הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מספק הוראות מפורטות כיצד להכין ולהזריק עוברי יתושים לעריכת גנום CRISPR-Cas9. היתרונות העיקריים של טכניקת מיקרו-הזרקה זו הם שיש לה שיעור גבוה של הישרדות יתושים, ומאפשרת לחוקרים לקבוע את תפקודו של גן. פרוטוקול זה הותאם במיוחד להזרקת יתושים השייכים לסוג קולקס.

יתושים אלה מעבירים מספר פתוגנים, כולל הנגיפים הגורמים לקדחת מערב הנילוס ודלקת המוח של סנט לואיס, כמו גם נמטודות פילריות, הגורמות לתולעי לב כלביות ולפילים. לכן, כלים כמו עריכת גנום CRISPR-Cas9, יאפשרו לנו להבין טוב יותר ולשלוט בגורמי המחלה החשובים הללו. הזרקת עוברי חרקים טריים, והשגת שיעור הישרדות גבוה יותר דורשים הרבה זמן, תרגול וסבלנות.

לכן אנו ממליצים להזריק למספר עוברים תמיסת מלח צבעונית לפני הזרקת חומרים יקרים ליצירת מוטציה. התחל במילוי חוזר של מחטי ההזרקה בתערובת ההזרקה. בחר מילוי מחט או קצה טעינת ג'ל שישתלב בקלות בקצה האחורי של מחט ההזרקה שנבחרה.

ודא שיש מעט רווח בין קצה מילוי המחט למחט ההזרקה. שאפו בזהירות, טיפה קטנה אחת של תערובת ההזרקה לתוך מחט ההזרקה ליד המקום שבו היא מתחילה להתחדד. לאחר מכן חבר את מחט ההזרקה למזרק המיקרו.

הנח את השקופית המכילה את העוברים על במת המיקרוסקופ. כדי לפתוח את המחט, השתמש בלחץ הזרקה התחלתי של כ-30 Psi והתאם אותו לפי הצורך כדי לספק נפח מתאים של תערובת הזרקה. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מקם את המחט מעל עובר היתוש, והשתמש בזהירות במיקרומניפולטור כדי להוריד את המחט על העובר.

ברגע שהמחט בקושי נוגעת בעובר, הזיזו במהירות את העובר בניצב לציר הארוך של המחט. כדי לקבוע אם המחט נפתחה בהצלחה, לחץ על הדק ההזרקה ובדוק אם בועות או תערובת הזרקה בורחות מהמחט. אם לא, חזור על הזזת עובר היתוש כנגד המחט עד שהיא פתוחה ותערובת ההזרקה בורחת כאשר לוחצים על ההדק.

מקם את עובר היתוש הראשון במרכז הראייה, וודא שהוא בפוקוס והנח את המחט מעל הביצה הראשונה. הגדל בהדרגה את ההגדלה במיקרוסקופ, הורד בזהירות את המחט כדי לשמור אותה ממש מעל העובר הראשון. המשך עד שהמיקרוסקופ יגיע להגדלה הגבוהה ביותר שלו, וגם העובר וגם המחט יהיו בפוקוס.

הזיזו את העובר מעט שמאלה והורידו את המחט כך שיהיה באותו מישור ראייה כמו העובר. השתמש בשלב המיקרוסקופ כדי לגעת בעדינות בעובר בקצה המחט. הקצה האחורי הצר של עובר היתוש צריך לסטות מעט.

בעזרת שלב המיקרוסקופ, הזיזו את הקצה האחורי של העובר על המחט והתבוננו במחט החודרת לכוריון של ביצת היתוש. המחט צריכה פשוט לחדור לקרום ולמיקום המשוער של תאי הקוטב בתוך העובר. הצבת תערובת ההזרקה באזור זה, מגדילה את הסבירות שמוטציות יתרחשו ויעברו בתורשה בקו הנבט.

לחץ על הדק ההזרקה פעם עד שלוש כדי לירות תערובת הזרקה לתוך העובר. העבירו כמות קטנה של תערובת הזרקה, בדיוק מספיק כדי שניתן יהיה לזהות ניקוי קטן בפלזמת העובר. השתמש בבמה כדי להזיז את העובר ימינה, הרחק מקצה המחט.

אם הזריקה עברה כשורה, מעט נוזלים לא אמורים לדלוף מהעובר. הזיזו את הבמה כלפי מטה כך שהעובר הבא ימוקם מול המחט. וחזור על ההזרקה.

אם נראה שתערובת ההזרקה לא יוצאת, או אם כמות גדולה של נוזל בורחת מהעובר לאחר הסרת המחט, החלף את מחט ההזרקה והתחל מחדש. להשמיד ביצים שלא הוזרקו או פגומות. לאחר הזרקת כל העוברים במגלשה, שטפו את שמן ההלו-קרבון על ידי מריחת מי אוסמוזה הפוכה עם בקבוק השפריץ.

כוונו את זרם המים אל החלק העליון של החלקת מכסה הזכוכית מעל העוברים המוזרקים ואפשרו למים לזרום במורד החלקת הכיסוי, והקפידו לא לכוון את הזרם אל העוברים. מכסים את השקופית ב-150 מיקרוליטר מים ומניחים אותה על נייר סינון רטוב בתוך צלחת פטרי מרובעת. דגרו את צלחת הפטרי בתא סביבתי, המוגדר ל-25 עד 27 מעלות צלזיוס ו-70 עד 80% לחות יחסית עם תקופת צילום ארוכה של יום.

פרוטוקול זה שימש להזרקה מוצלחת של עוברים של יתוש הבית הצפוני, Culex pipiens המבטיח שהקצה הקדמי של עובר היתוש משתרע מעבר לרצועת החבישה הרפואית, הגדיל מאוד את הישרדות הזחלים והביא לצאצאים איכותיים המסוגלים להתפתח לבגרות ולהתרבות. ריצוף גילה כי כ-10% מהיתושים שנבדקו הראו החדרה או מחיקה קטנה ליד אתר החיתוך Cas9 של ה-RNA המנחה הראשון, מה שמרמז על כך שתאי הקוטב היו ממוקדים בהצלחה במהלך מיקרו-הזרקות. הפרטים F1 הזדווגו בהצלחה וייצרו צאצאים ברי קיימא, שחלקם הכילו גם את המוטציה.

בעת הזרקת מיקרו עוברי חרקים, רוב האנשים מתקשים לפתוח תחילה את המחט ולהעביר את העובר למחט. זכרו שפיתוח מיומנויות אלה דורש זמן ותרגול. ניתן לשנות או להתאים פרוטוקול זה כדי להזריק עוברים של יתושים אחרים או אפילו מיני חרקים אחרים.

מעבר לשימוש בפרוטוקול זה כדי להפיל גנים עם עריכת גנום ממוקדת של CRISPR-Cas9, ניתן להשתמש באותן טכניקות כדי להזריק פלסמידים או טרנספוזונים כדי לדפוק גנים או ליצור מוטציות אקראיות. המעבדה שלי משתמשת כיום בטכניקה הזו כדי להבין טוב יותר כיצד יתושים מודדים מדי יום ומווסתים את התגובות העונתיות שלהם. עם זאת, כיצד אנו החוקרים משתמשים בעריכת גנום CRISPR-Cas9 כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של כמה אורגניזמים.