הנדסת גנום של תאי B אנושיים ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחסל במדויק גן בתאי B כדי לחקור את השפעות אובדן התפקוד של אותו גן או להכניס גן טרנס לביטוי גן טרנס יציב שיכול לשמש למטרות מחקר או טיפול. היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שהיא מספקת פלטפורמה אוניברסלית המאפשרת להנדס בקלות ובדייקנות תאי B ביעילות גבוהה. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להנדס תאי B לבטא נוגדנים או אנזימים רקומביננטיים ולאחר מכן להעביר את תאי B אלה לטיפול בזיהומים או באנזימופתיה.

כדי להתחיל, יש להפשיר תאי B באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. בזמן ההמתנה, העבירו שני מיליליטר של FBS מחומם מראש לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. לאחר שתאי B מופשרים לחלוטין, הוסף מיד מיליליטר אחד של FBS מחומם מראש, מבחינת טיפה, לדגימה.

דוגרים בטמפרטורת החדר למשך דקה. פיפטה בעדינות כדי להשהות מחדש את הדגימה ולהעביר את כל הנפח, מבחינת טיפה, לתוך צינור חרוטי המכיל שני מיליליטר FBS מחומם מראש. הביאו את הנפח ל -15 מיליליטר עם PBS סטרילי, ואז כסו את הצינור והפכו אותו בעדינות פעמיים-שלוש.

צנטריפוגה את הדגימה ב-400 פעמים G למשך חמש דקות, ואז השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. השעו מחדש את הגלולה עם מיליליטר אחד של מדיום התפשטות תאי B מאוזן מראש וספרו את התאים. מספר התאים הכולל צריך להיות בערך 10 עד התאים השביעיים.

העבירו את התאים לבקבוק המכיל 20 מיליליטר של מדיום התפשטות תאי B מאוזן מראש. הריכוז הסופי של התאים, צריך להיות בערך פי חמישה פי 10 עד התאים החמישיים למיליליטר. דגרו את הבקבוק אנכית בחממת תרבית רקמות.

הכן את מצע הטרנספקציה CRISPR/Cas9 על ידי ערבוב מיקרוגרם אחד של sgRNA מהונדס כימית עם 1.5 מיקרוגרם של mRNA גרעין Cas9 מהונדס כימית לכל תגובת טרנספקציה. לשליטה, הוסף מיקרוליטר אחד של מאגר TE, במקום sgRNA, לתוך צינור של 0.2 מיליליטר של רצועת שמונה צינורות. הפעל אלקטרופורטור והכן את ריאגנטים לזיהום גרעיני.

לספור ולהעביר מיליון תאי B לכל תגובת טרנספקציה, לתוך צינור חרוטי סטרילי. הביאו את הנפח ל -15 מיליליטר עם PBS סטרילי וצנטריפוגה ב -400 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים עם 10 מיליליטר PBS סטרילי וצנטריפוגה ב-400 פעמים G למשך חמש דקות, ואז השליכו את הסופרנטנט לחלוטין מבלי להפריע לכדור התא. הוסף 0.5 מיקרוגרם של mRNA GFP מהונדס כימית לכל מיליון תאי B לגלולת התא. השעו מחדש את הגלולה עם 20 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה ראשוני של תאים לכל מיליון תאי B וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג חמש עד שש פעמים.

העבירו 20.5 מיקרוליטר לכל תגובת טרנספקציה לצינורות של 0.2 מיליליטר המכילים מגיב CRISPR/Cas9. פיפטה למעלה ולמטה פעם אחת כדי לערבב ולהעביר את כל הנפח לקובט טרנספקציה. יש לכסות את הקובטה ולטפוח עליה בעדינות כדי לוודא שהנוזל מכסה את תחתית הקובטה.

השתמש בפרוטוקול תאי B ראשוני אנושי באלקטרופורטור לצורך טרנספקציה. הניחו את התאים החשמליים בקובט בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן העבירו 80 מיקרוליטר של מדיום ההתפשטות של תאי B המאוזנים מראש לתגובת הטרנספקציה בקובט.

מניחים את הקובט בחממת תרבית הרקמות למשך 30 דקות. צינור בעדינות את ראש הצינור כמה פעמים כדי לערבב ולהעביר את כל נפח הדגימה מהקובטה לבאר מתאימה של צלחת תרבית רקמות בת 48 בארות המכילה מיליליטר אחד של מדיום התפשטות תאי B. הריכוז הסופי של התאים צריך להיות מיליון תאים למיליליטר.

ביצוע ניסוי דפיקת גנים, העבר וקטור ויראלי מסוג שש הקשור לאדנו רקומביננטי בריבוי של 500,000 זיהום לבאר המתאימה המכילה תאים אלקטרופורטיים. מניחים את הצלחת בחממת תרבית רקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עם לחות. בניסוי הנוק-אאוט, ספירת תאי B הראתה יותר מ-80% תאים ברי קיימא עם ירידה קלה בהתאוששות התאים הן בדגימות הביקורת והן בדגימות הנוקאאוט CD19 24 שעות לאחר האלקטרופורציה.

תאי B נאספו ביום החמישי לאחר הטרנספקציה לצורך זרימה ציטומטרית וניתוח גאות. תרשימי פיזור מייצגים של דגימות הבקרה והנוקאאוט הראו 14 ו-95% תאים שליליים CD19 בהתאמה, מה שמדגים ירידה משמעותית בביטוי CD19 בדגימות הנוק-אאוט. כרומטוגרמות של ריצוף גנומי הראו שיאים כפולים בתאי ה-CD19 נוק-אאוט, מה שמצביע על החדרה או מחיקה של נוקלאוטידים לאחר הפסקות דו-גדיליות בתיווך CRISPR/Cas9.

ניתוח אינדל של הכרומטוגרפים של דגימות הנוקאאוט הראה אחוז גבוה של היווצרות אינדל בלוקוס CD19, מה שעולה בקנה אחד עם אחוז אובדן חלבון CD19 שזוהה על ידי ציטומטריית זרימה. תאי B מניסוי הדפיקה נאספו ביום ה-12, לאחר ההנדסה. תרשימי פיזור הראו 64% מהתאים החיוביים ל-EGFP בדגימה שקיבלו את הווקטור הנגיפי מסוג שש הקשור לאדנו, יחד עם RNP, בעוד שלא נצפתה חיובית EGFP או מינימלית בדגימות הבקרה והוקטור בלבד בהתאמה.

הגברת PCR בצומת, הראתה אמפליקונים של זוג 1.5 קילו-בסיס בדגימת הדפיקה ולא נצפה תוצר PCR בדגימת הבקרה או הווקטור בלבד. ספירת תאים הראתה כי התהליך ההנדסי משפיע על התאוששות התאים בדגימת הדפיקה יותר מאשר דגימות הבקרה או הווקטור בלבד. עם זאת, כל הדגימות התאוששו במהירות תוך שלושה ימים לאחר ההנדסה.

ניתן להשתמש בהליך זה גם כדי להציג סוכני עורך בסיס לשינוי זוגות בסיסים בודדים על מנת לגרום או לתקן מוטציות נקודתיות בודדות בגנום של תאי B. זה יכול לשמש גם להכנסת קודוני עצירה מוקדמים או לשינוי אתרי אחוי, מה שמאפשר נוקאאוט של גנים מרובים ללא סיכון לטרנסלוקציות כרומוזומליות. לפני פיתוח טכניקה זו, הנדסת תאי B אנושיים תשאל את השימוש בגישות אחרות של הנדסת גנים מאתגרות יותר.

טכניקה זו היא אלטרנטיבה קלה, פחות יקרה ומהירה יותר. זה יכול לשמש גם לסינתזה של מוצרי טיפול תאי לשימוש קליני.