Name: חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: חקור שיטת ניקוי מתילסיילאט להדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן לבנה בעכברים ובבני אדם. השיטה מאפשרת זיהוי של כלי דם, תאי חיסון וטיפות שומן לחקר מחלות מטבוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת קוט ד 'אזור, ועל ידי מענקים מסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) באמצעות ההשקעות עבור ה-Labex SIGNALIFE העתידי (ANR-11-LABX-0028-01), התוכנית UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) באמצעות האקדמיה 2 "מתחמי Systèmes" והאקדמיה 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), ואת תוכנית החוקר הצעיר לג'יי.ג'יי (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). אנו מודים גם למתקן ליבת ההדמיה של C3M במימון קונסיל דפרטמנטל דה אלפס-מריטיים ו-Région PACA, אשר נתמך גם על ידי פלטפורמת המיקרוסקופ וההדמיה IBISA Côte d'Azur (MICA). אנו מודים למריון דוסוט על העזרה הטכנית בהכנת רקמות. אנו מודים לאבי קאטריס, הנראות המדעית הבינלאומית של UCA, על קריאת כתב היד.

פרוטוקול זה נבדק ומאומת עבור כל מחסני רקמת השומן של העכבר והאדם הלבן. רקמות שומן אדם ועכבר נאספו בהתאם לחוקים האירופיים ואושרו על ידי ועדות אתיות צרפתיות ושוודיות.
1. קיבעון של רקמת השומן לבן של העכבר והאדם
<ol><li>לטבול את העכבר שנקטפו או רקמות שומן לבן אנושי לפחות 10 מ"ל של PBS המכיל 4% paraformaldehyde (PFA) בצינור פלסטיק 15 מ"ל.</li>
	<li>לנער את צינור הפלסטיק בטמפרטורת החדר על צלחת מתגלגלת במשך 1 שעה.</li>
	<li>להשאיר את צינור הפלסטיק ב 4 מעלות צלזיוס על לוח מתגלגל בן לילה, כדי להשלים את קיבעון. הערה: פרוטוקול זה מותאם דגימות רקמת שומן גדולה, כגון רפידות שומן אפידימליות שלמות שהתקבלו מעכברים האכילו דיאטה נורמלית (≈250 מ"ג - ≈0.6 ס"מ3). עבור דגימות גדולות יותר כמו רפידות שומן אפידימליות שהתקבלו מעכברים האכילו דיאטת שומן גבוהה (≈1.5 גרם - ≈4ס"מ 3)או דגימות רקמת שומן אנושית, למרות פרוטוקול ניקוי צריך לעבוד בצורה מושלמת עבור המדגם כולו (על ידי שינוי קנה מידה של PFA ותערובות נוגדנים), באופן כללי, אנו חותכים חתיכות רקמות סביב 1 גרם (≈2.5 ס"מ3)כדי לשמור את הדגימות הנותרות או עבור כתמים נוספים או יישומים. עבור PFA (שלב 1.1.) אנו ממליצים להשתמש בערך 10 פעמים את נפח הרקמה. עבור תערובות נוגדנים (שלבים 3.1. ו 3.4.), להגביר את עוצמת הקול כדי לטבול לחלוטין את הרקמה, ולהשתמש צינור פלסטיק 15 מ"ל (ראה טבלת חומרים)אם הרקמה גדולה מדי עבור microtube פלסטיק 1.5 מ"ל (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>2. חירבול ורוויה של רקמת שומן לבנה ואנושית
<ol><li>לשטוף את רקמת שומן לבן קבוע ב 10 מ"ל של PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כל העקבות של PFA.</li>
	<li>לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.3% גלצין (ראה טבלת חומרים)ולנער את הצינור בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית במשך 1 h ב 100 מהפכות לדקה (סל"ד) כדי להרוות את שאר קבוצות אלדהיד חינם.</li>
	<li>לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100 (ראה טבלת חומרים)ולנער את הצינור ב 37 ° C ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה במשך 2 שעות ב 100 סל"ד.</li>
	<li>לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100 ו 20% DMSO (ראה טבלת חומרים)ולנער את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד לילה.</li>
	<li>לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.1% Tween-20 (ראה טבלת חומרים), 0.1% Triton X-100, 0.1% deoxycholate (ראה טבלת חומרים)ו 20% DMSO ולנער את הצינור ב 37 ° C ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד לפחות 24 שעות.</li>
	<li>לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100 ולנער את הצינור בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 1 שעה.</li>
	<li>לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO ו-3% BSA (ראה טבלת חומרים)ונענעו את הצינור ב-37°C בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב-100 סל"ד למשך 12 שעות, כדי לרוויה את כל האתרים שאינם קשורים באופן ספציפי לנוגדנים. הערה: בשלב 2.7, BSA ניתן להחליף על ידי סרום דם של המין של הנוגדן המשני בשימוש.</li>
</ol>3. הליך התכתמות עבור רקמת שומן לבנה ואנושית
<ol><li>להעביר את הרקמה במיקרו-tube פלסטיק 1.5 מ"ל המכיל 300 μL של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA ואת הנוגדנים העיקריים (10x מרוכז יותר מאשר עבור הכתמת cryosection אבל ריכוז נוגדנים אופטימלי צריך להיות מוערך עבור כל נוגדן). הגן על הצינור מפני אור על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום ולנער את הצינור ב 37 ° C בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד במשך יומיים לפחות (ראה את הפתק בשלב 1.1 וצעד 3.7.1).</li>
	<li>לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO ו 3% BSA ולנער את הצינור מוגן מפני אור ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד עבור 5 שעות. בצע שלב זה פעמיים.</li>
	<li>לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO ו 3% BSA ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, ב 37 ° C ב שייקר מסלול מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד ללילה אחד עד יומיים.</li>
	<li>להעביר את הרקמה למיקרו-tube פלסטיק 1.5 מ"ל המכיל 300 μL של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA ואת הנוגדנים המשניים (10x מרוכז יותר מאשר עבור הכתמת cryosection). הגן על הצינור מפני אור על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום ולנער את הצינור ב 37 ° C בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד במשך יומיים לפחות (ראה את הפתק בשלב 1.1 וצעד 3.7.1).</li>
	<li>לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, ו 3% BSA ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, ב 37 ° C ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד עבור 5 שעות. בצע שלב זה פעמיים.</li>
	<li>לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, ו 3% BSA ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, ב 37 ° C ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד ללילה אחד עד יומיים.</li>
	<li>לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד עבור 2 שעות. הערה: עבור תיוג של מבנים ספציפיים כגון גרעין או actin, להוסיף 4′,6-diamidino-2-פנילידול (DAPI או שווה ערך) ו / או פלואורסצנט מסומן-פאלואידין יש להוסיף בשלב 3.1. כאשר משתמשים רק במנוגים ראשוניים המסומנים בפלורסנט, או בשלב 3.4. כאשר משתמשים בנבדנים משניים. הערה: עבור הליך הכתמים, נוגדנים ראשוניים כבר הוסתרו עם fluorochromes (כמו אלה המשמשים עבור ציטומטריה זרימה) ניתן להשתמש ואנחנו ממליצים על זה לרווחת זמן וספנות. אכן, גם אם נוגדנים ראשוניים העכבר ניתן להשתמש ואחריו נוגדנים משניים נגד עכבר, כפי שהראינו את זה כאן, לעתים קרובות הבחנו כתמים לא ספציפיים של כלי דם בשל מחזור אימונוגלובולין. לכן, כדי למנוע בעיה זו, נוגדנים ראשוניים שכבר מסומנים מומלצים מאוד וכאן אנו מספקים ראיות לכך הנוגדנים המשמשים ציתום זרימה תואמים להליך שלנו. עם זאת, במקרה הספציפי של אנטיגן המתבטא ברמות נמוכות, צעד ההגדלה אות באמצעות נוגדנים משניים הוא חובה; כאשר הנוגדן העיקרי הזמין היחיד נעשה בעכבר, זיגוג לב של העכברים עם PBS לפחות 5 דקות בהקרבה יכול להסיר חלק גדול של אימונוגלובולין במחזור ולכן הכתמים הלא ספציפיים.</li>
</ol>4. ניקוי הליך עבור עכבר ורקמות שומן לבן אנושי
<ol><li>לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 50% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.</li>
	<li>לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 70% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.</li>
	<li>לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 95% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.</li>
	<li>לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 100% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.</li>
	<li>לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 100% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד לילה.</li>
	<li>לטבול את הרקמה בבקבוק זכוכית 20 מ"ל עם פקק פלסטיק (ראה שולחן של חומרים) המכיל 5 מ"ל של מתיל סלצילאט (ראה טבלת חומרים)מתחת למכסה המנוע הכימי ולנער את מיכל הזכוכית, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולי ב 100 סל"ד לפחות 2 שעות. הערה: ניתן להאיץ באופן משמעותי את הליך ההנקה (במידת הצורך) על-ידי הימנעות מהצעדים 4.3. ו 4.5., למרות איכות ניקוי הסופי יהיה מופחת במקצת.</li>
</ol>5.3D הדמיה קונפוקל של רקמת שומן לבנה פינה
<ol><li>מעבירים את הרקמה לתא הדמיה מתכתי המצויד בתחתית זכוכית (ראה שולחן חומרים)מתחת למכסה המנוע הכימי ומלא את התא במטיל סליצילאט טרי. הערה: כדי לאבטח את הרקמה במקום, ובכך למנוע ממנה לצוף או לנוע הצידה בתא, יש למרוח מספר כיסויי זכוכית עגולים של 18 מ"מ (ראה טבלת חומרים)על גבי הרקמה בעת הרכבתה לתא.</li>
	<li>מניחים את תא ההדמיה על מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך.</li>
	<li>תמונה הרקמה באמצעות מטרת הגדלה נמוכה (למשל, 4x המטרה) כדי ליצור כמה ס"מ3 מפות 3D של רקמת שומן כולה או של דגימת הרקמה האנושית.</li>
	<li>בחר מספר אזורים לדגימת הרקמה בהגדלה גבוהה יותר. בדרך כלל, השתמש ביעד אוויר למרחקים ארוכים של פי 20 המספק יחס טוב בין רזולוציה לעומק. אנו רוכשים תמונות פסיפס גדולות עם z-stacks בין 600 ו 2000 μm עומק. הערה: השתמש במטרה למרחקים ארוכים כדי לתמונה עמוקה יותר לתוך הרקמה.</li>
</ol>6. הפקת תוצאות כמותיות מתמונות רקמת השומן 3D
הערה: ניתן לבצע את פילוח המבנים השונים ואת החילוץ הבא של המידע הכמותי מערימת התמונה תלת-מיו שנעצר בנקודה 5 באמצעות כל אחת מאפשרויות התוכנה הקיימות רבות לניתוח תמונות, מסחריות או חופשיות. בנקודות הבאות, אנו מתארים אסטרטגיה המשמשת באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לחלץ מידע כמותי מתמונות רקמת שומן 3D באמצעות תוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
<ol><li>המר את ערימות תלת-מית-אל לתבנית התוכנה למרחב זיכרון פנוי.</li>
	<li>תמקטע את התאים.<ol>
<li>פתח את מודול התא של התוכנה.</li>
		<li>שנה את ההגדרה זיהוי תאים לכתמים קרום פלזמה.</li>
		<li>בחר את ערוץ הפלורסנט של הסמן המשמש כדי לפרט את פריפריה התא (פאלואידים אשר תוויות אקטין קליפתי או סמני קרום פלזמה כגון F4/80 עבור מקרופאג,TCR-β עבור תאי T, או אשכול של חלבוני תקליטור בידול ספציפיים עבור תת סוגים של תאים חיסוניים).</li>
		<li>הגדר את הסף וספק טווח של גודל תא צפוי (כלומר, 1 עד 200 μm לזיהוי תאים).</li>
		<li>הפעל את פילוח. אמצעי אחסון המתאים לערימת z ייווצר כאשר התאים המחולקים מקודדים בצבע בצבע שונה עבור כל אחד מהתאים השכנים.</li>
		<li>החל מסננים סטטיסטיים (גודל, מעוגל, מעגליות וכו') בכרטיסיה סטטיסטיקה כדי לא לכלול חפצי פילוח ו/או כדי למקד את התאים המחולקים לתא העניין בהתבסס על גודלם (כלומר, 20-200 μm עבור adipocytes; 5-25 μm עבור מקרופאגים; 1-3 μm עבור לימפוציטים).</li>
		<li>חלץ מדידות ונתונים כמותיים (אמצעי אחסון, מספר, גודל, קוטר וכו') מהלשונית סטטיסטיקה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>רכיבים תאיים פלח (גרעינים, שלל, וכו ') או כלי כמבנה. הערה: למרות פילוח נימה הוא מאוד שימושי ללמוד את הקישוריות של כלי, אנו משתמשים פילוח מודול פני השטח כדי לחלץ נתונים על הגודל, נפח וקוטרים של כלי. אכן, הכימות של הגדלים של כלי אבד בעת שימוש במודול נכי.<ol>
<li>פתח את מודול Surface של התוכנה.</li>
		<li>בחר את ערוץ הפלורסנט של הסמן המשמש לסימון ספציפי של הרכיב התת-תאי כדי לשחזר אותו ב- 3D.</li>
		<li>הגדר את הסף ולספק טווח של גודל הקוטר הצפוי של המבנה (כלומר, 0.5-5 μm עבור גרעין; 0-100 μm עבור כלי; וכו ').</li>
		<li>הפעל את פילוח. ייווצר אמצעי אחסון עם המבנה התאי המקטע. ניתן לחלץ מדידות ונתונים כמותיים (אמצעי אחסון, מספר, גודל, קוטר וכו') מהלשונית סטטיסטיקה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חלק את כלי הדם כרצף צינורי. הערה: למרות פילוח נימה הוא מאוד שימושי ללמוד את הקישוריות של כלי, אנו משתמשים פילוח מודול פני השטח כדי לחלץ נתונים על הגודל, נפח וקוטרים של כלי. אכן, הכימות של הגדלים של כלי אבד בעת שימוש במודול נכי.<ol>
<li>פתח את מודול הנינים של התוכנה.</li>
		<li>בחר את ערוץ הפלורסנט המתאים להכתמת כלי הדם.</li>
		<li>הגדר את הסף עבור עוצמת הפלואורסץ ובחר את המספר המתאים של צמתים מחוברים צפויים.</li>
		<li>הפעל את פילוח. ייווצקו ב-3D תסנים המייצגים את רשת כלי השיט. ניתן לחלץ מדידות מלשונית הסטטיסטיקה, המאפשרת להשיג נתונים כמותיים כולל אורך כלי שיט, מספר הסתעפות כלי שיט וכו'.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+plasticity%3A+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li>
<li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin%2C+Leptin%2C+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li>
<li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+metabolic+complications+in+obesity%3A+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Clinical+Nutrition+%26+Metabolic+Care%22%5BJournal%5D)">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li>
<li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li>
<li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375(2015).</li>
<li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li>
<li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li>
<li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592(2018).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity%3A+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li>
<li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).</li>
<li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipo-Clear%3A+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271(2018).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225(2016).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274(2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553(2017).</li>
<li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22(2014).</li>
<li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+%28sDISCO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368(2019).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22%C3%9Cber+das+Durchsichtigmachen+von+Menchlichen+und+Tierichen+Pr%C3%A4paraten+und+Seine+Theoretischen%22">Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen</a>. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).</li>
<li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Adipose+Tissue+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li>
<li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li>
<li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li>
<li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250(2017).</li>
<li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+changes+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 1049-1052 (2005).</li>
<li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation%3A+plasticity+of+the+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li>
<li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li>
<li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266(2019).</li>
<li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471(2016).</li>
</ol>

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

השינויים המתרחשים בתוך רקמת השומן במהלך ההתקדמות הפתולוגית, כגון זה של השמנת יתר, הוא בסיסי להבנת המנגנונים מאחורי הפתולוגיה. מחקרים חלוציים שחשפו מנגנונים כאלה ברקמת שומן התבססו על גישות גלובליות כגון פרוטאומיקה רקמת שומןשלמה 21, ציתוםזרימה 22,23, ותעתיק24,25. בנוסף, נעשו מאמצים לחקור את השינויים המבניים המתרחשים ברקמת שומן באמצעות ניתוחים היסטולוגיים26<sup...

השמנת יתר מאופיינת בעלייה במסת רקמת שומן והפכה לבעיה גדולה ברחבי העולם לבריאות הציבור, בהתחשב בכך שאנשים עם השמנת יתר יש סיכון מוגבר לפתח מחלות לב וכלי דם, סוכרת סוג 2, מחלות כבד וכמה סוגי סרטן.
פונקציה פיזיולוגית בסיסית של רקמת שומן היא לווסת גלוקוז כל הגוף הומאוסטאזיסשומנים 1,,2. במהלך תקופת ההאכלה, adipocytes (כלומר, התאים העיקריים של רקמת שומן) לאחסן את עודף הגלוקוז והשומנים המסופקים על ידי ארוחה לתוך טריגליצרידים. במהלך הצום, adipocytes לשבור את הטריגליצרידים לתוך חומצות שומן לא esterified גליצרול כדי לקיים את הביקוש האנרגיה של הגוף. במהלך התפתחות השמנת יתר, רקמת שומן להרחיב על ידי הגדלת הגודל (היסטרופיה) ו / או את המספר (היפרפלזיה) של adipocytes1,כדי להגדיל את קיבולת האחסון שלהם. כאשר ההתפשטות של רקמת שומן מגיע לגבול שלה, משתנה מאוד קבוע בקרב חולים, שומנים הנותרים מצטברים לתוך איברים מטבוליים אחרים כולל שרירים וכבד3, 4,המוביל לכשל התפקודישלהם וייזום סיבוכים אירוביים הקשורים להשמנת יתר1,,5. לכן, זיהוי המנגנונים השולטים בהרחבת רקמת שומן הוא אתגר קליני מרכזי.
השינויים המורפולוגיים המתועדים בתוך רקמות שומן במהלך השמנת יתר קשורים לתפקוד הפתולוגי שלה. מספר הליכי כתמים שימשו לתיאור ארגון הרקמות של רקמת השומן, כולל actin6, סמני כלידם 7, סמנים שומנים-טיפות8, וסמניםספציפיים תא חיסוני9,,10. עם זאת, בגלל הקוטר העצום של adipocytes (50 כדי 200 μm)11, זה חיוני לנתח חלק גדול של הרקמה כולה בשלושה ממדים על מנת לנתח במדויק את השינויים המבניים הדרמטיים AT שנצפו במהלך השמנת יתר. עם זאת, מכיוון שהאור אינו חודר רקמה אטומה, הדמיה ב3D בתוך דגימות רקמה גדולה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסץ אינה אפשרית. שיטות של ניקוי רקמות כדי להפוך אותם שקופים דווחו בספרות(לסקירה, ראה 12)המאפשר אחד לנקות רקמות ולבצע מעמיק, מיקרוסקופ פלואורסק של רקמות שלם. שיטות אלה מציעות הזדמנויות חסרות תקדים להעריך את הארגון הסלולרי 3D ברקמה בריאה וחלויה. לכל אחת מהשיטות המתוארות יש יתרונות וחסרונות, ולכן יש לבחור בקפידה בהתאם לרקמות הנחקרות (לסקירה,ראה 13). ואכן, גישות מסוימות דורשות תקופת דגירה ארוכה ו/או שימוש בחומרים או תרכובותיקרים, רעילים או קשים להשגה של 14, 15,,15,16,,17,,18,,19. תוך ניצול של אחת התרכובות הראשונות ששימשו לפני מאה שנה על ידי ורנר Spalteholzכדי לנקות רקמות 20, הקמנו פרוטוקול ידידותי למשתמש ולא יקר כי הוא מותאם היטב עבור ניקוי של כל העכבר ומחסני רקמת שומן אנושי בכל מעבדה עם ציוד טיפוסי כולל מכסה מנוע כימי, שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ומיקרוסקופ confocal.

<table><tbody><tr>צינורות <td>מיקרו 1.5 מ"ל</td><td>אפנדורף - Dutscher</td><td>33528</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פלסטיק 15 מ"ל</td><td>צינורות פלקון - Dutscher</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית עגול 18 מ"מ</td><td>Mariendfeld</td><td>0117580</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק זכוכית 20 מ"ל</td><td>Wheaton</td><td>986546</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן מצומד alexa647</td> נגד עכברים <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-605-150</td><td>דילול: 1/100</td></tr><tr><td>נוגדן נגד ארנב-alexa647-מצומד</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>דילול: 1/100</td></tr><tr><td>נוגדן</td><td>BSA Sigma-aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>CD301-PE</td><td>Biolegend</td><td>BLE145703</td><td>דילול: 1/100</td></tr><tr><td>נוגדן CD31</td><td>AbCam</td><td>ab215912</td><td>דילול: 1/50</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תלת מימד מסחרית - מכשיר</td><td></td> <td>IMARIS Oxford</td><td>עם מודול תא</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי - Nikon A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>ריכוז מלאי: 5 מ"ג/מ"ל; דילול 1/1000</td></tr><tr><td>דאוקסיכולט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Glut4 נוגדן</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-53566</td><td>דילול: 1/50</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Lectin-DyLight649</td><td>Vector Lab</td><td>DL-1178-1</td><td>ריכוז מלאי: 2 ומיקרו; g/&micro; L; הזרקה לווריד: 50 ומיקרו; L/עכברים</td></tr><tr><td>תא הדמיה מתכתי מצויד בתחתית זכוכית - AttoFluor Chamber</td><td>Thermofisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Methyl salicylate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6752</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פריליפין</td> דילול <td>Progen</td><td>651156</td>: <td>1/50</td></tr><tr><td>Phalloidin-alexa488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td>דילול: 1/100</td></tr><tr><td>נוגדן</td> <td>TCR-&beta;-PBדילול BLE109225 Biolegend</td><td></td>: <td>1/100</td></tr><tr><td>TH נוגדן</td><td>AbCam</td><td>ab112</td><td>דילול: 1/50</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P416</td><td></td></tr></tbody></table>

חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

השמנת יתר היא בעיה גדולה ברחבי העולם בריאות הציבור שמגביר את הסיכון לפתח מחלות לב וכלי דם, סוכרת סוג 2, ומחלות כבד. השמנת יתר מאופיינת בעלייה במסה של רקמת שומן (AT) בשל היפרפלזיה אדפוציט ו/או היסטרופיה, מה שמוביל לשיפוץ עמוק של המבנה התלת מימדי שלה. אכן, היכולת המקסימאלית של AT להתרחב במהלך השמנת יתר היא חיונית להתפתחות של פתולוגיות הקשורות להשמנת יתר. הרחבת AT זה היא מנגנון הוםוסטטי חשוב כדי לאפשר הסתגלות לעודף צריכת אנרגיה ולהימנע שפיכת שומנים מזיקים לאיברים מטבוליים אחרים, כגון שריר וכבד. לכן, הבנת השיפוץ המבני שמוביל לכישלון של הרחבת AT היא שאלה בסיסית עם ישימות קלינית גבוהה. במאמר זה, אנו מתארים שיטת ניקוי פשוטה ומהירה המשמשת באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לחקור את המורפולוגיה של רקמת שומן לבנה של עכבר ואדם לבן על ידי הדמיית פלורסנט. שיטת ניקוי AT ממוטבת זו מבוצעת בקלות בכל מעבדה סטנדרטית המצוידת במכסה מנוע כימי, שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ומיקרוסקופ פלורסנט. יתר על כן, תרכובות כימיות בשימוש זמינים. חשוב לציין, שיטה זו מאפשרת לפתור את מבנה 3D AT על ידי הכתמת סמנים שונים כדי לדמיין באופן ספציפי את adipocytes, רשתות עצביות וסקולריות, ואת התפלגות תאי החיסון המולדת ואדפטיבית.

באמצעות ההליך המתואר כאן ומסוכם איור 1, הצלחנו להכתים ולטהר אופטית את רקמת השומן האנושית והעכבר הלבנה כפי שהוצגה בדמות 2A ו-איור 2B, בהתאמה. הרקמה הנוקתה הועברה לתא ההדמיה המתכתי כדי לבצע הדמיה קונפוקאלית(איור 3א). ההבהרה שיפרה באופן דרסטי את עומק תמונות הרקמה שיכולנו לרכוש(איור 3B ואיור 3C). ניתן לרכוש את כל רקמת השומן ב-3D בהגדלה נמוכה באמצעו...

כאן, אנו מתארים שיטת סליקה פשוטה, זולה ומהירה כדי לפתור את המבנה 3D של רקמת שומן לבנה עכבר ואדם באמצעות שילוב של סמנים כדי לדמיין כלי דם, גרעין, תאים חיסוניים, נוירונים, וחלבונים מעיל שומנים-טיפות על ידי הדמיה פלואורסצנטית.

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

פרוטוקולים אלה מאפשרים ניתוח של מבנה תלת מימדי של אדם גדול מאוד על מיקרוסקופיה בלט רקמת שומן עכבר. להקל על הקישור של תפקוד פתולוגי עם שינויים מבניים ברקמת השומן. תהליך ניקוי זה הם פשוטים מאוד, מותאם היטב כדי לנקות את האדם על רקמת שומן עכברים חמים ולהשתמש ממס רעיל פחות כגון אתנול או מתיל salicylate לעומת פרוטוקולים ברורים אחרים.התחל על ידי טבילת העכבר שנקטף או רקמת שומן לבן אנושי לפחות 10 מיליליטר של פורמלדהיד כוח 4% ב PBS בצינור פלסטיק 15 מיליליטר עדיף תחת מכסה המנוע הכימי. לנער את הרקמה על צלחת מתגלגלת בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת לפני העברת הצינור לצלחת מתגלגלת בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר לשטוף את רקמת השומן הלבן קבוע ב 10 מיליליטר של PBS במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כל העקבות של תיקון ולהעביר את הרקמה לצינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 0.3% גליצין ב PBS עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית ב 100 מהפכות לדקה.כאשר קבוצות אלדהיד חינם הנותרים כבר מרווה, לטבול את הרקמה בצינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100 ב PBS עבור דגירה של שעתיים עם רועד ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה לטפל ברקמה עם 10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100 ו 20% DMSO עם רועד ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 0.1%Tween 20, 0.1% טריטון X-100, 0.1% deoxycholate ו 20% DMSO ב PBS עבור דגירה לפחות 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד.בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמה עם 10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100 ב PBS על שייקר מסלולית ב 100 מהפכות לדקה במשך שעה אחת. ואחריו טבילה ב 15 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 10% DMSO ו 3%BSA ב PBS במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. להכתמת רקמת השומן הלבנה.העבר את הרקמה ל-300 מיקרוליטרים של 0.2% טריטון X-100, 10%DMSO ו-3%BSA ב-PBS, בתוספת הנוגדנים העיקריים המעניינים בצינור מיקרו 1.5 מיליליטר להגן עליו מפני אור עם רדיד אלומיניום ולמקם את הצינור לתוך צינור פלקון 50 מיליליטר. מניחים את הצינור לתוך שייקר מסלולית עבור דגירה של יומיים ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. בסוף הדגירה שוטפים את הרקמה פעמיים ב-10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 10%DMSO ו-3%BSA ב-PBS למשך חמש שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות והגנה מפני אור.לאחר השטיפה השנייה לשטוף את הרקמה ב 10 מיליליטר של טריטון X-100 טריטון טרי, 10% DMSO ו 3%BSA ו PBS במשך 16 עד 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות, לאחר מכן להעביר את הרקמה לצינור 1.5 מיליליטר המכיל 300 microliters של 0.2% טריטון X-100, 10%DMSO ו 3%BSA ב PBS, בתוספת נוגדנים משניים המתאימים ולהגן על הצינור מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. לאחר דגירה של יומיים ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר, לשטוף את הרקמה פעמיים ב 10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 10% DMSO ו 3% BSA ב PBS במשך חמש שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד מוגן מפני אור. לאחר הכביסה השנייה, שטפו את הרקמה לצינור המכיל 10 מיליליטר של טריטון X-100 טריטון טרי, 10%DMSO ו-3%BSA ב-PBS למשך 16 עד 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם הגנה מפני רעידות ואור.ואחריו שטיפה של שעתיים ב 10 מיליליטר של PBS לבד ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד והגנה קלה. עבור ניקוי רקמת שומן לבן בסוף לשטוף PBS לטבול את הרקמה ו 10 מיליליטר של עולה שליחת סדרת ריכוז אתנול עבור דגירה של שעתיים לכל ריכוז בטמפרטורת החדר עם רועד מוגן מפני אור כאמור. למחרת בבוקר לטבול את הרקמה בבקבוק זכוכית 20 מיליליטר עם כובע פלסטיק המכיל חמישה מיליליטר של מתיל סליסילאט במכסה המנוע אדים.רקמת השומן הלבנה עדיין נראית בבירור בשלב זה. לנער את המיכל להגן עליו מפני אור בטמפרטורת החדר לפחות שעתיים. רקמת השומן הלבנה הופכת להשתלה לחלוטין.עבור הדמיה קונפוקלית תלת מימדית של רקמת השומן הלבנה המוכתמת והמנוקה, הר תא הדמיה מתכתי המצויד בתחתית זכוכית ותוך מכסה המנוע של האדים מעביר את הרקמה לתא. מלאו את התא במתיל סליסילאט טרי. לסיים את ההרע של התא על ידי הוספת להחליק כיסוי קטן כדי לייצב את הרקמה להחליק כיסוי גדול כדי לסגור את התא.מניחים את התא על שלב מיקרוסקופ קונפוקל הפוך עבור הדמיית רקמות בהגדלה נמוכה כדי ליצור כמה מפות 3D סנטימטר מעוקב של מדגם רקמת השומן כולו. לאחר יצירת מפה תלת-מימדית, השתמשו ביעד אוויר למרחקים ארוכים פי 20 המספק יחס טוב בין הרזולוציה לעומק כדי לבחור מספר אזורים לדגימת רקמות בהגדלה גבוהה יותר. לפילוח תאים, המירו ערימות תלת-מימדיות לתבנית התוכנה כדי לפנות שטח זיכרון.לפני פתיחת מודול התא של התוכנה. שנה את הגדרת זיהוי התאים לכתמי קרום פלזמה ובחר את ערוץ הפלואורסצנט של הסמן המשמש לתיחום הפריפריה של התא. לאחר מכן הגדר את ערכי הסף, ספק טווח של גדלי התאים הצפויים והפעל את הפילוח.ההשפעות של ניקוי על רקמת שומן לבן אדם ועכבר ניתן לראות בעין בלתי. ניקוי גם משפר באופן דרסטי את עומק התמונה של הרקמה כי הוא מסוגל להיות נרכש. ומקל על הדמיה תלת-ממדית של רקמות שלמות ועל יצירת מפה תלת-ממדית מתוך הגדלה של פי 4.מיפוי תלת-מימדי מאפשר עוד יותר לרכוש את הבחירה של תחומי עניין שונים בהגדלה של פי 20 לעומק של שני מילימטרים. כתמים ספציפיים של טיפות השומנים והאדיפוזיטים ניתן להשיג באמצעות נוגדנים perilipin ו anti-GLUT4 בהתאמה. כלי דם ניתן לזהות באמצעות נוגדן CD31 או הזרקה תוך ורידי של Lectin DyLight 649 זמן קצר לפני ההקרבה.ניתן לדמיין מקרופאגים ותאי T באמצעות נוגדן פיקוריתרין נגד CD301 ונוגדן כחול בטא פסיפיק נגד TCR. רשת העצבים ההיקפיים ניתן לזהות באמצעות נוגדן אנטי טירוסין Hydroxylase. באמצעות תיוגים אלה ניתן לקבוע את הגודל והגודל הממוצעים של האדיפוזיטים ואת צפיפות רשת כלי הדם בתוך רקמת השומן.זה חיוני כדי לעקוב אחר זמן הכיבוש כפי שהוכח כי הכנה מדגם לקוי לא יגרום איכות תמונה טובה. פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם מערכת הדמיה מתקדמת או ניתן לשילוב לאחר עיבוד תמונה ניתוח תוכנה חופשית.

exploring-adipose-tissue-structure-methylsalicylate-clearing-3d

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בשל קשר דרסטי והשלילי בין השמנת יתר ומחלות רקע אחרים, מחקר על תפקיד השומן משחק במחלה ועל בריאות כללית היא מוצדקת. אנו מציגים פרוטוקול לבידוד והכריתה של מחסני שומן ומאפשרים לחקר השומן באמצעות באתר ובשיטות חוץ גופית.

לוקליזציה, זיהוי, וכריתה של בסיס מיון Murine שומן

שומן לבן (וואט) יש ליקויים קריטי הדגמים תרבות הראשי הנוכחי שלה, הפרעה מטבולית מחקרים ופיתוח תרופתי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מערכת microphysiological אדיפוז מאת וואט sandwiching בין גליונות של תאי סטרומה. מבנה זה מספק פלטפורמה יציבה וניתנת להתאמה לתרבות וואט העיקרי.

פלטפורמה Microphysiologic שומן אנושי: דחוקה שומן לבן

בשל התכנים שומנים גבוהה בדם, מאתגרת רקמת שומן להמחיש היסטולוגית בשיטות מסורתיות. Adipo-ברור הוא רקמה פינוי טכניקה המאפשרת תיוג חזקים, דימות ברזולוציה של פלורסנט הנפחי של רקמת שומן. כאן, אנו מתארים את שיטות הכנת הדוגמא, רעלני, מכתים, ניקוי של הרכבה עבור הדמיה.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

המוקד של המחקר הנוכחי הוא להמחיש את כולה-הר immunostaining והדמיה הטכניקה כשיטת אידיאלי עבור הדמיה תלת-ממדית של רכיב סלולרי ואדריכלות רקמת שומן.

הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

היווצרות כלי דם חדשים, העצבוב סימפטי לשחק תפקיד מרכזי ב שיפוץ רקמת שומן. עם זאת, נותרו בעיות טכניות ב להמחיש ומדידת באופן כמותי את רקמת שומן. כאן אנו מציגים פרוטוקול בהצלחה תווית ולהשוות באופן כמותי את הצפיפויות של כלי הדם, סיבי עצב ברקמות שומן שונות.

שיתוף צביעת כלי הדם, סיבי עצב ברקמת שומן

אנו מתארים האדם 3D מטריקס-adipocyte מערכת תרבות מבחנה המאפשרת ניתוח של התפקידים של מטריקס ואדיפוציטים בתרומה לפנוטיפ רקמה מטבולית של רקמת השומן.

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

החלפת רקמת שריר בריאה בשומן תוך שרירי היא מאפיין בולט של מחלות ומצבים אנושיים. פרוטוקול זה מתווה כיצד לדמיין, לדמות ולכמת שומן תוך שרירי, ומאפשר מחקר קפדני של המנגנונים העומדים בבסיס היווצרות שומן תוך שרירי.

מדריך לבחינת היווצרות שומן תוך שרירי ומקורו התאי בשרירי השלד

פרדיפוציטים מבודדים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן החום הבין-סקפולרי מעכברים שזה עתה נולדו ומתמיינים לתאים שצוברים טיפות שומנים, מבטאים סמנים מולקולריים ומראים את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של אדיפוציטים חומים בוגרים. תאים אלה מנותחים עוד יותר על ידי immunofluorescence ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה.

התמיינות והדמיה של אדיפוציטים חומים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן הבין-סקפולרית מעכברים שזה עתה נולדו

כאן, אנו מספקים הליך מעשי לניתוח וביצוע ניתוחים היסטולוגיים וביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית.

דיסקציה, עיבוד היסטולוגי וניתוח ביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית מורין

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד, תרבית ופנוטיפ של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מרקמת שומן תת-עורית אנושית (hSATMVECs). בנוסף, אנו מתארים מודל ניסיוני של hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

חקר שיחות צולבות של תאי אנדותל שומן/אדיפוציטים ברקמת שומן תת-עורית אנושית

חקור שיטת ניקוי מתילסיילאט להדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן לבנה בעכברים ובבני אדם. השיטה מאפשרת זיהוי של כלי דם, תאי חיסון וטיפות שומן לחקר מחלות מטבוליות.

חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית

גלה סרטונים נוספים