גניבות של גבישי חלבון עם I3C באמצעות הקרנת מטריצת מיקרו-זרעים אקראית
16 בינואר 2021
מאמר זה מציג שיטה ליצירת גבישי חלבון נגזר עם I3C (5-אמינו-2,4,6-triiodoisophthalic חומצה) באמצעות microseeding כדי ליצור תנאי התגבשות חדשים במסכי מטריצה דלילה. ניתן להגדיר את המגשים באמצעות רובוטים לחלק נוזלים או ביד.
זהו פרוטוקול התגבשות שנועד לייעל את הצמיחה של גביש חלבון ובו זמנית להפיק את החלבון עם מולקולה phasing כדי לקבוע את המבנה של חלבון על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. כדי לקבוע את מבנה גבישי הרנטגן של חלבון חדשני לחלוטין, תנאי התגבשות מותאמים לייצור גבישים איכותיים. במקרה של חלבון חדשני לחלוטין, אטומים כבדים צריכים להיות הציג לתוך הגביש כדי לייצר גביש נגזר.
נתוני עיסוק קרני רנטגן נאספים מהקריסטל הנגזר ויש לפתור אותם באופן חישובי כדי לייצר מבנה גבישי רנטגן. התגבשות ונגזרת הן תהליכים מייגעים. כדי לטפל בצווים בקבוק אלה, פיתחנו הליך סינון ממוטב שמשיג בו זמנית את שתי המטרות הללו.
פרוטוקול זה משתמש בטכניקה שפותחה בעבר הידועה בשם הקרנת מטריצת מיקרו-אורגניזם אקראית. גבישים או משקע גבישי נמחץ לתוך microseeds אשר ניתן להשתמש בהם כדי להתחיל צמיחת גביש בתנאים עצמאיים לחלוטין. במקביל, אנו מציגים מולקולת phasing הנקראת I3C למצב התגבשות.
מולקולה זו מספקת אות חריג גדול המאפשר למבנה להיפתר על ידי דיון חריג באורך גל אחד. עבור משתמשים שאינם מכירים את הגודל הניסיוני של מבני גבישים אנו מציגים צינור תוכנה ידידותי למשתמש כדי להפוך באופן חלקי את פתרון המבנה המתאים אותו לשימוש באות החריג מ- I3C. הצעד הראשון הוא ליצור מניית I3C.
למדוד 120 מיליגרם של I3C לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף 200 מיקרוליטרים של שני ליתיום הידרוקסיד טוחנת לצינור microcentrifuge. חימום הצינור ב 40 עד 60 מעלות ומערבולת ניתן להשתמש כדי לעודד פירוק.
המלאי הטנוני היחיד של פתרון ליתיום I3C צריך להיות חום. ניתן להשתמש בשתי שיטות כדי להציג את I3C במלאי החלבון. ליתיום I3C ניתן להוסיף ישירות למלאי החלבון.
3.75 microliters כדי 30 microliters של I3C ניתן להוסיף 150 microliters של חלבון לתת ריכוז בין חמישה ל 14 מילימולר. חלבונים מסוימים יכולים לזרז במגע עם ריכוזים גבוהים של I3C. במקרים אלה, ליתיום I3C ניתן להוסיף חיץ דילול חלבון כי הוא חיץ תאם את החלבון מדגם לריכוז סופי בין 10 ל 80 מילימולר.
הוסיפו 150 מיקרוליטרים של מאגר דילול החלבון ל-150 מיקרוליטרים של דגימת חלבון. גשוש זכוכית למחוץ גבישים עשוי פיפטה פסטר זכוכית. עם מבער בונזן על הלהבה הכחולה, מחממים את פיפטה פסטר לכיוון האמצע.
באמצעות זוג פינצטה, למשוך את הקצוות של פיפטה פסטר החוצה לקוטר דק של פחות מ 0.3 מילימטרים. החזק קטע זה בלהבה כדי להפריד את פיפטה בשלב זה ולעגל את הקצה של פיפטה כדי לסיים את החללית זכוכית. זוהי דוגמה של איך פיפטה זכוכית צריך להיראות.
ריסוקים קריסטל עשוי גם להיות הורה מספקי צד שלישי כחלופה להכנת מלאי microseed משלך נוצר על ידי ריסוק גבישי חלבון או משקע גבישי. מניחים חמישה צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל על קרח. תחת מיקרוסקופ אור, בחר את גבישי המורפולוגיה הטובים ביותר או משקעים גבישיים שניתן להקריב.
עבור 96 מגשי התגבשות היטב לפתוח את הבאר על ידי חיתוך סרט איטום פלסטיק. עבור מגשי טיפה תלויים, ניתן להסיר את פתק המכסה באמצעות פינצטה ולהסתובב על משטח שטוח. מעבירים 70 מיקרוליטרים של תסכולת מאגר לאחד מצינורות המיקרוצנטריפוגה ומצננים על הקרח.
לצינורות הנותרים, להעביר 90 microliters של פתרון המאגר אליו ולחזור לקרח כדי לצנן. אם קיים מספיק נפח מאגר התגבשות ניתן לעשות על ידי ערבוב reagents המתאים ניתן להשתמש במקום. להתסיס את הגבישים בירידה התגבשות באמצעות החללית זכוכית לרסק אותו ביסודיות.
ניתן לפקח על ההתקדמות מתחת למיקרוסקופ עד שלא ניתן יהיה לראות גבישים או חומר גבישי. מעבירים את כל הנוזלים מהירידה לצינור המיקרוצנטריפוגה המכיל 70 מיקרוליטרים של תותר המאגר. מערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה.
מעבירים שניים עד שלושה מיקרוליטרים של תערובת בחזרה לתוך באר ולשטוף את הטוב על ידי צינור למעלה ולמטה. מעבירים את התערובת בחזרה לצינור המיקרוצנטריפוגה. שלב שטיפה זה צריך לחזור על עצמו פעם נוספת.
צינור microcentrifuge צריך להישמר קר מנקודה זו ואילך, כדי למנוע המסת microseeds. מערבולת הצינור במהירות מקסימלית בארבע מעלות במשך כשלוש דקות מצמרר את הצינור על קרח באופן קבוע כדי למנוע התחממות יתר. לעשות אחד מכל 10 דילולים סדרתיים של מלאי הזרעים על ידי העברה רציפה של 10 microliters בין פתרונות המאגר המצונן.
בין דילול מלאי הזרעים, הצינור צריך להיות מערבולת. מלאי זרעים שלא ישמש באופן מיידי, צריך להיות מאוחסן במקפיא קר במיוחד מינוס 80 מעלות. ניתן להגדיר מסך מטריצת מיקרו-מזנון אקראי 96 היטב באמצעות רובוט מחלק נוזלי.
מניחים את מלאי הזרעים, פתרון מלאי החלבון בתוספת I3C ומסך התגבשות ברובוט. באמצעות הרובוט להעביר 75 microliters ממסך התגבשות למגש 96 באר. הוסף מיקרוליטר אחד לירידה התגבשות ו 74 microliters למאגר.
מעבירים מיקרוליטר אחד של חלבון בתוספת I3C לירידה התגבשות. העבר 0.1 מיקרוליטרים של מלאי זרעים לירידה התגבשות. לאטום את הצלחת באמצעות סרט איטום.
ניתן להגדיר מסכי טיפה תלויים ב-24 מגשי התגבשות תלויים היטב. משמנים את הקצוות של בארות הירידה התלויות. העבר 500 מיקרוליטרים של פתרון התגבשות למאגר.
ליד מרכז מגלשת כיסוי זכוכית מניחים טיפת מיקרוליטר אחת של פתרון התגבשות. לירידה זו, יש להוסיף מיקרוליטר אחד של חלבון בתוספת ליתיום I3C ו-0.1 מיקרוליטרים של מלאי זרעים. להפוך את החלקת המכסה ולאטום את התגבשות היטב על ידי דחיפת החלקת המכסה לתוך השומן.
מגשי טיפה ואיטום תלויים דגירה בטמפרטורה קבועה כדי לאפשר גבישים להיווצר. הם צריכים להיבדק באופן קבוע תחת מיקרוסקופ לצמיחת גביש. לאחר שהושגו נתוני דיפוזיה, משולבים ומורחבים כפי שהוסבר בפרוטוקול הכתוב הנלווה, ניתן להשתמש בצינור קביעת מבנה הגביש האוטומטי של Auto-Rickshaw כדי לפתור את בעיית הפאזה ולדגמן את החלבון.
בדף הנחיתה Auto-Rickshaw, לחץ על לחצן המשך. הזן את הדואר האלקטרוני המוסדי שלך בטופס האינטרנט של ריקשה אוטומטית ולחץ על המשך בהפעלת ריקשה אוטומטית. עבור חלבונים ללא תבנית מוטו הומולוגיה להפעיל את פרוטוקול SAD של ריקשה אוטומטית במצב מתקדם.
הזן את הפרמטרים הדרושים. בחר חלבון כסוג המולקולה. הזן את אורך הגל של איסוף הנתונים באנגסטרום.
אז כמו שאני כאלמנט תת-מבנה כדי לציין נעשה שימוש באטומים של יוד. בחר סוג מבנה משנה I3C כדי לציין I3C היה מולקולת phasing. בחר sub_direct כשיטה לקביעת מבנה המשנה.
בחר שלושה כמספר מבני המשנה הצפויים לכל מונומר. הזן אחד כניתוק ההזמנה של חיפוש מבנה משנה. הדבר מאפשר ל-Auto-Rickshaw לקבוע באופן אוטומטי ניתוק רזולוציה מתאים.
הזן את מספר השאריות במונומר יחיד, קבוצת חלל של ערכת הנתונים ומספר המולקולות ביחידה האסימטרית בהתבסס על מקדם מתיוס. בחר את רמת ההפצה המתאימה של נתוני רנטגן המתאימה לצרכיך. הזן את הנתונים החריגים כקובץ קבוצה ריק.
הזן את רצף החלבון שלך כקובץ SEQ, PIR או TXT. הזן את כתובת הדוא"ל המוסדית שלך. התוצאות מועברות אליך באמצעות קישור אינטרנט שנשלח לכתובת הדוא"ל שסופקה.
אם Auto-Rickshaw אינו מצליח לפתור את המבנה באמצעות מבנה המשנה הנחוש שלו אימות מבנה המשנה יכול לסייע בפתרון פתרון פתרון מבנה. הורד את רשימת אתרי האטומים הכבדים מדף התוצאות של Auto-Rickshaw. זהו היפר-קישור הנקרא אתרי אטום כבדים.
פעולה זו תוריד קובץ טקסט עם אתרי האטום הכבדים. שנה את סיומת הקובץ מ- txt ל- pdb. פתח את קובץ ה- pdb ב- Coot.
הפעל סימטריה כדי לראות את כל האטומים הכבדים מיחידות אסימטריות שכנות. למדוד את המרחקים בין האטומים הכבדים, כולל על פני יחידות אסימטריות. I3C יופיע כמשולש שיווי משקל עם אורך צד של שישה אנגסטרום.
נוכחותו של משולש עם ממדים אלה מצביעה על כך שהמיקומים של אותם אטומים כבדים נכונים. אם מבנה המשנה Auto-Rickshaw להפעלה שגוי, ניתן לבדוק הגדרות אחרות של ריקשה אוטומטית כפי שנדון בפרוטוקול הכתוב. שיטת I3C RMMS נבדקה על שני חלבונים, lysozyme לבן ביצה תרנגולת באמצעות מסך ב- HT ממחקר המפטון ואת התחום של חלבון ליסין Orf11 מ בקטריופאג P68.
מסכים מלאים הוקמו עבור כל חלבון המתאים למסך הבקרה ללא I3C או microseed, מסך עם microseed הוסיף, מסך עם I3C, ולבסוף את המסך עם I3C ו microseed. הוספת I3C למסך קריסטל אינה מגדילה את מספר כניסות ההתגבשות. עם ליסוזיים לבן ביצה תרנגולת, מספר התנאים ירד מ 31 ל 26.
עם התחום Orf11 נמצא תנאי להיט יחיד במסך הפקד. הוספת I3C למסך גם נתן להיט אחד באותם תנאים. הוספת microseed ל באר הביאה לעלייה משמעותית במספר תנאי הלהיט וכתוצאה מכך עלייה של פי 2.1 ו-6 עבור ליסוזיים לבן ביצה ותחום Orf11 בהתאמה.
תוצאה זו עולה בקנה אחד עם מחקרים אחרים בדיקת RMMS. והכי חשוב, הוספת I3C ו microseed למסך גם הגדילה את מספר תנאי הלהיט ביחס למסך הבקרה המדגים עלייה של פי 2.3 ו-7 עבור ליזויזים לבן ביצה ותחום Orf11 בהתאמה. הדבר מוכיח כי שיטת I3C RMMS יכולה לייצר ביעילות תנאים חדשים עבור גבישים נגזרים.
גבישים מתנאים אלה ניתן לקצור ו לשמש כדי לפתור את מבנה הגביש. הן המבנה של תרנגולת ביצה לבן lysozyme Orf11 תחום יכול להיפתר עם phasing SAD על צינור ריקשה אוטומטית, באמצעות אות חריג מ I3C המדגים נגזרת מוצלחת על ידי מסך I3C RMMS. הצגנו פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור גבישים באיכות גבוהה שמקורם במולקולת phasing I3C.
היא ממזערת את מספר המסכים ואת שלבי הטיפול הגבישיים, ולכן היא מעניינת במיוחד ביולוגים מבניים החוקרים חלבונים חדשניים. אנו ממליצים בחום לייעל את גודל הגביש על ידי בדיקת דילול מלאי זרעים שונים שנעשו במהלך הכנת מלאי הזרעים. וצעד זה הושלם לאחר שמסכים ראשוניים נעשו.
I3C זמין באופן נרחב וזה זול לרכוש ולכן אנו מאמינים שיטה זו היא בהישג ידם של רוב מעבדות ביולוגיה מבנית.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול גיבוש המייעל את גידול גבישי חלבון תוך הדרתם עם I3C לצורך קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן. השיטה משתמשת בבדיקת מטריצת מיקרוזרעים אקראית כדי לשפר את תנאי הגיבוש.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- גיבוש חלבונים
- קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן
- ביולוגיה מבנית
רקע
- גיבוש הוא חיוני לקביעת מבני חלבונים.
- הדרת חומרים עם אטומים כבדים נחוצה לצורך פאזינג בקריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.
- שיטות מסורתיות יכולות להיות עתירות עבודה וזמן.
- טכניקות מיקרוזרעים יכולות לשפר את תוצאות הגיבוש.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול משופר לגיבוש חלבונים והדרתם.
- להציג I3C כמולקולה לצורך פאזינג כדי לשפר את קביעת המבנה בקרני רנטגן.
- לספק צינור תוכנה ידידותית למשתמש לפתרון מבנה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת תמיסות אם של I3C.
- ריסוק גבישי חלבון ליצירת מיקרוזרעים.
- הגדרת מסכי גיבוש באמצעות רובוטים לפיזור נוזלים.
- ניטור גידול גבישים ואופטימיזציה של תנאים.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של גבישי חלבון מופקדים.
- שיפור תנאי הגיבוש באמצעות מיקרוזרעים.
- שימוש יעיל ב-I3C לצורך פאזינג בקריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.
- אוטומציה של חלקים מתהליך פתרון המבנה.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את היעילות של גיבוש חלבונים.
- מיקרוזרעים משפרים משמעותית את איכות הגבישים המתקבלים.
- I3C משמש כסוכן פאזינג יעיל לקביעת מבנה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in structural biology by combining protein crystallization with heavy-atom derivatization to enable experimental phasing for novel targets. By integrating random microseed matrix screening with I3C derivatization, it reduces the number of discrete steps required to obtain phase information, accelerating early-stage target validation. The approach supports de-risking of structural hypotheses in discovery pipelines where homology models are unavailable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables experimental phasing for novel proteins lacking homology models, supporting target validation through direct structure determination.
- Operational Value: Combines crystallization and derivatization in a single workflow, reducing hands-on time and sample handling.
- Predictive Value: The equilateral triangle arrangement of iodine atoms in I3C allows rapid validation of the anomalous substructure, increasing confidence in phased models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates derivatized crystal hits suitable for downstream data collection and phasing, enabling reliable electron density maps.
- Operational Value: Uses liquid dispensing robots to set up 96-well random microseed matrix screens, improving reproducibility and throughput.
- Scalability: Microseed stocks can be serially diluted and stored at -80°C, allowing reuse across multiple screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a path from crystallization to automated structure solution via the Auto-Rickshaw pipeline, supporting preclinical target characterization.
- Mechanistic De-risking: Successful SAD phasing using I3C-derived anomalous signal validates the structural model, reducing uncertainty in target mechanism.
- Disease-Relevant System: Demonstrated on hen egg white lysozyme and Orf11 lysin domain, showing applicability to diverse protein classes including antimicrobial targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, linking crystallization to structure solution for targets requiring experimental phasing, particularly when computational methods fail due to lack of templates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling 3D structure determination of novel proteins, clarifying binding sites and domain architecture.
- Screening: Produces reproducible crystallization conditions through microseeding, increasing hit rates for derivatized crystals as shown by 2.3- to 7-fold improvements over controls.
- Analytics: Outputs anomalous diffraction data suitable for SAD phasing, with substructure validation via I3C’s characteristic six-angstrom equilateral triangle.
- Translational Research: Connects to downstream validation through automated model building in Auto-Rickshaw, enabling progression to preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Microseed stocks and I3C protocols are standardized and storable, supporting platform reuse across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides experimental phase information, reducing reliance on molecular replacement and increasing success rate for novel targets.
- Operational Value: Streamlines workflow by combining two labor-intensive steps (crystallization and derivatization) into one integrated screen.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in target validation by enabling rapid structure determination.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target selection through high-quality, phased structures, supporting risk-adjusted advancement.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallization, microseeding, and handling of heavy atom compounds is required.
- Access to liquid dispensing robots, X-ray diffraction equipment, and structure solution software (Auto-Rickshaw, Coot) is necessary.
- Standardization across teams benefits from predefined I3C stock protocols and microseed storage procedures.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of I3C concentration to avoid precipitation, as noted for sensitive targets.
- Practical limitations include the need for initial crystal or precipitate to generate microseeds and the dependence on sufficient anomalous signal for SAD phasing.
