Name: הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-10T15:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: למדו הכנה והזרקה של עוברי יתושי Culex pipiens ליצירת מוטציות null באמצעות CRISPR/Cas9. שיטת מיקרו-הזרקה זו מבטיחה שרידות גבוהה של זחלים ומאפשרת ניתוח פונקציית גנים בחקר בקרת נשאי מחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר דוד או'ברוכטה ולכל חברי רשת המחקר לתיאום טכנולוגיות גנטיות של חרקים על העזרה וההכשרה שהם מספקים לנו ולאחרים על הטמעת טכנולוגיות גנטיות. אנו מודים במיוחד לחנה אלוביהאר על אופטימיזציה של פרוטוקול המיקרו-מניב כדי לאפשר להזריק ולבקע עוברי קולקס. אנו מודים גם לדבנטה סימונס ויוסף אורסו, סטודנטים לתואר ראשון העובדים במעבדת מיוטי, על הסיוע בטיפול ובהקרנת יתושים מהונדסים, וזורה אלמקמי מקרן ה-IT על סיוע בגידול והכנת יתושים להזרקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק זרעים בין תחומיים מהמכון למחלות זיהומיות ב- OSU שסופק ל- MEM.

<ol><li>Hamer, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+%28Diptera%3A+Culicidae%29%3A+a+bridge+vector+of+West+Nile+virus+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).</li>
<li>Bailey, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+St.+Louis+encephalitis+virus+from+overwintering+Culex+pipiens+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes.</a> Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).</li>
<li>Sabry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+realistic+index+of+experimental+transmission+efficiency+for+Bancroftian+filariasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis.</a> The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).</li>
<li>Cancrini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+albopictus+and+Culex+pipiens+implicated+as+natural+vectors+of+Dirofilaria+repens+in+central+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy.</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).</li>
<li>Wilton, D. P., Smith, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+diapause+in+three+geographic+strains+of+Culex+pipiens+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).</li>
<li>Mattingly, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Culex+pipiens+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Entomological+Society+of+London%22%5BJournal%5D)">The Culex pipiens complex.</a> Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).</li>
<li>Eldridge, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+and+photoperiod+on+blood-feeding+and+ovarian+development+in+mosquitoes+of+the+Culex+pipiens+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).</li>
<li>Spielman, A., Wong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+ovarian+diapause+in+Culex+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens.</a> Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).</li>
<li>Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+host+preferences+of+above-and+below-ground+Culex+pipiens+mosquitoes+and+their+hybrid+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+and+Veterinary+Entomology%22%5BJournal%5D)">Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring.</a> Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).</li>
<li>Meola, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+temperature+and+humidity+on+embryonic+longevity+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti.</a> Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).</li>
<li>Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+efficient+genomic+editing+system+with+CRISPR%2FCas9+in+the+vector+mosquito+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus.</a> Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).</li>
<li>Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+causality+between+CYP9M10+and+pyrethroid+resistance+using+the+TALEN+and+CRISPR%2FCas9+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies.</a> Scientific Reports. 6, 24652(2016).</li>
<li>Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).</li>
<li>Anderson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+gene+editing+in+the+West+Nile+Virus+vector%2C+Culex+quinquefasciatus+Say%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say.</a> PloS one. 14 (11), (2019).</li>
<li>Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+adaptive+and+heritable+immunity+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).</li>
<li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li>
<li>Monnerat, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+albitarsis+embryogenesis%3A+morphological+identification+of+major+events%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).</li>
<li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+%28Diptera%3A+Culicidae%29+and+the+sheep-fly+Lucilia+sericata+Meigen+%28Diptera%3A+Calliphoridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae).</a> Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).</li>
<li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+CRISPR%2FCas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li>
<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
<li>Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2FCas9+plasmids+for+rapid+and+versatile+genome+editing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+genome+editing+using+RNA-guided+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN%2FCRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li>
<li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766(2014).</li>
</ol>

RH עובד עבור מתקן שינוי חרקים, המספק שירותים בשינוי גנטי חרקים.

פרוטוקול זה מציג שיטות להכניס מוטציות ספציפיות לגנום של יתושי קולקס וניתן להשתמש בו לעריכת הגנום של יתושים אחרים גם כן. הפרוטוקול הוא משמעותי בכך שהוא מספק פרטים ספציפיים לא רק כיצד להכין את חומרי ההזרקה, אלא גם סקירת וידאו מפורטת של איך לגרום יתושים להטיל ביצים, כמו גם איך להכין ולהזריק ביצים אלה. אנו גם מסכמים כיצד לנצל את הביולוגיה של נקבות Cx. pipiens להטיל ביצים ברפסודות בודדות ובכך לסנן שיעור קטן יותר של צאצאים מכל נקבה עבור מוטציות הרצויות. השיטות המוצגות כאן עברו אופטימיזציה עבור Cx. pipiens...

יתושי קולקס מופצים ברחבי האזורים הממוזגים והטרופיים של העולם ומעבירים מספר וירוסים קטלניים כולל וירוס הנילוס המערבי1, דלקת המוח סנט לואיס2, כמו גם נמטודות פילריות הגורמות לתולעת לב כלבים3 ופיליאזיס4. חברי מתחם Culex pipiens, הכולל Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens ו- Cx. pipiens molestus, מראים וריאציות בולטות בהיבטים רבים של הביולוגיה שלהם. לדוגמה, בעוד Cx. quinquefasciatus ו Cx. pipiens molestus אינם מסוגלים להיכנס לתרדמת overwintering5,6, Cx. pipiens pipiens להציג תגובות עונתיות חזקות ולהיכנס diapause בתגובה לימים קצרים7,8. בנוסף, Cx. pipiens molestus נוטים להיות אנתרופופיליים יותר בעוד Cx. pipiens ו Cx. quinquefasciatus הם יותר זופילי6. עם זאת, בארצות הברית ובמקומות רבים אחרים בעולם, מינים אלה שזורים זה בזה, אשר יש השלכות חזקות על העברת מחלות כמו כלאיים של Cx. pipiens pipiens ו Cx. פיפיינס molestus הם מזינים אופורטוניסטיים והם לנשוך הן ציפורים ובני אדם9, ובכך לשמש וקטורים גשר עבור וירוס הנילוס המערבי. לימוד היבטים מרתקים אלה ואחרים של הביולוגיה של יתושי קולקס הופרע, בין היתר, משום יתושי קולקס מעט יותר קשה לגדל במעבדה מאשר יתושי Aedes, המייצרים ביצים עמידות בפניייבוש וייבוש 10 ומכיוון שכלים מולקולריים פונקציונליים אינם מפותחים באותה מידה עבור מינים קולקס. 
עריכת הגנום CRISPR/Cas9 היא טכנולוגיה רבת עוצמה ששימשה להערכת הביולוגיה של מספר מיני יתושים חשובים11,12,13, כולל יתוש הבית הדרומי, קולקס קווינקפסיאטוס14,15,16. טכנולוגיה זו, שפותחה על ידי ג'ניפר דודנה ועמנואל שרפנטייה, מנצלת הגנה חיידקית טבעית מפני וירוסים על ידי אנדונקולאזים הקשורים ל- CRISPR (חלבוני Cas; ראו סקירה של ואן דר אוסט ואח '17). כאשר מוזרקים לעוברים מן החי, חלבוני Cas9 בשילוב עם RNA מדריך מתאים יכולים לייצר הפסקות כפולות בתוך הגנום. זה נעשה לעתים קרובות ביותר באמצעות חלבון Cas9 המורכב עם RNAs מדריך, אשר מכוון פעילות אנדונוקלאז לאזור מסוים של הגנום. לאחר שחלבון Cas9 יצר הפסקה כפולה ספציפית לאתר, המכונות התאיות מנסות לתקן את ההפסקה באמצעות אחד משני מנגנונים. הראשון כרוך קשירת שני הקצוות יחד באמצעות הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), אשר נוטה לשגיאה ולעתים קרובות מייצר כניסות ומחיקות מחוץ למסגרת בגנום שיכול לגרום חלבונים לא פונקציונליים, ובכך ליצור מוטציה נוק-אאוט. לחלופין, המכונות הסלולריות עשויות להשתמש בתיקון מונחה ההומולוגיה (HDR) על-ידי מציאת רצפים דומים כדי לתקן נכון את ההפסקה. רצף דומה עשוי להיות מסופק על ידי הכרומוזום השני בתוך האורגניזם (ראה סקירה18). עם זאת, אם הרצף המתוקן מתאים בדיוק לרצף המקורי, חלבון Cas9 יוכל שוב לחתוך את הדנ"א. לחלופין, החוקרים יכולים לכלול גם פלסמיד תורם המכיל רצפים הומולוגיים משני צדי אתר החיתוך של רצף היעד עם רצף תיקונים חלופי – לעתים קרובות חלבון סמן פלואורסצנטי, גרסה שונה של הגן המקורי או שינוי אחר – שניתן להעתיק ולהכניס לגנום, או "דפק פנימה".
תזמון הוא קריטי בעת הזרקת עוברים, וזה במיוחד המקרה בעת שימוש עריכת הגנום CRISPR /Cas9 כדי ליצור מוטציות בחרקים. הסיבה לכך היא שלחלבון Cas9 ול-gRNAs יש את היכולת הגדולה ביותר ליצור מוטציות רק כאשר העובר נמצא במצבו הסינכיציאלי, לפני שנוצרים ממברנות תאיות וכאשר גרעינים מרובים נגישים בתוך העובר. עבור יתושים, גרעינים להגיע לפריפריה ~ 2-4 שעות לאחר oviposition, בהתאם לטמפרטורה19, ולכן microinjection מוצלח חייב להתרחש לפני הפעם. בנוסף, חלבון Cas9 יחתוך כל DNA גרעיני שהוא יכול לגשת אליו, כך הפרט הנובע ההזרקה יכיל פסיפס של תאים, חלקם בעלי המוטציה הרצויה, ואחרים לא. על מנת שהמוטציות הללו יירשו בהצלחה, חלבון Cas9 חייב לחתוך DNA השוכנים בקו הנבט שיוליד את הביצים והזרע העתידיים. כדי להבטיח כי מוטציות נוצרות בחיידק עדיף להזריק את כל החומרים קרוב למיקום של תאי הקוטב בתוך העובר, שהם אבותיו של חיידק החרקים. תאי הקוטב ממוקמים ליד הקצה האחורי של עוברים Culex 20. בנוסף להזרקת עוברים, חובה לפתח תוכנית זהירה לחצייה וסינון צאצאים על מנת לזהות את המוטציה הרצויה.
פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור gRNAs ולרכב אותם עם חלבון Cas9 להכנת תערובות הזרקה, כמו גם כיצד לגרום יתושים נקבות של פיפיינס Culex להטיל ביצים וכיצד להכין ולהזריק ביצים אלה לעריכת גנום CRISPR / Cas9 בתיווך. בנוסף, אנו מתארים כיצד לגדל, לחצות ולמסך מוזרקים עוברים וצאצאיהם כדי לאשר כי המוטציה הרצויה הושגה. באמצעות פרוטוקול זה, יצרנו מוטציות Null עבור גן של עניין, מחזור, בזן Buckeye של Culex pipiens. זן זה הוקם במקור בשנת 2013 מיתושים שנאספו בשטח בקולומבוס, אוהיו ומתוחזק על ידי מעבדת Meuti. פרוטוקול זה יכול לשמש למחקרים נוספים הדורשים עריכת גנום CRISPR/Cas9 יתושי קולקס, כמו גם מינים אחרים של יתושים, ובאופן כללי יותר, רלוונטי לשימוש בעריכת הגנום CRISPR/Cas9 לכל מיני חרקים.

<table><tbody><tr><td>מזין ממברנה מלאכותית</td><td>Hemotek</td><td>SP5W1-3</td><td>מיקום החברה: בלקבורן, בריטניה</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330019</td><td>מיקום החברה: קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוקפילרי מזכוכית בורוסיליקט, קוטר חיצוני 1 מ"מ</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-6</td><td>מיקום החברה: סרסוטה, פלורידה, ארה"ב</td></tr><tr><td>BV10 מחט Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10-B</td><td>מיקום החברה: נובאטו, קליפורניה, ארה"ב</td></tr><tr><td>נייר סינון מעגלי Whatman (12.5 ס"מ)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA1001125</td><td>מיקום החברה: סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td></tr><tr><td>צינור חרוטי (50 מ"ל)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td>מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב</td></tr><tr><td>נייר סינון קורס פישרברנד עם קצב זרימה מהיר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-800</td><td>מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי (24 x 40 מ"מ)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-311-20</td><td>מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב</td></tr><tr><td>סכר שיניים</td><td>הנרי שיין בע"מ</td><td>1010171</td><td>מיקום החברה: מלוויל, ניו יורק ארה"ב</td></tr><tr><td>סקוטש דו צדדי קלטת תרמו</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC0879005</td><td>מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב</td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021</td><td>מיקום החברההמבורג, גרמניה</td></tr><tr><td>בקבוקון זכוכית (2 dram)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>033401C</td><td>מיקום החברה: וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב</td></tr><tr><td>שמן הלוקרבון</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H8898-50ML</td><td>מיקום: סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td></tr><tr><td>P-2000 חולץ מחט לייזר</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000/G</td><td>מיקום החברה: נובאטו, קליפורניה, ארה"ב</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-998-944</td><td>מיקום החברה: וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב</td></tr><tr><td>PC-100 חולץ מחט משוקלל</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td>זה תואם לדגם ה-PC-10 הקודם, שהופסק. מיקום החברה: אמיטיוויל, ניו יורק, ארה"ב</td></tr><tr><td>ערכת PCR ישירה Phire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F140WH</td><td>מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב</td></tr><tr><td>קודאק פוטו-פלו (1%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-268-05</td><td>מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב</td></tr><tr><td>צינורות מירוקפילריים מזכוכית קוורץ, קוטר חיצוני 1 מ"מ</td><td>אספקת צינורות נימיים מוגבלת</td><td>QGCT 1.0</td><td>מיקום החברה: קורנוול, בריטניה</td></tr><tr><td>מדריך-IT וסחר; ערכת סינון sgRNA</td><td>Takara, Bio USA</td><td>632639</td><td>ערכה זו מאפשרת לך לקבוע אם gRNAs חותכים רצפי DNA במבחנה. מיקום החברה: מאונטיין וויו, קליפורניה, ארה"ב</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td>מיקום החברה: סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td></tr><tr><td>צלחות פטרי קטנות (35X10 מ"מ)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-190-0273</td><td>מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט דם עוף</td><td>Lampire ביולוגי</td><td>7201406</td><td>מיקום החברה: אוורט, פנסילבניה, ארה"ב</td></tr><tr><td>צלחת פטרי בכיכר פישרברנד (10 ס"מ x x 10 ס"מ)</td> חברת <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td>מיקום: וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב</td></tr><tr><td>Tegaderm</td><td>Henry Schein Inc.</td><td></td><td>7771180 מיקום החברה: מלוויל, ניו יורק ארה"ב</td></tr><tr><td>מזון דגים טרופיים</td><td>טטרמין</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון Whatman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-927-826</td><td>מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב</td></tr><tr><td>נייר סינון Whatman, 4.25 ס"מ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1001-042</td><td>מיקום החברה: סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td></tr></tbody></table>

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות null באמצעות crispr /cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

יתושי קולקס הם הווקטורים העיקריים של מספר מחלות המשפיעות לרעה על בריאות האדם ובעלי החיים, כולל וירוס הנילוס המערבי ומחלות הנגרמות על ידי נמטודות פילריות כגון תולעי לב של כלבים ופילהזיס. לאחרונה, עריכת הגנום CRISPR/Cas9 שימשה כדי לגרום למוטציות מכוונות אתר על ידי הזרקת חלבון Cas9 שהיה מורכב עם RNA מדריך (gRNA) לעוברים טריים של כמה מיני חרקים, כולל יתושים השייכים לג'נרה אנופלס ו- Aedes. מניפולציה והזרקת יתושי Culex הוא קצת יותר קשה כמו יתושים אלה להטיל את ביציהם זקוף רפסודות ולא בנפרד כמו מינים אחרים של יתושים. כאן אנו מתארים כיצד לעצב gRNAs, מורכבים אותם עם חלבון Cas9, לגרום יתושים נקבות של Culex pipiens להטיל ביצים, וכיצד להכין ולהזריק עוברים שהונחו לאחרונה עבור microinjection עם Cas9 / gRNA. אנו גם מתארים כיצד לגדל ולמסך יתושים מוזרקים למוטציה הרצויה. התוצאות הייצוגיות מראות כי טכניקה זו יכולה לשמש כדי לגרום מוטציות מכוונות אתר בגנום של יתושי Culex, עם שינויים קלים, ניתן להשתמש כדי ליצור מוטציות null גם במינים אחרים יתושים.

באמצעות הפרוטוקול המתואר, הצלחנו להזריק בהצלחה עוברים של Cx. pipiens, וצפינו בשיעור גבוה של הישרדות בקרב העוברים המוזרקים (~ 55%, איור 1). בניסויים קודמים היה אחוז נמוך יותר של הישרדות, ככל הנראה משום שהקדמת של זקיק הביצה הייתה מחוברת לרצועת ההלבשה הרפואית, מה שמנע מזחלי יתושים לברוח מהמקהלה ולשחות בהצלחה לתוך המים. הבטחת הסוף העורפי משתרע מעבר לרצועת ההלבשה הרפואית, גדלה מאוד בהישרדות הזחל, ומביאה לצאצאים איכותיים המסוגלים להתפתח לבגרות ולהתרבות (איור 2B</stron...

CRISPR/Cas9 משמש יותר ויותר כדי לאפיין את תפקוד הגנים באורגניזמים שאינם מודל. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור שורות נוק-אאוט של Culex pipiens, מהכנת תערובות הזרקה, להשגה והזרקה של עוברים יתושים, כמו גם כיצד לגדל, לחצות, מסך מוזרק יתושים וצאצאיהם עבור מוטציות הרצויות.

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מספק הוראות מפורטות כיצד להכין ולהזריק עוברי יתושים לעריכת גנום CRISPR-Cas9. היתרונות העיקריים של טכניקת מיקרו-הזרקה זו הם שיש לה שיעור גבוה של הישרדות יתושים, ומאפשרת לחוקרים לקבוע את תפקודו של גן. פרוטוקול זה הותאם במיוחד להזרקת יתושים השייכים לסוג קולקס.יתושים אלה מעבירים מספר פתוגנים, כולל הנגיפים הגורמים לקדחת מערב הנילוס ודלקת המוח של סנט לואיס, כמו גם נמטודות פילריות, הגורמות לתולעי לב כלביות ולפילים. לכן, כלים כמו עריכת גנום CRISPR-Cas9, יאפשרו לנו להבין טוב יותר ולשלוט בגורמי המחלה החשובים הללו. הזרקת עוברי חרקים טריים, והשגת שיעור הישרדות גבוה יותר דורשים הרבה זמן, תרגול וסבלנות.לכן אנו ממליצים להזריק למספר עוברים תמיסת מלח צבעונית לפני הזרקת חומרים יקרים ליצירת מוטציה. התחל במילוי חוזר של מחטי ההזרקה בתערובת ההזרקה. בחר מילוי מחט או קצה טעינת ג'ל שישתלב בקלות בקצה האחורי של מחט ההזרקה שנבחרה.ודא שיש מעט רווח בין קצה מילוי המחט למחט ההזרקה. שאפו בזהירות, טיפה קטנה אחת של תערובת ההזרקה לתוך מחט ההזרקה ליד המקום שבו היא מתחילה להתחדד. לאחר מכן חבר את מחט ההזרקה למזרק המיקרו.הנח את השקופית המכילה את העוברים על במת המיקרוסקופ. כדי לפתוח את המחט, השתמש בלחץ הזרקה התחלתי של כ-30 Psi והתאם אותו לפי הצורך כדי לספק נפח מתאים של תערובת הזרקה. תחת מיק

preparing-injecting-embryos-culex-mosquitoes-to-generate-null

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה, אנו מדגימים את העברת מבנה כונן הגן לעובר של יתוש אנופלס גמביה באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה עוברית. הליך זה מאפשר שילוב של מבנה DNA מועבר, באמצעות רקומבינציה הומולוגית, לתוך תאי הנבט כדי ליצור אוכלוסיית יתושים מותמרת.

מיקרו-הזרקה של עובר יתוש: טכניקה להעברת DNA אקסוגני לחלמון עובר של אנופלס גמביה ליצירת מוטציות בקו הנבט

כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

להלן פרוטוקולים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי תירס קדם-תאיים לצורך שינוי הגנום שלהם באמצעות עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 או להוספת אלמנטים מסומנים הניתנים להעברה באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט.

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

מאמר זה מפרט פרוטוקול לזיהוי מהיר של indels המושרה על ידי CRISPR / Cas9 ובחירה של קווים מוטנטיים יתוש Aedes aegypti באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה.

זיהוי איdel בעקבות MUtagenesis CRISPR/Cas9 באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה aedes aegypti יתוש

פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.

קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לעריכת גנום באמצעות מיקרו-הזרקה עוברית ביתוש A. aegypti באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9.

עריכת גנום ביתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti באמצעות CRISPR-Cas9

למדו הכנה והזרקה של עוברי יתושי Culex pipiens ליצירת מוטציות null באמצעות CRISPR/Cas9. שיטת מיקרו-הזרקה זו מבטיחה שרידות גבוהה של זחלים ומאפשרת ניתוח פונקציית גנים בחקר בקרת נשאי מחלות.

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

גלה סרטונים נוספים