Name: צינור ביואינפורמטיקה לחקירת אבולוציה מולקולרית וביטוי גנים באמצעות RNA-seq (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: חקור אבולוציה מולקולרית וביטוי גנים באמצעות צינור ביואינפורמטיקה לניתוח RNA-seq. השיטה מזהה גנים מועמדים כמו אופסינים ב-Hydra vulgaris ומייצרת עצי פילוגניה להבנת אבולוציה של חישה וראייה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאדריאנה בריסקו, גיל סמית', רבי מוראד ואלין ג' ריינג'ל על ייעוץ והדרכה בשילוב חלק מהשלבים הללו בזרימת העבודה שלנו. אנו מודים גם לקתרין ויליאמס, אליזבת רבואה ונטשה פיצ'יאני על הערות על כתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן ג'ורג' א. יואיט למלגת מחקר רפואי ל- A.M.M.

למחברים אין מה לחשוף.

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מתווה של השלבים לאפיון משפחת גנים באמצעות נתוני RNA-seq. שיטות אלה הוכחו לעבוד עבור מגוון רחב של מינים datasets4,34,35. הצינור שהוקם כאן כבר מפושט צריך להיות קל מספיק כדי להיות מלווה טירון בביואינפורמטיקה. משמעות הפרוטוקול היא שהוא מתאר את כל השלבים והתוכניות הדרושות להשלמת ניתוח הניתן לפרסום. צעד מכריע בפרוטוקול הוא שהרכבת כראוי תעתיקים באורך מלא, זה מגיע מגנום או תעתיקים באיכות גבוהה. כדי להשיג תעתיקי...

ההתקדמות בטכנולוגיות הרצף אפשרה רצף של גנומים ותעתיקים של אורגניזמים שאינם מודלים. בנוסף להיתכנות המוגברת של רצף DNA ו- RNA מאורגניזמים רבים, שפע של נתונים זמין לציבור כדי לחקור גנים מעניינים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק צעדים ביואינפורמטיים כדי לחקור את האבולוציה המולקולרית ואת הביטוי של גנים שעשויים לשחק תפקיד חשוב באורגניזם של עניין.
חקירת האבולוציה של גן או משפחת גנים יכולה לספק תובנה על האבולוציה של מערכות ביולוגיות. בני משפחת גנים נקבעים בדרך כלל על ידי זיהוי מוטיבים שמורים או רצפי גנים הומולוגיים. האבולוציה של משפחת הגנים נחקרה בעבר באמצעות גנומים מאורגניזמים מודלים הקשורים מרחוק1. מגבלה לגישה זו היא שלא ברור כיצד משפחות גנים אלה מתפתחות במינים קרובים ותפקידם של לחצים סלקטיביים סביבתיים שונים. בפרוטוקול זה, אנו כוללים חיפוש אחר הומולוגים במינים קרובים. על ידי יצירת פילוגנית ברמת פילום, אנו יכולים לציין מגמות באבולוציה של משפחת גנים כגון זו של גנים שמורים או כפילויות ספציפיות לשושלת. ברמה זו, אנו יכולים גם לחקור אם גנים הם אורתולוגים או paralogs. בעוד homologs רבים סביר לתפקד באופן דומה זה לזה, זה לא בהכרח המקרה2. שילוב עצים פילוגנטיים במחקרים אלה חשוב לפתור אם גנים הומולוגיים אלה הם אורתולוגים או לא. באיקריוטים, אורתולוגים רבים שומרים על תפקודים דומים בתוך התא כפי שמעידים היכולת של חלבוני יונקים לשחזר את תפקודם של אורתולוגים שמרים3. עם זאת, ישנם מקרים שבהם גן לא אורתולוגי מבצע פונקציה מאופיינת4.
עצים פילוגנטיים מתחילים לתוות יחסים בין גנים ומינים, אך לא ניתן להקצות את הפונקציה אך ורק על סמך יחסים גנטיים. מחקרי ביטוי גנים בשילוב עם ביאורים תפקודיים וניתוח העשרה מספקים תמיכה חזקה לתפקוד הגנים. מקרים שבהם ביטוי גנים ניתן לכמת ולהשוות בין אנשים או סוגי רקמות יכול להיות יותר לספר על תפקוד פוטנציאלי. הפרוטוקול הבא עוקב אחר שיטות המשמשות בחקירת גנים opsin ב הידרה וולגריס7, אבל הם יכולים להיות מיושמים על כל מין וכל משפחת גנים. התוצאות של מחקרים כאלה מספקות בסיס להמשך חקירה של תפקוד גנים ורשתות גנים באורגניזמים שאינם מודלים. כדוגמה, החקירה של פילוגנטיה של opsins, שהם חלבונים היוזמים את מפל phototransduction, נותן הקשר האבולוציה של העיניים וזיהוי אור8,9,10,11. במקרה זה, אורגניזמים שאינם מודל במיוחד מיני בעלי חיים בסיסיים כגון cnidarians או ctenophores יכול להבהיר שימור או שינויים מפל phototransduction וראייה על פני clades12,13,14. באופן דומה, קביעת הפילוגניות, הביטוי והרשתות של משפחות גנים אחרות תודיע לנו על המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההתאמות.

<table><tbody><tr><td>ערכת ביואנלייזר-DNA</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>חומרי מעבדה רטובים</td></tr><tr><td>ערכת Bioanalyzer-RNA Agilent</td><td></td><td>5067-1513</td><td>חומרי מעבדה רטובים</td></tr><tr><td>BLAST+ v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>באשכול מחשבים*<br/</td></tr><tr><td>> https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ Blast2GO (במחשב האישי שלך)</td><td></td><td></td><td>במחשב המקומי </td></tr><tr><td>https://www.blast2go.com/b2g-register-basic boost v. 1.57.0</td><td></td><td></td><td>באשכול מחשבים</td></tr><tr><td>Bowtie v. 1.0.0</td><td></td><td></td><td>באשכול מחשבים https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td></tr> <tr><td>אשכול מחשוב (מומלץ מאוד)</td><td></td><td></td><td>הערה: ניתוחים של נתונים גנומיים נעשים בצורה הטובה ביותר באשכול מחשוב בעל ביצועים גבוהים מכיוון שהקבצים גדולים מאוד.</td></tr><tr><td>חפתים v. 2.2.1</td><td></td><td></td><td>באשכול מחשבים</td></tr><tr><td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td><td></td><td></td><td>In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td></tr><tr><td>gcc v. 6.4.0</td><td></td><td></td><td>באשכול מחשבים</td></tr><tr><td>Java v. 11.0.2</td><td></td><td></td><td>באשכול מחשבים</td></tr><tr><td>MEGA7 (במחשב האישי שלך)</td><td></td><td></td><td>במחשב המקומי https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>MEGAX v. 0.1</td><td></td><td></td><td>במחשב המקומי https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>ערכת NucleoSpin RNA II</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td>חומרי מעבדה רטובים</td></tr><tr><td>perl 5.30.3</td><td></td><td></td><td>על אשכול מחשבים</td></tr><tr><td>python</td><td></td><td></td><td>על אשכול מחשבים</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 פלואורומטר</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32866</td><td>חומרי מעבדה רטובים</td></tr><tr><td>R v.4.0.0</td><td></td><td></td><td>על אשכול מחשבים https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td></tr> <tr><td>RNAlater</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7021</td><td>חומרי מעבדה רטובים</td></tr><tr><td>ערכת RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>חומרי מעבדה רטובים</td></tr><tr><td>RSEM v. 1.3.0</td><td></td><td></td><td>תוכנת מחשב https://deweylab.github.io/RSEM/</td></tr><tr><td>RStudio v. 1.2.1335</td><td></td><td></td><td>על מחשב מקומי https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td></tr><tr><td>Samtools v. 1.3</td><td></td><td></td><td>תוכנת מחשב</td></tr><tr><td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>על אשכול מחשבים https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td></tr><tr><td>STAR v. 2.6.0c</td><td></td><td></td><td>על אשכול מחשבים https://github.com/alexdobin/STAR</td></tr><tr><td>StringTie v. 1.3.4d</td><td></td><td></td><td>על אשכול מחשב https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td></tr> <tr><td>Transdecoder v. 5.5.0</td><td></td><td></td><td>על אשכול מחשבים https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td></tr><tr><td>Trimmomatic v. 0.35</td><td></td><td></td><td>על אשכול מחשבים http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Trinity v.2.8.5</td><td></td><td></td><td>על אשכול מחשבים https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>חומרי מעבדה רטובים</td></tr><tr><td>ערכת הכנה לספריית RNA TruSeq v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>חומרי מעבדה רטובה</td></tr><tr><td>TURBO ערכת DNA ללא</td> DNA <td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td>חומרי</td></tr> <tr><td></td><td>מעבדה רטובה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>*הורדות והתקנה באשכול המחשבים עשויות לדרוש גישת שורש. פנה למנהל הרשת שלך.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

צינור ביואינפורמטיקה לחקירת אבולוציה מולקולרית וביטוי גנים באמצעות rna-seq

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

זיקוק ודיווח על ערכות נתונים גדולות, כגון נתוני גנום שלם או תעתיק, הוא לעתים קרובות משימה מרתיעה. אחת הדרכים לפרק את התוצאות היא להתמקד במשפחות גנים אחת או יותר שהן משמעותיות לאורגניזם ולחימוד. בפרוטוקול זה, אנו מתארים צעדים ביואינפורמטיים כדי ליצור פילוגנית ולכמת את הביטוי של גנים מעניינים. עצים פילוגנטיים יכולים לתת תובנה כיצד גנים מתפתחים בתוך ובין מינים, כמו גם לחשוף אורתולוגיה. תוצאות אלה ניתן לשפר באמצעות נתוני RNA-seq כדי להשוות את הביטוי של גנים אלה אצל אנשים שונים או רקמות. מחקרים על אבולוציה מולקולרית וביטוי יכולים לחשוף דרכי אבולוציה ושימור של תפקוד גנים בין מינים. אפיון משפחת גנים יכול לשמש כקרש קפיצה למחקרים עתידיים ויכול להדגיש משפחת גנים חשובה בנייר גנום או שעתוק חדש.

השיטות לעיל מסוכמות באיור 1 והוחלו על ערכת נתונים של רקמות הידרה וולגריס. H. vulgaris הוא חסר חוליות מים מתוקים השייך לפירום Cnidaria הכולל גם אלמוגים, מדוזות ושאינות ים. H. וולגריס יכול להתרבות באופן א-מיני על ידי ניצנים והם יכולים לחדש את הראש והרגל שלהם כאשר חצוי. במחקר זה, אנו שואפים לחקור את האבולוציה והביטוי של גנים opsin ב הידרה7. בעוד הידרה חסר עיניים, הם מפגינים התנהגות תלוית אור32....

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את האבולוציה והביטוי של גנים מועמדים באמצעות נתוני רצף RNA.

צינור ביואינפורמטיקה לחקירת אבולוציה מולקולרית וביטוי גנים באמצעות RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

פרוטוקול זה מתאר צעדים ביואינפורמטיים לחקירת האבולוציה המולקולרית והביטוי של גנים מועמדים. כאן אנו מספקים הוראות יסודיות כך שכל מי שיש לו ניסיון ביואינפורמטי מינימלי יכול לרוץ דרך פרוטוקול זה. צינור זה יכול להיות מיושם על כל אורגניזם וכל משפחת גנים.בעיה נפוצה אחת בעת ביצוע ביואינפורמטיקה היא סקריפטים מעטפת נכשל. בעת ניסיון לבצע פרוטוקול זה, ודא שותקת את התוכנה העדכנית ביותר, קרא את קבצי השגיאה ועיין במדריך בקפידה. כדי להתחיל, היכנס לחשבון אשכול המחשב בחלון מסוף או יישום PuTTY.על המסוף, להוריד SRA Toolkit גירסה 2.8.1 באמצעות Wget, ולאחר מכן לסיים את התקנת התוכנית. חפש ב- NCBI את מספר ההצטרפות של SRA עבור הדגימות הרצויות ולאחר מכן השג את נתוני רצף ה- RNA בחלון המסוף. השג שני קבצי FASTQ עבור סוג קבצים עם קצה משויך.מצא את גנום הייחוס באינטרנט אם קיים. כדי להשיג הרכבה של הפניה, הקלד wget בחלון המסוף והדבק את כתובת הקישור. אם זמין, גם להעתיק את קובץ GTF וקובץ FASTA חלבון עבור הגנום הפניה.צור אינדקס של הגנום ולאחר מכן מפה קוראת ומחשבת ביטוי עבור כל דגימה. שנה את שם קובץ התוצאות למשהו תיאורי וצור מטריצה של כל הספירות. פתח חלון דפדפן אינטרנט עבור אל NCBI GenBank.בסרגל החיפוש, הקלד את שם גן העניין ואת השם של מינים קרובים אשר כבר רצף. מימין ל סרגל החיפוש, בחר חלבון ולאחר מכן לחץ על חיפוש. חלץ את הרצפים על-ידי לחיצה על שלח אל ולאחר מכן בחר קובץ.תחת עיצוב, בחר FASTA ולאחר מכן לחץ על צור קובץ. העבר קובץ FASTA של הומולוגים לאשכול המחשבים באמצעות חלון מסוף מקומי או FileZilla. לאחר מכן, חפשו גנים מועמדים באמצעות BLAST+על אשכול המחשבים, צרו מסד נתונים של BLAST מהגנום או חלבון מתורגם לתעתיק, FASTA.הפיצוץ רצפי הגנים homologous מ NCBI למסד הנתונים של המינים של עניין, ולאחר מכן להציג את קובץ הפלט באמצעות הפקודה יותר. העתק מזהי גנים ייחודיים ממין מעניין לקובץ טקסט חדש. לחלץ את הרצפים של גנים מועמדים.כדי לאשר ביאור גנים באמצעות REciprocal BLAST, עבור אל כלי החיפוש של היישור המקומי BLAST, בחר BLASTP ולאחר מכן הדבק את רצפי המועמדים, בחר את מסד הנתונים הלא מיותר של רצף החלבונים ולחץ על BLAST. פתח את מגה, לחץ על ישר ולאחר מכן ערוך יישור בניה, בחר צור יישור חדש ולחץ על אישור. בחר חלבון. כאשר חלון היישור נפתח, לחץ על ערוך.לחץ על הוסף רצפים מקובץ ובחר את FASTA עם רצפי חלבונים של גנים מועמדים והומולוגים סבירים. בחר את כל הרצפים. מצא את סמל הזרוע ורחף מעליו.זה צריך לומר ליישר רצפים באמצעות אלגוריתם שריר. לחץ על סמל הזרוע ולאחר מכן לחץ על ישר חלבון כדי ליישר את הרצפים ערוך פרמטרים או לחץ על אישור כדי להשתמש בפרמטרי ברירת המחדל. פרוטוקול זה הוחל על רקמות של הידרה וולגריס שהיא חסרת חוליות במים מתוקים השייכת לפילום קנידריה.גנים Opsin נחקרו כדי לקבל תובנה האבולוציה של עיניים וגילוי אור בבעלי חיים. רצפים עבור גנים הקשורים opsin של H.vulgaris ומינים אחרים חולצו לתוך קובץ FASTA מן GenBank NCBI. הגנים opsin היו מיושרים מגה, מה שמאפשר לזהות opsins הידרה שהיו חסרים חומצת אמינו שימורי ליצין הדרושים כדי לקשור מולקולה רגישה לאור.עץ בעל סבירות גבוהה נוצר באמצעות רצפי אופסין מהידרה וולגריס ומינים אחרים. הפילוגניה מרמזת על כך שגנים של אופסין מתפתחים על ידי כפילויות ספציפיות לשושלת אצל קנידרים, ופוטנציאל על ידי כפילויות טנדם ב- H.vulgaris. לאחר מכן, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בוצע ב- edgeR כדי לחקור ביטוי מוחלט של גנים opsin.כדי לקבוע אם אופסינים אחד או יותר מוסדרים בהיפוסטום, או בראש, בוצעו השוואות מבחינת זוג של היפוסטום לעומת עמוד הגוף, אזור ניצנים, רגל וצרועות. נמצא כי 1,774 תעתיקים באו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בין ההיפוסטום לטור הגוף. הגנים שהיו מוסדרים על פני השוואות מרובות נקבעו, והעשרה תפקודית Blast2GO בוצעה.לבסוף, הביטוי המוחלט של גנים opsin נחקר ברקמות שונות בשלבים שונים של ניצנים, ובמהלך נקודות זמן שונות של התחדשות. בדיקה ויזואלית של היישור והעץ תאשר אם הגנים המועמדים שייכים למשפחת העניין. גנים שונים מדי ברצף או קבוצה מחוץ לכל דבר אחר, הם כנראה חלק ממשפחת גנים אחרת.תוצאות מפרוטוקול זה יכולות להיחשב כמחוללות השערות. צינור זה יכול להדגיש גנים מועמדים ללמוד פונקציונלית במחקרים עתידיים. לאחר חקירת ביטוי הידרה opsin, אנו משתמשים כעת בטכניקות דומות כדי לחקור גנים קשורים על פני מינים על מנת לזהות קווי דמיון והבדלים בתפקוד.

a-bioinformatics-pipeline-for-investigating-molecular-evolution-gene

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ניתוחי RNA-רצף וביואינפורמטיקה שמשו לזהות גורמי שעתוק הביעו באופן משמעותי ואופן דיפרנציאלי בתת אוכלוסיות לין-CD34 + ולין-CD34- של EMLcells עכבר. גורמי שעתוק אלו עשויים לשחק תפקיד חשוב בקביעה לעבור בין תאי לין-CD34- לין-CD34 + ומובחן באופן חלקי עצמי חידוש.

זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

אנו מתארים שיטה מבוססת ריצוף RNA ממוקדת הכוללת הכנת ספריות cDNA באינדקס, הכלאה ולכידה עם בדיקות מותאמות אישית וניתוח נתונים כדי לחקור תעתיקים נבחרים לביטוי גנים, מוטציות ואיחוי גנים. RNAseq ממוקד מאפשר הערכה חסכונית ומהירה של תמלילים נבחרים ברצף שולחני.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

כאן, אנו מציגים גישה ביולוגית ואנליזות כדי לזהות את הביטוי LINE-1 ברמה מסוימת.

ה-RNA רצף הדור הבא וצינור ביואינפורמטיקה לזיהוי קו מבוטא-1s ברמה הספציפית לוקוס

מוצג כאן הוא הליך צעד צעד עבור הבידול במבחנה של keratinocytes האדם העיקרי על ידי עיכוב מגע ואחריו אפיון ברמה המולקולרית על ידי ניתוח RNA-seq.

אפיון של בידול במבחנה של Keratinocytes האדם העיקרי על ידי ניתוח RNA-Seq

שיטה זו מתארת את השלבים כדי לשפר את האיכות והכמות של נתוני הרצף שניתן להשיג באמצעות דגימות RNA מוטבעות (FFPE) קבועות של שעווה מוטבעת של formalin. אנו מתארים את המתודולוגיה להעריך יותר במדויק את האיכות של הדגימות FFPE-RNA, להכין ספריות ברצף, ולנתח את הנתונים מ FFPE-RNA דגימות.

אופטימיזציה לרצף וניתוח של הירידה FFPE-בדיקות RNA

פרוטוקול מפורט של שיטות ניתוח ביטוי דיפרנציאלי עבור רצף RNA סופק: לימה, EdgeR, DESeq2.

שלוש שיטות לניתוח ביטויים דיפרנציאליים לרצף RNA: לימה, EdgeR, DESeq2

פרוטוקול זה מאפשר בקרת איכות ראשונית לניסויי RNA-seq עבור ביולוגים במעבדה רטובה עם ניסיון מוגבל בביואינפורמטיקה.

Rup (צינור הערכת שימושיות RNA-seq) - בקרת איכות לניסויי RNA-seq בתפזורת באיקריוטים

כאן אנו מדווחים על דור של Tre recombinase דרך האבולוציה, בבימויו מולקולרית. Tre recombinase מזהה רצף מוגדר מראש היעד בתוך רצפי LTR provirus של HIV-1, וכתוצאה מכך כריתה לבין מיגור provirus מ תאים אנושיים נגועים. אמנם עדיין בחיתוליו, אבולוציה מולקולרית מכוונת תאפשר יצירה של אנזימים אישית שישמש כלי הניתוח המולקולרי ורפואה מולקולרית.

אבולוציה מולקולרית של recombinase Tre

הליך זה מתאר כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ואחריו transfection באמצעות Pulser ג'ין מערכת MXCell electroporation.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

הפגנה של בידוד של חוט השדרה בילוד עכבר ללימודי אלקטרו.

חוט השדרה Electrophysiology

חקור אבולוציה מולקולרית וביטוי גנים באמצעות צינור ביואינפורמטיקה לניתוח RNA-seq. השיטה מזהה גנים מועמדים כמו אופסינים ב-Hydra vulgaris ומייצרת עצי פילוגניה להבנת אבולוציה של חישה וראייה.

צינור ביואינפורמטיקה לחקירת אבולוציה מולקולרית וביטוי גנים באמצעות RNA-seq

גלה סרטונים נוספים