Name: שיטת מקטע יבש פשוטה לקבלת מקטע שרב בגודל זרע שלם ויישומיו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למד שיטת מיקטע יבשה פשוטה להכנת מקטעי שרף בגודל זרע שלם מקליפת תירס בשרף LR White. השיטה מאפשרת צביעה ודימות יעילים של תאים, גרגירי עמילן וגופי חלבון לניתוח מורפולוגי מפורט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון סופק על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32071927), פרויקט הכשרונות של אוניברסיטת יאנגז'ואו ופיתוח התוכנית האקדמית העדיפות של מוסדות להשכלה גבוהה ג'יאנגסו.

1. הכנת זרע מוטבע שרף (איור 1)
<ol><li>לתקן שישה גרעינים תירס בוגר ב 10 מ"ל של 2.5% גלוטרלדה פוספט אגירה (0.1 M, pH7.2) ב 4 ° C עבור 48 שעות. החוקרים יכולים לבחור תערובות קיבעון אחרות, ריכוזים קיבעון, ותנאי קיבעון על פי מטרות המחקר שלהם וסוגי רקמות.</li>
	<li>להוציא את הגרעינים ולחתוך אותם לאורך או transversally ל 2-3 מ"מ עובי באמצעות להב חד דו צדדי, ולתקן אותם ב 10 מ"ל של 2.5% גלוטרלדה פוספט אגירהייד (0.1 M, pH 7.2) שוב במשך 48 שעות.</li>
	<li>לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 10 מ"ל של 0.1 M פוספט מאגר (pH 7.2) במשך 30 דקות בכל פעם.</li>
	<li>מייבשים את הדגימות בהגדלת הציונים של תמיסת אתנול (10 מ"ל) מ-30% ל-50%, 70%, 90% פעם אחת ו-100% שלוש פעמים במשך 30 דקות בכל פעם.</li>
	<li>לחדור את הדגימות ב 10 מ"ל הגדלת ציונים של פתרון LR לבן שרפים מדולל עם אתנול מ 25% כדי 50%, 75% פעם אחת, ו 100% פעמיים ב 4 ° C עבור 12 שעות בכל פעם.</li>
	<li>הכינו את הדומיות לדגימות לפני ההטיה. להוסיף 0.25 מ"ל של 100% LR לבן שף לתוך צינור צנטריפוגה 2 מ"ל, ופולימר אותו ב 60 ° C עבור 48 שעות.</li>
	<li>ברציפות להוסיף שרף לבן LR טהור (0.5 מ"ל) ואת הדגימה הסתננה לתוך צינור צנטריפוגה עם ה-Pedestal. מיישרים את הדגימות עם המחט האנטומית, וממירים אותן ב-60 מעלות צלזיוס בתנור למשך 48 שעות.</li>
</ol>2. מקטע יבש להכנת חלק בגודל זרע שלם (איור 1)
<ol><li>להוציא את הגרעינים מוטבעים מצינור הצנטריפוגה ולחתוך את שרף עודף סביב המדגם באמצעות להב חד.</li>
	<li>מהדק את בלוק הברסין במחזיק המדגם של אולטרה מיקרוטומי (EM UC7), ולקצץ את את השנין המיותר על פני השטח של המדגם וסביב הדגימה עם להב.</li>
	<li>ללטש את פני השטח של המדגם דק עם סכין זכוכית עד שניתן יהיה לגבש קטע שלם.</li>
	<li>לשים וו נחושת קטן על 2 מ"מ מעל קצה הלהב לפני חיתוך ולחתוך את הדגימה לתוך סעיף 2 μm. התפקיד של הוו הוא למנוע את התלתל כלפי מעלה של המקטע.</li>
	<li>שים את הוו מתחת למקטע כדי לתמוך בו כאשר המקטע הופך ארוך.</li>
	<li>מוסיפים 100 μL של מים על מגלשה לא מטופלת, ומעבירים בזהירות את החלק המלא והבלתי שבור למים עם הפינצטה.</li>
	<li>על מנת להחליק את החלק המקומט, מחממים ויבשים את הדגימה על שולחן השיטח ב-50 מעלות צלזיוס למשך הלילה.<ol>
<li>אם המקטע מתפורר או דמעות, להאריך את הזמן עבור כל חדירה של שריון של המדגם מ 12 שעות כדי 24 שעות או 48 שעות.</li>
		<li>אם בחלק יש כמה קווים מקבילים לסכין, מהדק את בלוק הדגימה בחוזקה. אם בחלק יש כמה קווים אנכיים לסכין, אנא השתמש בסכין חדשה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכתמה והתבוננות בסעיף
הערה: על מנת לבחון את מבנה הרקמות ומורפולוגיה של תאים, גרגרי עילן, וגופים חלבון, להכתים את החלקים עם כתמים ספציפיים על פי מטרת המחקר. כאן, אנו משתמשים במבהיר פלורסנט 28, תמיסת יוד, ו- R250 כחול מבריק Coomassie כדי להכתים את קירות התא, גרגרי עילן, וגופים חלבון, בהתאמה.
<ol><li>להתבוננות מורפולוגיה של תאים, להכתים את המקטע עם 40 מ"ל של 0.1% (w / v) מבהיר פלורסנט 28 פתרון מים בצנצנת כתמים זכוכית קומפקטית 70 מ"ל ב 45 ° C במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותו עם מים זורמים במשך 5 דקות. צפה וצלם את החלק תחת מיקרוסקופ פלואורסציטי מצויד במצלמת CCD.</li>
	<li>להתבוננות מורפולוגיה של גרגרי עען, להכתים את המקטע עם 40 μL של תמיסת יוד (0.07% (w /v) I2 ו 0.14% (w / v) KI ב 25% (v /v) גליקרול עבור 1 דקות, ולכסות את המדגם המכיל פתרון יוד עם כיסוי. הצג וצלם את הדגימה תחת מיקרוסקופ אור המצויד במצלמת CCD.</li>
	<li>להתבוננות מורפולוגיה של גופים חלבון, לטבול את המקטע עם 40 מ"ל של 10% (v /v) חומצה אצטית בצנצנת ויטראז' קומפקטית 70 מ"ל במשך 10 דקות ב 45 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להכתים אותו ב 40 מ"ל של 1% (w / v) Coomassie כחול מבריק R250 ב 25% (v / v) isopropanol ו 10% (v / v) חומצה אצטית במשך 15 דקות ב 45 ° C. שוטפים את החלקים המוכתמים במים זורמים במשך 5 דקות, וייבאשו. צפה וצלם את החלק תחת מיקרוסקופ אור מצויד במצלמת CCD.</li>
</ol>4. ניתוח כמותי של פרמטרים מורפולוגיים
<ol><li>תהליך וכמותי לנתח את התמונות המצולם עבור אזור, ציר ארוך / קצר, מעוגל של תאים, גרגרי מעילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע באמצעות תוכנת ניתוח מורפולוגיה (Image-Pro פלוס 6.0 תוכנה) בעקבות ההליכים של Zhao etal.</li>
</ol>

<ol><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+structure+and+spatial+distribution+in+endosperm+of+high-amylose+rice+starch+granules+with+different+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+defective+effect+of+starch+branching+enzyme+IIb+from+weak+to+strong+induces+the+formation+of+biphasic+starch+granules+in+amylose-extender+maize+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm.</a> Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradually+decreasing+starch+branching+enzyme+expression+is+responsible+for+the+formation+of+heterogeneous+starch+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules.</a> Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dek35+encodes+a+PPR+protein+that+affects+cis-splicing+of+mitochondrial+nad4+intron+1+and+seed+development+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize.</a> Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).</li>
<li>Hu, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+structure+characteristics+to+form+ultrahigh+oil+content+in+rapeseed%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed.</a> PLoS One. 8 (4), 62099(2013).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+VKS1+regulates+mitosis+and+cytokinesis+during+early+endosperm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development.</a> Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).</li>
<li>Xu, A., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+comparison+and+applications+of+different+sections+in+investigating+the+microstructure+and+histochemistry+of+cereal+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels.</a> Plant Methods. 16, 8(2020).</li>
<li>Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+whole+sections+of+mature+cereal+seeds+to+visualize+the+morphology+of+endosperm+cell+and+starch+and+the+distribution+of+storage+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein.</a> Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).</li>
<li>Zhao, L., Cai, C., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+processing+method+for+investigating+the+morphology+of+cereal+endosperm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells.</a> Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).</li>
<li>Borisjuk, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+architecture+shapes+embryo+metabolism+in+oilseed+rape%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).</li>
<li>Lott, J. N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+bodies+in+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Nordic+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Protein bodies in seeds.</a> Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).</li>
<li>Jing, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+endosperm+cells+and+starch+granules+in+common+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Development of endosperm cells and starch granules in common wheat.</a> Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

הזרעים הם המשאב המתחדש החשוב ביותר למזון, מספוא וחומר גלם תעשייתי, והם עשירים בחומרי אחסון כגון תעילן וחלבון. המורפולוגיה והכמות של תאים והתוכן והתצורה של חומרי אחסון משפיעים על המשקל והאיכות שלזרעים 7,12. למרות טכנולוגיית סטריאוטיפ וניתוח תמונה יכול למדוד את הגודל והכמות של תאים באזור רקמות, הם חסרים במעבדות רבות. מקטעי הפרפין והברף מעניקים תמונה דו-ממדית (דו-ממדית), המובילה בשום אופן בניתוח הגודל והכמות האמיתיים של התאים. עם זאת, התאים נחתכים באופן אקראי בכל המ...

זרעי צמחים מכילים חומרי אחסון כגון עילן וחלבון ומספקים אנרגיה ותזונה לאנשים. הצורה, הגודל והכמות של תא וחומרי אחסון קובעים את המשקל והאיכות של הזרע. התאים וחומרי האחסון באזורים שונים של זרעים יש מורפולוגיות שונות באופן משמעותי, במיוחד עבור כמה גידולי דגנים עמילוס גבוה עם עיכוב של עמילן הסתעפות אנזים IIb1,2,3. לכן, חשוב מאוד לחקור את המורחולוגיות של תאים וחומרי אחסון באזורים שונים של זרעים.
פרפין קטע היא שיטה טובה כדי להכין את כל הזרע בגודל סעיף יכול להציג את מבנה הרקמה של הזרע ואת הצטברות של חומר אחסון באזורים שונים של זרע4,5,6. עם זאת, סעיפים פרפין בדרך כלל יש 6-8 μm עובי עם רזולוציה נמוכה; לכן, קשה מאוד להתבונן בבירור ולנתח באופן כמותי את המורפולוגיה של תא וחומרי אחסון. מקטעים שרין בדרך כלל יש 1-2 μm עובי ברזולוציה גבוהה והם מתאימים מאוד להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של תא וחומריאחסון 7. עם זאת, שיטת ניתוח שרין שגרתית מתקשה להכין את המקטע בגודל זרע כולו, במיוחד עבור זרעים עם נפח גדול ותוכן איתן גבוה; לפיכך, אין דרך להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון באזורים שונים של הזרע. שרף לבן LR הוא שרף אקרילי ומציג צמיגות נמוכה וחחללות חזקה, המוביל יישומים טובים שלה בהכנת סעיף שרף של זרעים, במיוחד עבור גרעינים בוגרים דגנים עם נפח גדול ותוכן איתילן גבוה. בנוסף, המדגם מוטבע LR לבן שסוף ניתן להכתים בקלות עם צבעים כימיים רבים כדי להציג בבירור את המורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון תחת אור או מיקרוסקופפלורסנט 7. בעיתון הקודם שלנו, דיווחנו על שיטת מקטע יבש להכנת חלקים בגודל זרע של גרעיני דגנים בוגרים מוטבע שרף לבן LR. השיטה יכולה גם להכין את החלק בגודל זרע של פיתוח, נביטה ומבושלת גרעין דגנים8. הסעיף שהתקבל בגודל זרע כולו יש יישומים רבים תצפית מיקרומורפולוגיה וניתוח, במיוחד עבור צפייה ברורה וניתוח כמותי של הבדלי מורפולוגיה של תא וחומרי אחסון באזורים שונים שלזרע 8,9.
טכניקה זו מתאימה לחוקרים שרוצים לבחון את מבנה המיקרו של רקמות ואת הצורה והגודל של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע באמצעות מיקרוסקופ אור. ניתן לנתח את התמונות של חלקים בגודל זרעים שלמים המוכתמים במיוחד עבור תאים מוצגים, גרגרי איתילן וגופים חלבון על ידי תוכנת ניתוח מורפולוגיה כדי למדוד באופן כמותי את הפרמטרים המורפולוגיה של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע. על מנת להדגים את הישימות הטכנית ויישומי סעיף בגודל זרעים שלמים, חקרנו את הזרעים הבוגרים של תירס ואונס זרעי שמן ואת הגרעינים המתפתחים, נבט, ומבושל של אורז במחקר זה. הפרוטוקול מכיל ארבעה תהליכים. כאן, אנו משתמשים בליבת תירס בוגרת, שהיא הקשה ביותר בהכנת המקטעים בגודל כל הזרע בשל נפח גדול ותוכן מעילן גבוה, כדגימה כדי להציג את התהליכים צעד אחר צעד.

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>A501931</tr><tr><td>צנצנת כתמים מזכוכית קומפקטית (5 מקומות)</td> <td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>E678013</tr><tr><td>Coomassie כחול מבריק R-250</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>A100472</tr><tr><td>Coverslip</td><td>Sangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>F518211</tr><tr><td>להב דו צדדי</td><td>ג'ילט שנחאי ושות', בע"מ</td><td>74-S</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A500737 שולחן שיטוח</td><td>Leica</td><td>HI1220</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>אולימפוס</td><td>BX60</td><td></td></tr><tr><td>מבהיר פלואורסצנטי 28</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>910090</td><td></td></tr><tr><td>רצועות זכוכית</td><td>Leica</td><td>840031</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 50% תמיסה במים</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>A600875</tr><tr><td>גליצרול</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>A600232</tr><tr><td>יוד</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>A500538</tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A507048 מיקרוסקופ אור</td><td>אולימפוס</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>LR שרף לבן</td><td>אגר מדעי</td><td>AGR1281A</td><td></td></tr><tr><td>תנור</td><td>שנחאי ג'ינג הונג מעבדה מכשיר ושות', בע"מ</td><td>9023A</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן יודיד</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>A100512</tr><tr><td>שקופית</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>F518101</tr><tr><td>פינצטה</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>F519022</tr><tr><td>נתרן פוספט דודקהידראט</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>A607793</tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בייסי דיהידראט</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>A502805</tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת מקטע יבש פשוטה לקבלת מקטע שרב בגודל זרע שלם ויישומיו

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

מורפולוגיה, גודל וכמות של תאים, גרגרי ענבן וגופים חלבון בזרע לקבוע את המשקל ואיכות הזרע. הם שונים באופן משמעותי בין אזורים שונים של זרעים. על מנת להציג את המורפולוגיות של תאים, גרגרי איתילן וגופים חלבון בבירור, וכמותית לנתח את הפרמטרים המורפולוגיה שלהם במדויק, המקטע בגודל כל הזרעים נדרש. למרות כל הזרע בגודל פרפין סעיף יכול לחקור את ההצטברות של חומרי אחסון בזרעים, קשה מאוד לנתח כמותית את הפרמטרים מורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון בשל הרזולוציה הנמוכה של הסעיף העבה. סעיף שרף דק יש ברזולוציה גבוהה, אבל שיטת מקטע שרף שגרתי אינו מתאים להכין את החלק בגודל הזרע כולו של זרעים בוגרים עם נפח גדול ותוכן עעמלן גבוה. במחקר זה, אנו מציגים שיטת מקטע יבש פשוטה להכנת סעיף שבין בגודל זרע כולו. הטכניקה יכולה להכין את הצלב ואת האורך בגודל זרעים של פיתוח, בוגר, נבט, וזרעים מבושלים מוטבע שרף לבן LR, אפילו עבור זרעים גדולים עם תוכן עעמלן גבוה. החלק בגודל זרע כולו יכול להיות מוכתם עם מבהיר פלורסנט 28, יוד, ו Coomassie כחול מבריק R250 כדי להציג באופן ספציפי את המורפולוגיה של תאים, גרגרי עילן, וגופים חלבון בבירור, בהתאמה. ניתן לנתח את התמונה שהושגה גם באופן כמותי כדי להראות את הפרמטרים המורפולוגיה של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע.

שיטת מקטע יבש פשוטה להשגת מקטע בגודל זרע שלם אנו מקימים שיטת מקטע יבש פשוט להכנת קטע בגודל זרע שלם של זרע מוטבע LR-לבן שף(איור 1). השיטה יכולה להכין מקטעים טרנסוורסאליים ואורך בגודל זרע שלם בעובי של 2 μm(איור 2-5, דמות משלימה 1-4). לדוגמה, הזרע הבוגר של אונס זרעי שמן ניתן לתדרך ולאורך(איור 2). עבור גידולי דגנים, הגרעינים הבוגרים שלהם מלאים גרגרי איתן, מה שמוביל לכך ש...

טכניקה זו מאפשרת הכנה מהירה ופשוטה של סעיף שרין בגודל זרע כולו לתצפית וניתוח של תאים, גרגרי ענבן, וגופים חלבון באזורים שונים של הזרע.

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

מדע המורפולוגיה ואיכות התאים, גרגירי עמילן וגופי החלבון בגרעין קובעים את המשקל ואת איכות הזרעים. במחקר זה, אנו מציגים כאוכלוסייה פשוטה של גרעין שלם מוטבע שרף לבן LR ולהקים שיטת יניקה יבשה פשוטה של גרעינים שלמים. אנו בוחרים שרף לבן LR כמדיום מוטבע משתי סיבות עיקריות.ראשית, זוהי צמיגות נמוכה וחזינות חזקה, מה שמוביל ליישומים הטובים שלה בהכנת קטעים חזקים אלה של זרעים, במיוחד עבור גרעינים בוגרים דגנים עם נפח גדול ותכלית עמילן גבוהה. שנית, המדגם מוטבע שרף לבן LR יכול להיות מוכתם בקלות עם צבעים כימיים רבים כדי להציג בבירור את המורפולוגיה של דגימות תחת אור עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. החלקים המוכנים יכולים להיות מוכתמים במיוחד כדי להציג את התאים, גרגירי עמילן, וגופי חלבון בבירור בהופעה של גרעין שלם, ואת הפרמטרים מורפולוגיה ניתן גם לנתח כמותית.השיטה מכילה מחקרים. כאן, אנו משתמשים גרעיני תירס בוגרים עם נפח גדול יותר ותוכן עמילן גבוה כדגימה כדי להציג את התהליכים צעד אחר צעד. כדי להתחיל, קליפים גרעינים לתוך בקבוק פשוט.הוסיפו כ-10 מילימטרים של גלוטראלדהיד עם אגירה של 2.5%. עוד pH אחד 7.2 ולמקום אותו ב 4 מעלות צלסיגרד במשך 48 שעות כדי לתקן את שניהם. ואז להוציא את הגרעינים האלה לחתוך אותם אורך או רוחבי, עם עובי של שניים עד שלושה מילימטרים.אתה צריך להב חד דו-צדדי. ולתקן אותם לעוד 48 שעות. לאחר מכן, לשטוף את הדגימות שלך שלוש פעמים עם כ 10 מילימטרים, כך 0.1 M פוספט חיץ, pH 7.2 במשך 30 דקות בכל פעם.כדי לחות את הדגימות צעד אחר צעד, להשרות אותם על 10 מילימטרים של 30%אתנול פתרון מים במשך 30 דקות הראשון, ברציפות להשרות אותם 10 מילימטרים, כך 50%70%90% פעם אחת, ו 100%שלוש פעמים. כדי לחדור מדגם צעד אחר צעד, ברציפות לאחזר אותם עם 10 מילימטרים של פתרון שרף לבן LR מדולל עם אתנול של 25%50%75%פעם אחת, ו 100%פעמיים בארבע מעלות צל"ש במשך 12 שעות בכל פעם. לפני ההטבעה, אנחנו צריכים להכין את הדוכן לדגימות.הוסף 250 microliters של שרף לבן LR טהור לתוך צינור צנטריפוגה שני מילימטרים ולהפוך אותו בשש מעלות צלחים במשך 48 שעות. לאחר מכן, להוסיף ברציפות 500 microliters של שרף LR לבן טהור לחדור את המדגם לתוך צינור צנטריפוגה עם הכן. לאחר יישר את הדגימות עם מחט אנטומית, לשים את הרף בשש מעלות צלסיגרד בתנור במשך 48 שעות.מוציאים את הגרעינים המוטבעים מצינור הצנטריפוגה וחותכים שרף עודף סביב דגימה באמצעות להב חד. מניחים את בלוק שרף במחזיק מדגם של מיקרוטון לקצץ את שרף מיותר על פני השטח של המדגם סביב המדגם עם הלהב. עוד ללטש את פני השטח של המדגם סוף סוף עם סכין זכוכית עד קטע שלם יכול להיווצר.עכשיו הגיע הזמן להכין את החלק המדהים הזה עם עובי של שני מיקרון. לפני חיתוך, לשים נחושת קטנה דיבר על שני מילימטרים מעל קצה הלהב כדי למנוע קטע קרלינג. ככל שהסעיף מתארך, שים את הדובר תחת הסעיף כדי לתמוך בו.לאחר מכן, מוסיפים את 100 המיקרוליטרים של המים על המגלשה הלא מוכחת ומעבירים בזהירות את החלק המלא והבלתי שבור למים עם המטפלים. מחממים ומייבשים אותם ב-50 מעלות צלסיאדה כדי להחליק את החלק המקומט. לבסוף, שני טיפים חשובים זקוקים לתשומת לב.ראשית, אם החלק מתפורר או דמעות, להאריך את הזמן עבור כל חדירת השרף של המדגם. שנית, אם הקטע יש כמה קווים מקבילים לסכין, להדק את בלוק המדגם בחוזקה. אם בסעיף יש כמה קווים אנכיים לסכין, אנא השתמש בסכין חדשה.כדי לבחון את המורפולוגיה של תאים, גרגירי עמילן וגופי חלבון, אנו יכולים להכתים את החלקים עם מבהיר פלואורסצנטי 28, תמיסת יוד, ו- R250 כחול מבריק קומאסי בהתאמה. עבור כתמים ספציפיים אחרים, לבסס אותו על מחקר ההצעה. כאן אנו משתמשים בתווית יוד כדי להכתים גרגירי עמילן כדוגמה.הוסף 40 מיקרוליטרים של פתרון יוד כדי לטבול את החלק. ותשמור את זה בצנצנת לדקה אחת. ואז לכסות את הדגימה עם שרוול כיסוי.ולנתק את פתרון הסוכן העודף סביבו. צפו וצילמו את הדגימה מיד תחת מיקרוסקופ מדליק המצויד במצלמת טלוויזיה במעגל סגור. אנו יכולים לעבד ולנתח כמותית את התמונות המצולמות עבור שטח, גישה ארוכה או קצרה, ועגולות של תאים, גרגירי עמילן וגופי חלבון באזורים שונים עבור ליבה באמצעות תוכנת ניתוח מורפולוגיה.אנו קובעים שיטת ניתוח יבשה פשוטה לשמירה על מקטעים שלמים בגודל ליבה שרף LR לבן. השיטה יכולה להכין חלקים רוחביים ואורך של הקרנל כולו עם שני מיקרון. או דוגמאות, הזרע הבוגר כולו של אונס זרעי שמן יכול להיות חתוך רוחבי ואורך.ניתן להכין בהצלחה גם את החלקים של גרעין שלם ובוגר של תירס עם נפח גדול יותר. בנוסף, את הקרנל המתפתח, הקרנל מבושל, ואת הקרנל נבט ניתן גם לחקור באמצעות השיטה. הסעיפים המוכנים של גרעינים שלמים כוללים את היישומים הבאים.ראשית, החלקים של הקרנל כולו ניתן להשתמש כדי לבחון את מבנה הרקמה של זרעים. לדוגמה, החלקים של עובר שלם של אונס זרעי שמן מוכתמים ספרנין יכול בבירור להציג את זה רדיקלי, היפר מזדמנים, פנימיים וחצוניים החלקים של הקרנל כולו ניתן להשתמש כדי להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של תאים. לדוגמה, החלקים רוחביים של עובר שלם של אונס שמן מוכתמים בבהירות פלואורסצנטי 28, ושמני התא מוכתמים במיוחד.המיקרו-מורפולוגיה של תאים בכל אזור של עובר שלם יכולה להיות מוצגת בהגדלה גבוהה. הפרמטרים המורפולוגיים של תאים פרנצ'ימליים, ניתן לנתח כמותית באמצעות תוכנת ניתוח מורפולוגיה ולהראות כמה הבדלים באזורים מגוונים של העובר. החלקים הרוחביים של גרעין שלם של תירס מוכתם בבהירות פלואורסצנטית 28 יכולים גם להציג כמורפולוגיה של תאים, ופרמטרים מורפולוגיה של תאים שונים באזורים מגוונים של אנדוספרם.קטעים של גרעין שלם יכולים להיות מוכתמים בתווית יוד כדי להציג את המורפולוגיה של גרגירי עמילן, למשל, הקטעים רוחביים ואת החלקים האורך של גרעיני תירס מוכתמים ביוד יכול להפגין מורפולוגיה של גרגרי עמילן בבירור. גרגירי עמילן באזורים מגוונים מראה מורפולוגיה שונה באופן משמעותי, גודל, וכמות בתאי אנדוספרם. אז ניתוח כמותי של פרמטרים מורפולוגיים של גרגירי עמילן מראה כי הם שונים באופן משמעותי באזורים מגוונים עבור אנדוספרם.ניתן להשתמש בחלקים כדי להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של גופי החלבון. לדוגמה, חלבון עמילן מוכתם בכחול באמצעות R250 כחול מבריק קומאסי. ההתפלגות המרחבית של חלבון עמילן בכל העובר של אונס שמן ניתן לראות בהגדלה נמוכה, ואת מבנה מיקרו ניתן להציג בבירור בהגדלה גבוהה.בנוסף, ניתן לנתח כמותית את מדד השגיאות ואת הפרמטרים המורפולוגיים של גופי החלבון באזורים שנבחרו. טכניקה זו מספקת את ההכנה הראשונה והפשוטה של חלקי השרף של גרעינים שלמים מזרעים מתפתחים ובוגרים. היישומים החלקיים במבנה הרקמות של הקרנל כולו ולאחר מכן חוקרים את המורפולוגיה של תאים, גרגירי עמילן וגופי החלבון באזורים שונים של גרעין שלם.ניתן לנתח את התמונות הנרכשות באופן כמותי כדי להראות את הפרמטרים המורפולוגיים של תאים, גרגירי עמילן וגופי חלבון ולהשוות אותם עוד יותר באזורים שונים של גרעין שלם.

a-simple-dry-sectioning-method-for-obtaining-whole-seed-sized-resin

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד מוטבע שרף רקמת המוח יכול להיות מוכן צילמו בשלושת המימדים אלומת יונים ממוקדת, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד לדגום דגימות עץ להערכה כוללת של מבני הגידול שלהן. מתוארות טכניקות הכנה והדמיה מאקרו ומיקרוסקופיות הנחוצות ליצירת מערך נתונים אנטומי ודנדרואקולוגי של עץ משוכפל היטב וברזולוציה גבוהה.

פרספקטיבה טכנית במחקר העץ-טבעת מודרנית - כיצד להתגבר על Dendroecological ואתגרי אנטומי עץ

תאית גבישית היא מרכיב חשוב בדופן התא של הצמח. עם זאת, הכימות שלו ברזולוציה סלולרית הוא מאתגר מבחינה טכנית.  כאן, אנו מדווחים על שימוש בטכנולוגיית אור מקוטב וחתכי שורש כדי לקבל מידע על הרכב דופן התא ברזולוציה מרחבית-זמנית.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

פרוטוקול זה מתאר שיטת חיתוך רקמות פשוטה של חיתוך היברידי שימושית עבור רקמות צמחים סרבניות. קטעי רקמה באיכות טובה מאפשרים מחקרים אנטומיים ומחקרים ביולוגיים אחרים כולל הכלאה באתרה (ISH).

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

כאן, אנו מספקים קלה, בעלות נמוכה, וזמן חסכוני פרוטוקול לתקן כימי רקמת מוח הפרימטים עם מקבע אקרולאין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואמת טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה עבור במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

מחקר זה מציג אמין וקל נהלי קבלת טורי ודק במיוחד חלקים מיקרואורגניזם ללא ציוד יקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשפר את חלוקתה פרפין. שיטה זו משלבת חיתוך צף באמצעות תא תרמוסטטי פשוטות כדי למנוע את תהליך ההעברה הנדרש על-ידי השיטה המקובלת. כתוצאה מכך, את היעילות ואת מספר קטעים שלמים פרפין היו השתפרה מאוד.

חיתוך ושיטת צף בשביל לרקמות פרפין-מוטבע על חלוקתה

פרוטוקול זה מאפשר הכנת קטעים רוחביים של זרעי דגנים (למשל, אורז) לניתוח של מורפולוגיה של אנדוספרם וגרגר עמילן באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת.

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

פרוטוקול זה נועד לספק נהלים מפורטים לאיסוף, תיקון ותחזוקה של דגימות צמחים מיקוהטרוטרופיים, תוך יישום טכניקות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת והולכה, מיקרוסקופיית אור, קונפוקלית ופלואורסצנטית כדי לחקור התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים ובזרעים שנבטו בפטריות מיקוריזאליות.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

הערכת ההבדלים האנטומיים בין חתכי העלים C3 ו- C4 מסייעת להבין את יעילות הפוטוסינתזה. מאמר זה מתאר הכנה ובדיקה של חתכי עלים חופשיים ודקים למחצה, יחד עם האזהרות בהכנה למיני היבול Triticum aestivum ו-Zea mays.

הערכת תכונות מבניות ב- Triticum aestivum ו - Zea mays עבור התמיינות פוטוסינתטית C3 ו- C4 באמצעות חתכים חופשיים ודקים למחצה

למד שיטת מיקטע יבשה פשוטה להכנת מקטעי שרף בגודל זרע שלם מקליפת תירס בשרף LR White. השיטה מאפשרת צביעה ודימות יעילים של תאים, גרגירי עמילן וגופי חלבון לניתוח מורפולוגי מפורט.

שיטת מקטע יבש פשוטה לקבלת מקטע שרב בגודל זרע שלם ויישומיו

גלה סרטונים נוספים