><td>AGTATCGGCCTCAGGAAGAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ8</td><td></td><td>AACCGTGCATCTGCCAGTTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ9</td><td></td><td>TAGGTCACGTTGGTGTAGAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ10</td><td></td><td>AATGTGAGCGAGTAACAACC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ11</td><td></td><td>GTAGCCAGCTTTCATCAACA</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ12</td><td></td><td>AATAATTCGCGTCTGGCCTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ13</td><td></td><td>AGATGAAACGCCGAGTTAAC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ14</td><td></td><td>AATTCAGACGGCAAACGACT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ15</td><td></td><td>TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ16</td><td></td><td>ATCTTCCAGATAACTGCCGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ17</td><td></td><td>AACGAGACGTCACGGAAAAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ18</td><td></td><td>GCTGATTTGTGTAGTCGGTT</td><td>mRNA 5'</td></tr><tr><td>lacZ19</td><td></td><td>TTAAAGCGAGTGGCAACATG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ20</td><td></td><td>AACTGTTACCCGTAGGTAGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ21</td><td></td><td>ATAATTTCACCGCCGAAAGG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ22</td><td></td><td>TTTCGACGTTCAGACTAGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ23</td><td></td><td>ATAGAGATTCGGTTCGG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ24</td><td></td><td>TTCTGCTTCAATCAGCGTGC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ25</td><td></td><td>ACCATTTTCAATCCGCACCT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ26</td><td></td><td>TTAACGCCTCGAATCAGCAA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ27</td><td></td><td>ATGCAGAGGATGCTCTCGT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ28</td><td></td><td>TCTGCTCATCCATCCATGACCTGA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ29</td><td></td><td>TTCATCAGCAGGATATCCTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ30</td><td></td><td>CACGGCGTTAAAGTTGTTCT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ31</td><td></td><td>TGGTTCGGATAATGCGAACA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ32</td><td></td><td>TTCATCCACCACATACAGGC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ33</td><td></td><td>TGCCGTGGGTTTCAATATTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ34</td><td></td><td>ATCGGTCAGACGATTCATTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ35</td><td></td><td>TGATCACACTCGGGTGATTA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ36</td><td></td><td>ATACAGCGCGTCGTGATTAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ37</td><td></td><td>GATCGACAGATTTGATCCAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ38</td><td></td><td>AAATAATATCGGTGGCCGTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ39</td><td></td><td>TTTGATGGACCATTTCGGCA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ40</td><td></td><td>TATTCGCAAAGGATCAGCGG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ41</td><td></td><td>AAGACTGTTACCCATCGCGT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ42</td><td></td><td>TGCCAGTATTTAGCGAAACC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ43</td><td></td><td>AAACGGGGATACTGACGAAA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ44</td><td></td><td>TAATCAGCGACTGATCCACCACC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ45</td><td></td><td>GGGTTGCCGTTTTCATA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ46</td><td></td><td>TCGGCGTATCGCCAAAATCA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ47</td><td></td><td>TTCATACAGAACTGGCGATC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ48</td><td></td><td>TGGTGTTTTGCTTCCCCCAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ49</td><td></td><td>ACGGAACTGGAAAAACTGCT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ50</td><td></td><td>TATTCGCTGGTCACTTCGAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ51</td><td></td><td>GTTATCGCTATGACGAACA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ52</td><td></td><td>TTTACCTTGTGGAGCGACAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ53</td><td></td><td>GTTCAGGCAGTTCAATCAAC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ54</td><td></td><td>TTGCACTACGCGTACTGTGA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ55</td><td></td><td>AGCGTCACACTGAGGTTTTC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ56</td><td></td><td>ATTTCGCTGGTGGTCAGATG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ57</td><td></td><td>ACCCAGCTCGATGCAAAAAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ58</td><td></td><td>CGGTTAAATTGCCAACGCTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ59</td><td></td><td>CTGTGAAAGAAAGCCTGACT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ60</td><td></td><td>GGCGTCAGCAGTTTTTTTTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ61</td><td></td><td>TACGCCAATGTCGTTATCCA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ62</td><td></td><td>TAAGGTTTTCCCCTGATGCT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ63</td><td></td><td>ATCAATCCGGTAGGTTTTCC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ64</td><td></td><td>GTAATCGCCATTTGACCACT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ65</td><td></td><td>AGTTTTCTTGCGGCCTAAT</td><td>3'mRNA</td></tr><tr><td>lacZ66</td><td></td><td>ATGTCTGACAATGGCAGATC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ67</td><td></td><td>ATAATTCAATTCGCGCGTCC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ68</td><td></td><td>TGATGTTGAACTGGAAGTCG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ69</td><td></td><td>TCAGTTGCTGTTGTAGTAGG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ70</td><td></td><td>ATTCAGCCATGTGCCTTCTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ71</td><td></td><td>AATCCCCATATGGAAACCGT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ72</td><td></td><td>AGACCAACTGGTAATGGTAG</td><td>3' mRNA</td></tr></tbody></table>

חיטוט mrna קינטיקה בחלל וזמן ב escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

פלואורסץ מולקולה אחת בהכלאה סיטו (smFISH) מאפשר לספור את המספר המוחלט של mRNAs בתאים בודדים. כאן, אנו מתארים יישום של smFISH כדי למדוד את שיעורי שעתוק והשפלה mRNA ב Escherichia קולי. כמו SmFISH מבוסס על תאים קבועים, אנו מבצעים smFISH בנקודות זמן מרובות במהלך ניסוי קורס זמן, כלומר, כאשר תאים עוברים שינויים מסונכרנים על אינדוקציה או דיכוי של ביטוי גנים. בכל נקודת זמן, תת-אזורים של mRNA הם ייחודיים ספקטרלית כדי לחקור את ההתארגה תמלול וסיום מוקדם. התוצאה של פרוטוקול זה מאפשרת גם ניתוח התאמה מקומית תאית של mRNAs והטרוגניות במספרי עותק mRNA בין תאים. באמצעות פרוטוקול זה דגימות רבות (~ 50) ניתן לעבד בתוך 8 שעות, כמו משך הזמן הדרוש רק כמה דגימות. אנו דנים כיצד להחיל פרוטוקול זה כדי ללמוד את התמלול והשפלה קינטיקה של mRNAs שונים בתאים חיידקיים.

פרוטוקול זה מתאר יישום של פלואורסצנטיות מולקולה אחת בהכלאה situ (smFISH) כדי למדוד את הקינטיות vivo של סינתזה mRNA והשפלה.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH ידוע במדידת המספר המוחלט כמיקום תת-תאי של mRNAs. פרוטוקול sMFISH שני הצבעים שלנו יש את היכולת הנוסף של מדידת הקינטיקה של שעתוק והשפלה mRNA. בשיטה זו, ניתן לעבד דגימות רבות בו זמנית ללא תוספת זמן או מאמץ.לדוגמה, ארבעה ניסויים בקורס זמן המניבים 48 דגימות יכולים להיות מעובדים להדמיה בשמונה שעות. הפרוטוקול שלנו ישים באופן נרחב עבור גנים רבים ומינים חיידקיים. כדי להכין תלושי כיסוי ושקופיות זכוכית לניסוי.השתמש מטליות למקם תלושי כיסוי ומחלקות בצנצנת Coplin המכיל 100% אתנול ולמקם את הצנצנת באמבט מים קולי לספק במשך 15 עד 20 דקות. בסוף sonication לשטוף את השקופיות לכסות מחליק שלוש עד ארבע פעמים עם מים טהורים במיוחד לפני מילוי הצנצנת עם 70% אתנול וחוזר על sonication. כאשר כל שלבי sonication נעשים, לייבש את הכיסוי מחליק ומחליק עם גז חנקן.מקם את מחליקי הכיסוי בתיבת קצה פיפיאט ריקה של 1000 מיקרוליטר והצב את השקופיות בתיבת שקופית נקייה. לאחר מכן, בעקבות החורים של תיבת קצה פיפטה להשתמש סמן הידרופובי לצייר עיגולים על תלושי הכיסוי ולהחיל טיפה 20 microliter של 0.1% פולי l לינזין על כל בארות אלה. כדי להקים ניסוי קורס זמן, להוסיף 750 microliters מתרבות E.coli 20 מיליליטר גדל אקספוננציאלית לצינור תרבות 1.5 מיליליטר מסומן זמן אפס.ומיד להפוך את הצינור. לגרום ביטוי LAC Z עם 0.2 כדי IPTG מילימולר אחד ולהתחיל טיימר. לאחר בדיקת שעון הזמן, לאסוף את תרבות התא בכל נקודת זמן ניסיונית רצופה כפי שהוכח רק.בנקודת הזמן המתאימה במהלך הניסוי, להוסיף חמישה מילימולרים ONPF לבקבוק כדי להדחיק את ביטוי LAC Z ולהמשיך לדגום את התרבויות כדי לעקוב אחר השפלה mRNA. בסוף קורס הזמן מדגם רכישה, הדגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ואחריו דגירה על קרח במשך 30 דקות. בסוף צנטריפוגת הדגירה הדגימות כדי להסיר את התיקון ולהשתמש פיפטה כדי להסיר את supernatant.להשעות מחדש את החיידקים במיליליטר אחד של DEPC PBS ולשטוף את התאים פעמיים נוספות במיליליטר אחד של PBS DEPC טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את התאים 30 microliters של PBS DEPC טרי. עבור חלחלה של התאים.ראשית להוסיף את המדגם מכל נקודת זמן ל בארות הידרופובי בודדות על אחד אתנול מעורק זכוכית מכסה מחליק. ולאפשר לתאים לדבוק בכיסוי עם דגירה של 10 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מוסיפים 15 מיקרוליטרים של 70% אתנול לכל באר.לאחר ארבע דקות, שאף את האתנול מכל באר, כך שה בארות יבשות לחלוטין. לאחר הכביסה מוסיפים 30 מיקרוליטרים של פתרון טרום הכלאה לכל באר של תאים מחלחלים, ו דגירה התאים במשך 30 דקות בתנור 37 מעלות צלזיוס. החלף את פתרון ההכלאה מראש עם כ 30 microliters של פתרון הכלאה בדיקה לכל באר.ולכסות את התא בנייר אלומיניום במשך שעתיים דגירה בתנור 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה להשתמש פיפטה רב ערוצית לשטוף את בארות שלוש עד חמש פעמים עם 30 microliters של פתרון לשטוף לגם לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, דגירה התאים במשך 15 עד 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני לשטוף את בארות חמש פעמים עם 30 microliters של PBS DEPC טרי לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, שאפו את כל הנוזלים מהכיסוי. ולהוסיף ארבעה microliters של PBS DEPC טרי לכל באר. השתמש מדפים כדי למקם בזהירות את המכסה להחליק על שקופית זכוכית מעקרת אתנול בצד למטה, ולהשתמש מסטיק שיניים סיליקון כדי לאטום את הקצוות של החלקת המכסה.כדי לאתר אזור מעניין, בחר את המצב החי של הדמיית ניגודיות פאזה ותמרן את מוט ההיגוי של הבמה כדי לשנות את שדה המבט בתוך באר. ממוקם באזור שבו צפיפות התאים אופטימלית והתאם את מוקד Z כך שתמונות תא ניגוד הפאזה נמצאות במוקד. לאחר מכן רכשו תמונה C five עם חשיפה של ארבע שניות, תמונת C שלוש עם חשיפה של שתי שניות ותדמית ניגודיות פאזה עם חשיפה של 0.2 שניות לכ-10 אזורים שונים ל הבאר.לחלופין, ניתן להפעיל רכישה של NDI שבה תמונות C חמש, C שלוש וחדות פאזה נרכשות בסדרות. לאחר הדמיה של כל הבארות, פתחו כלי פילוח תאים מתאים ולחץ על מחסנית. טען את תמונות ניגודיות הפאזה מעניינות ובחר מסגרות עצמאיות ולחץ על מ לחשב את פרופיל הפאזה כאפס.כדי להתחיל את תהליך הפילוח שבמהלכו יזהו את התאים ויחושבו קווי המתאר שלהם. טען את הפרמטרים המופיעים בתיקיה GitHub ולחץ על כל המסגרות. בסוף העיבוד בחר מיתאר כדי להמחיש את רשת שינוי.לאחר מכן, תחת לשונית זיהוי ספוט, בטל את הסימון של מחסנית, בדוק רשתות שינוי ולחץ על שפשוף כדי להתחיל בזיהוי הנקודה וכימות בהתבסס על שני המדידות של D Gaussian. בחר את התיקיה המכילה את התמונות הפלואורסצנטיות ואת קובץ רשת שינוי שחושב זה הרגע מתוך הליך זיהוי התאים וציין את שם הקובץ שאליו יישמרו תוצאות זיהוי הספוט. לאחר מכן השתמש בזרימת העבודה של ניתוח התמונה המסופקת ב- GitHub כדי לנתח את תמונות הפלואורסצנטיות.בשדה מלא זה של תצוגה כ 500 תאי E.coli בצפיפות טובה עבור פילוח התא ניתן לראות. המורפולוגיה של התאים בתמונות ניגודיות הפאזה צריכה להישאר דומה לזו של תאים חיים למטרות פילוח. אם התאים מחלחלים יתר על כן, המורפולוגיה שלהם תהפוך לבלתי מתאימה לפילוח.ההתפלגות של כתמי נקודה lac Z mRNA לפני אינדוקציה אינה מתאימה היטב עם הפצה נורמלית או פואסון בשל נוכחותם של כתמים עם התעצמויות גבוהות. כאשר הביטוי של lac Z הוא המושרה האות של חמישה mRNA X lac פריים עולה לפני שלוש האות העיקרי Lac Z mRNA עולה. אם הביטוי של Lac Z מודחק הן חמשת ושלושת אותות ה-MRNA המובילים של Lac Z פוחתים.כדי להשיג את קצב התארכות התמלול, עלייתם של חמשת ושלושת האותות המובילים מתאימים לקווים. בעוד שיעור השפלה mRNA מתקבל על ידי התאמת אזור הריקבון עם פונקציה מעריכית. מכיוון שדג מולקולה בודדת הוא טכניקה של תא יחיד, ניתן לנתח גם את השונות בין התא לתאים בתעתיק.בנוסף, ניתוח של colocalization של חמישה פריים ושלושה פריים Lac Z mRNA מאפשר את הצפיפות של פולימראזים RNA על הגן Lac Z להיות מכומת. כמו דגימות מנקודות זמן שונות מטופלים בו זמנית במהלך הליך זה. חשוב לשמור על הדגימה מופרדת בזמן שהם בצינורות ועל החלקת הכיסוי.באמצעות טכניקת מיקרוסקופיה חד-תאית זו של מולקולה בודדת. חוקרים יכולים כעת לחקור כיצד קינטיקה של שעתוק והשפלת mRNA קשורה למספרים המוחלטים או למיקומים התת-תאיים של mRNAs.

probing-mrna-kinetics-space-time-escherichia-coli-using-two-color

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC), לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו נמצאת בשימוש אחרי דינמיקת הביטוי האקראית של גורם שעתוק, λ repressor...

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

פרוטוקול זה מתאר הליך ניסיוני לביצוע...

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

כאן אנו מציגים שיטה למדידת ישירות RNA העברה טעינה רמות מטוהרים Escherichia coli RNA, כמו גם כדרך להשוות בין רמות היחסי של העברת RNA, או כל RNA קצרים אחרים, מדגמים שונים בהתבסס על התוספת של ספייק-in תאים המבטאים גנים התייחסות.

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת בחיי עיר הכלאה הפרוטוקול ממוטבת כדי לכמת את מספר מולקולות RNA בניצני שמרים במהלך גידול וגטטיבי, מיוזה.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג מוטציות ספציפיות חומצה deoxyribonucleic (DNA). פרוטוקול זה מתאר איך לעשות מוטגנזה בצעד 2, 3-צעד תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) המבוסס על הגישה, אשר חלים על כל מקטע DNA עניין.

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

מעקב אחר אירועי תרגום בודדים מאפשר מחקרים קינטיים ברזולוציה גבוהה של מנגנוני תרגום תלויי כובע. כאן אנו מדגימים מבחנה במבחנה של מולקולה אחת המבוססת על אינטראקציות הדמיה בין נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית לפפטידים המתהווים המתויגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולה אחת של קינטיקה של חניכה והתארכות פפטיד במהלך תרגום פעיל תלוי כובע במבחנה.

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

פלואורסצנטיות RNA מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH) היא שיטה לכימות מדויק של רמות ולוקליזציה של RNAs ספציפיים ברמת התא הבודד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקולי המעבדה המאומתים שלנו לעיבוד ספסל רטוב, הדמיה וניתוח תמונה לכימות תאים בודדים של RNAs ספציפיים.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

העברת אנרגיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת היא שיטה העוקבת אחר הדינמיקה של ה- tRNA במהלך סינתזת חלבונים ריבוזומליים. על ידי מעקב אחר ריבוזומים בודדים, זוהו אוכלוסיות לאהומוגניות, אשר שופכים אור על מנגנונים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לעקוב אחר שינויים קונפורמציה ביולוגית באופן כללי כדי לחשוף קשרי גומלין דינמיים-פונקציה במערכות ביולוגיות מורכבות רבות אחרות. שיטות מולקולה בודדת יכולות לבחון צעדים מגבילים שאינם בקצב ומתווכים מרכזיים מאוכלסים נמוך, שאינם נגישים בשיטות הרכב קונבנציונליות בשל האפקט...

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

למדו את פרוטוקול smFISH דו-צבעי לחקר קינטיקת שעתוק ופירוק mRNA בחיידקי Escherichia coli. שיטה זו מאפשרת עיבוד מקבילי של 48 דגימות תוך שמונה שעות ומספקת תובנות לגבי דינמיקת שעתוק בזמן אמת.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

גלה סרטונים נוספים