חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית

פרוטוקולים אלה מאפשרים ניתוח של מבנה תלת מימדי של אדם גדול מאוד על מיקרוסקופיה בלט רקמת שומן עכבר. להקל על הקישור של תפקוד פתולוגי עם שינויים מבניים ברקמת השומן. תהליך ניקוי זה הם פשוטים מאוד, מותאם היטב כדי לנקות את האדם על רקמת שומן עכברים חמים ולהשתמש ממס רעיל פחות כגון אתנול או מתיל salicylate לעומת פרוטוקולים ברורים אחרים.

התחל על ידי טבילת העכבר שנקטף או רקמת שומן לבן אנושי לפחות 10 מיליליטר של פורמלדהיד כוח 4% ב PBS בצינור פלסטיק 15 מיליליטר עדיף תחת מכסה המנוע הכימי. לנער את הרקמה על צלחת מתגלגלת בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת לפני העברת הצינור לצלחת מתגלגלת בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר לשטוף את רקמת השומן הלבן קבוע ב 10 מיליליטר של PBS במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כל העקבות של תיקון ולהעביר את הרקמה לצינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 0.3% גליצין ב PBS עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית ב 100 מהפכות לדקה.

כאשר קבוצות אלדהיד חינם הנותרים כבר מרווה, לטבול את הרקמה בצינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100 ב PBS עבור דגירה של שעתיים עם רועד ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה לטפל ברקמה עם 10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100 ו 20% DMSO עם רועד ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 0.1%Tween 20, 0.1% טריטון X-100, 0.1% deoxycholate ו 20% DMSO ב PBS עבור דגירה לפחות 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד.

בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמה עם 10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100 ב PBS על שייקר מסלולית ב 100 מהפכות לדקה במשך שעה אחת. ואחריו טבילה ב 15 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 10% DMSO ו 3%BSA ב PBS במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. להכתמת רקמת השומן הלבנה.

העבר את הרקמה ל-300 מיקרוליטרים של 0.2% טריטון X-100, 10%DMSO ו-3%BSA ב-PBS, בתוספת הנוגדנים העיקריים המעניינים בצינור מיקרו 1.5 מיליליטר להגן עליו מפני אור עם רדיד אלומיניום ולמקם את הצינור לתוך צינור פלקון 50 מיליליטר. מניחים את הצינור לתוך שייקר מסלולית עבור דגירה של יומיים ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. בסוף הדגירה שוטפים את הרקמה פעמיים ב-10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 10%DMSO ו-3%BSA ב-PBS למשך חמש שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות והגנה מפני אור.

לאחר השטיפה השנייה לשטוף את הרקמה ב 10 מיליליטר של טריטון X-100 טריטון טרי, 10% DMSO ו 3%BSA ו PBS במשך 16 עד 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות, לאחר מכן להעביר את הרקמה לצינור 1.5 מיליליטר המכיל 300 microliters של 0.2% טריטון X-100, 10%DMSO ו 3%BSA ב PBS, בתוספת נוגדנים משניים המתאימים ולהגן על הצינור מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. לאחר דגירה של יומיים ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר, לשטוף את הרקמה פעמיים ב 10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 10% DMSO ו 3% BSA ב PBS במשך חמש שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד מוגן מפני אור. לאחר הכביסה השנייה, שטפו את הרקמה לצינור המכיל 10 מיליליטר של טריטון X-100 טריטון טרי, 10%DMSO ו-3%BSA ב-PBS למשך 16 עד 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם הגנה מפני רעידות ואור.

ואחריו שטיפה של שעתיים ב 10 מיליליטר של PBS לבד ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד והגנה קלה. עבור ניקוי רקמת שומן לבן בסוף לשטוף PBS לטבול את הרקמה ו 10 מיליליטר של עולה שליחת סדרת ריכוז אתנול עבור דגירה של שעתיים לכל ריכוז בטמפרטורת החדר עם רועד מוגן מפני אור כאמור. למחרת בבוקר לטבול את הרקמה בבקבוק זכוכית 20 מיליליטר עם כובע פלסטיק המכיל חמישה מיליליטר של מתיל סליסילאט במכסה המנוע אדים.

רקמת השומן הלבנה עדיין נראית בבירור בשלב זה. לנער את המיכל להגן עליו מפני אור בטמפרטורת החדר לפחות שעתיים. רקמת השומן הלבנה הופכת להשתלה לחלוטין.

עבור הדמיה קונפוקלית תלת מימדית של רקמת השומן הלבנה המוכתמת והמנוקה, הר תא הדמיה מתכתי המצויד בתחתית זכוכית ותוך מכסה המנוע של האדים מעביר את הרקמה לתא. מלאו את התא במתיל סליסילאט טרי. לסיים את ההרע של התא על ידי הוספת להחליק כיסוי קטן כדי לייצב את הרקמה להחליק כיסוי גדול כדי לסגור את התא.

מניחים את התא על שלב מיקרוסקופ קונפוקל הפוך עבור הדמיית רקמות בהגדלה נמוכה כדי ליצור כמה מפות 3D סנטימטר מעוקב של מדגם רקמת השומן כולו. לאחר יצירת מפה תלת-מימדית, השתמשו ביעד אוויר למרחקים ארוכים פי 20 המספק יחס טוב בין הרזולוציה לעומק כדי לבחור מספר אזורים לדגימת רקמות בהגדלה גבוהה יותר. לפילוח תאים, המירו ערימות תלת-מימדיות לתבנית התוכנה כדי לפנות שטח זיכרון.

לפני פתיחת מודול התא של התוכנה. שנה את הגדרת זיהוי התאים לכתמי קרום פלזמה ובחר את ערוץ הפלואורסצנט של הסמן המשמש לתיחום הפריפריה של התא. לאחר מכן הגדר את ערכי הסף, ספק טווח של גדלי התאים הצפויים והפעל את הפילוח.

ההשפעות של ניקוי על רקמת שומן לבן אדם ועכבר ניתן לראות בעין בלתי. ניקוי גם משפר באופן דרסטי את עומק התמונה של הרקמה כי הוא מסוגל להיות נרכש. ומקל על הדמיה תלת-ממדית של רקמות שלמות ועל יצירת מפה תלת-ממדית מתוך הגדלה של פי 4.

מיפוי תלת-מימדי מאפשר עוד יותר לרכוש את הבחירה של תחומי עניין שונים בהגדלה של פי 20 לעומק של שני מילימטרים. כתמים ספציפיים של טיפות השומנים והאדיפוזיטים ניתן להשיג באמצעות נוגדנים perilipin ו anti-GLUT4 בהתאמה. כלי דם ניתן לזהות באמצעות נוגדן CD31 או הזרקה תוך ורידי של Lectin DyLight 649 זמן קצר לפני ההקרבה.

ניתן לדמיין מקרופאגים ותאי T באמצעות נוגדן פיקוריתרין נגד CD301 ונוגדן כחול בטא פסיפיק נגד TCR. רשת העצבים ההיקפיים ניתן לזהות באמצעות נוגדן אנטי טירוסין Hydroxylase. באמצעות תיוגים אלה ניתן לקבוע את הגודל והגודל הממוצעים של האדיפוזיטים ואת צפיפות רשת כלי הדם בתוך רקמת השומן.

זה חיוני כדי לעקוב אחר זמן הכיבוש כפי שהוכח כי הכנה מדגם לקוי לא יגרום איכות תמונה טובה. פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם מערכת הדמיה מתקדמת או ניתן לשילוב לאחר עיבוד תמונה ניתוח תוכנה חופשית.