ניקוי רקמות מבוסס בהירות מעודן עבור ארגון פיברובלסט תלת מימדי בלבבות עכבר בריאים ופצועים
16 במאי 2021
שיטה מעודנת של ניקוי רקמות פותחה והוחלה על לב העכבר הבוגר. שיטה זו נועדה לנקות רקמת לב צפופה ו autofluorescent, תוך שמירה על פלואורסצנטיות פיברובלסט שכותרתו המיוחסת לאסטרטגיה כתב גנטי.
פרוטוקול ניקוי רקמות חדשני זה משפר את הטכנולוגיה הקיימת כדי לאפשר מבט מדויק יותר ב- vivo על סוגי תאים ספציפיים בלב והתנהגותם בתנאי פציעה. פרוטוקול זה הוא מהיר ופשוט למדי. זה מאפשר שמירה על פלואורסצנטיות מארקה עם הפרעה מינימלית מן פלואורסצנטיות אוטומטית רקמת רקע ללא צורך כתם תא או רקמות.
התחל באמצעות כרית גזה ספוגה באתנול של 70% כדי לנקות את פני השטח הגחוניים של העכבר הניסיוני. השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך רוחבי של שלושה סנטימטרים, כשלושה מטרים מתחת לתהליך xiphoid ולשחרר את העכבר מהבטן לתהליך xiphoid כדי להפריד את העור מרקמת דופן הבטן הבסיסית. בצע חתך רוחבי של שני סנטימטרים ברקמת דופן הבטן התת עורית, שלושה סנטימטרים מתחת לתהליך xiphoid ולעשות חתך אנכי מן החתך הזה במעלה קו האמצע דרך כלוב הצלעות.
הצמד את כלוב הצלעות בחזרה כדי לחשוף את הלב. ולהשתמש מזרק 10 מיליליטר מצויד במחט 27 מד להזריק PBS קר לתוך קאווה vena מעולה ואבי העורקים. כאשר כל הדם כבר סמוק מהלב, לספק 10 מיליליטר של קר 4%PFA לתוך ורידים מעולה אבי העורקים כדי להתחיל את תהליך הקיבעון.
כאשר כל התיקון כבר הבזיק, בלו את הלב ולהשתמש אזמל להב ישר כדי להפריד את atria, החדר הימני מחיצה ואת החדר השמאלי. מניחים את הלב לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר של קר 4%PFA עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס על מאגוז. למחרת בבוקר, הוסיפו פתרון יוזם 0.25% לתמיסת הידרוג'לים שהוכנה זה עתה והעבירו את הלב לג'ל ההידרו.
לעטוף את הצינור חרוט בנייר כסף עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס ללא הפרעה פיזית. למחרת בבוקר לחמם את הצינור באמבטיה חרוזים 37 מעלות צלזיוס במשך 2.5 שעות לפני השימוש מלקחיים להעביר בזהירות את הלב לתוך צינור 15 מיליליטר של PBS. לשטוף את הלב שלוש פעמים PBS במשך שעה אחת לכל לשטוף ב 37 מעלות צלזיוס על מאגוז ולהעביר את הלב לתוך הסל של מכונת אלקטרופורזה פעילה.
לאבטח את המכסה במקום ולמלא את מאגר תא אלקטרופורזה פעיל עם פתרון ניקוי אלקטרופורזה. ברגע שהתא מלא, להטביע את הסל בתמיסה ולהדק את המכסה על מכונת האלקטרופורזה למקומו. לאחר מכן הפעל את מכונת האלקטרופורזה ב 1.5 אמפר ו 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.
לאחר אלקטרופורזה, בדוק את הראייה של הלב כדי לוודא שלא נותרה רקמה אטומה. לשטוף את הלב פינה שלוש פעמים ב 15 מיליליטר שתיים במשך שעה אחת PBS טרי ב 37 מעלות צלזיוס לכל לשטוף על מוצף. לפני שקוע את הלב סוכן decolorizing כדי להפחית פלואורסצנטיות אוטומטי heme.
לאחר 48 שעות, לשטוף את הלב שלוש פעמים PBS כפי שהוכח ולשקול את הלב RIMS מוכן טרי במשך 48 שעות לפני ההדמיה. להדמיה תלת-ממדית של הלב הנקה, תחילה, הניחו שכבה דקה של שומן ואקום על תחתית מאגר תחתון מודפס בתלת-ממד, באותו גובה שבו נראית הדגימה. מלא את המאגר ב- RIMS והשתמש בקצה פיפטה כדי להסיר בועות.
בזהירות למקם את הלב RIMS עם הקיר החדר השמאלי פונה כלפי מעלה, דואג כי אין בועות שהוכנסו לתוך הפתרון. השתמש גריז ואקום לצרף להחליק כיסוי זכוכית על פני השטח התחתון של פיסת המאגר העליון מודפס 3D ומניחים את מכסה המאגר העליון למטה על המאגרים התחתונים, דואג למנוע בועות. ואז למלא את המאגרים העליונים עם גליצרול.
השתמש במיקרוסקופ קונפוקאלי כדי לדמות את הלבבות המנוקוים. שילוב של ניקוי רקמת לב מעודנת עם הדמיה תלת-ממדית מאפשר הדמיה מפורטת ומתקדמת של פיברובלסטים לבביים. באמצעות טכניקת הדמיה זו, fibroblasts הם נצפו להיות צפוף ארוז יש מורפולוגיה צירים בלבבות לא נפגעים.
לאחר פציעת רפרופוזיה איסכמיה, אובדן של פיברובלסטים לב נראה באזור איסכמי במשך שלושת הימים הראשונים לאחר פציעה. ביום השביעי וה-14, הפיברובלסטים היגרו או התפשטו כדי לאכלס מחדש את אזור הרקמות הפצועות. ביום ה-28, אוכלוסיית הפיברובלסטים הלבביים המקיפים את האזורים הפצועים של הלב נמצאים בצפיפות הגבוהה ביותר שלהם.
יום וחצי לאחר פציעת אוטם שריר הלב, מעט פיברובלסטים נשארים בחדר השמאלי הפצוע. ביום השלישי, לעומת זאת, הפיברובלסטים מתרחבים ונוכחים ברוב החדר השמאלי. בניגוד לניתוח איסכמי, עירוי של אנגיוטנסין 2 ופנולפרין במשך מספר שבועות אינו גורם לאובדן רקמת לב ודילול קיר.
במקום זאת, פיברובלסט ליישר לאורך הציר של דפוס התכווצות סליל ימני כפי שניתן לראות בעת שימוש מעודן פרוטוקול ניקוי רקמות. בנוסף, לאחר טיפול אנגיוטנסין 2 ו phenolefrin, fibroblasts מופיעים קטנים מעוגלים בניגוד לצורת ציר שנצפו במודלים של תפוצת איסכמיה ופציעה אוטם שריר הלב. הסליקה האלקטרופורטית צריכה להתבצע בזהירות במיוחד כאשר עובדים עם לבבות שעברו פרוטוקולי פציעה.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך כיצד פיברובלסטים לב מגיבים לפציעה ב vivo. סמני פלואורסצנט שונים יכולים לשמש גם כדי להבין כיצד הלב מגיב לפציעה ברמה התאית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פותחה שיטת ניקוי רקמות משוכללת ללב עכבר בוגר, המאפשרת הדמיה של סוגי תאים ספציפיים תוך צמצום פלואורסצנציה אוטומטית ברקע. פרוטוקול זה משפר את הטכניקות הקיימות לחקר רקמת הלב.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה קרדיווסקולרית
- הנדסת רקמות
רקע
- טכניקות ניקוי רקמות הן חיוניות להדמיה של רקמות ביולוגיות צפופות.
- פלואורסצנציה אוטומטית יכולה להסוות אותות תאיים ספציפיים במחקרי הדמיה.
- שמירה על פלואורסצנציה של תאים מסומנים חיונית לניתוח מדויק.
- שיטות קיימות עשויות לדרוש משיחה, מה שמסבך את התהליך.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול ניקוי רקמות מהיר ופשוט.
- לשפר את ההדמיה של פלואורסצנציה של פיברובלסטים ברקמת הלב.
- להפחית את הפרעת הרקע מפלואורסצנציה אוטומטית.
שיטות בשימוש
- נוצל 70% אתנול לניקוי המשטח הגחוני של העכבר.
- בוצעו חתכים כירורגיים לגישה ללב.
- הוחל פרוטוקול הניקוי החדש על רקמת הלב.
- שמרו על פלואורסצנציה של marca ללא משיחה.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול החדש פינה באופן יעיל רקמות לב צפופות.
- נשמרה פלואורסצנציה של פיברובלסטים במהלך התהליך.
- פלואורסצנציה אוטומטית ברקע הופחתה באופן משמעותי.
- השיטה מאפשרת הדמיה טובה יותר של תאי לב in vivo.
מסקנות
- שיטה משוכללת זו משפרת את המחקר של רקמת הלב.
- היא מספקת כלי חשוב לחוקרים הבודקים תגובות לפגיעה בלב.
- הפרוטוקול יעיל וממזער את הצורך במשיחה נוספת.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding cardiac fibroblast dynamics in three dimensions provides critical insights into fibrosis mechanisms that drive ventricular stiffness and heart failure progression. This refined CLARITY-based tissue clearing approach enables high-fidelity, whole-organ visualization of fibroblast behavior without antibody penetration limitations or fluorescence loss, supporting mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. The method offers predictive value by revealing spatially resolved fibroblast responses to ischemic and non-ischemic injury models, informing go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fibroblast localization and morphology in intact tissue to clarify pathogenic versus reparative roles in cardiac fibrosis.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genetic fibroblast labeling (Tcf21-MerCreMer; Rosa26-loxP-eGFP) to spatial phenotypes in healthy and injured hearts.
- Predictive Confidence: Reveals injury-specific fibroblast patterns—such as aligned bands post-angiotensin II/phenylephrine or repopulation from border zones post-ischemia—to de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces cleared, fluorescently labeled hearts compatible with confocal imaging for quantitative 3D analysis of fibroblast density, distribution, and morphology.
- Reproducibility: Standardized electrophoresis-based clearing (1.5 amps, 37°C, 1.5 hours) and RIMS equilibration ensure consistent tissue optical properties across experimental groups.
- Scalability: Compatible with multi-sample processing in active electrophoresis chambers, enabling side-by-side comparison of control, ischemic, and hypertensive injury models.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Captures fibroblast responses in models mimicking human ischemic injury (reperfusion) and pressure overload (angiotensin II/phenylephrine), aligning with clinical fibrosis phenotypes.
- Translational Continuity: Tracks fibroblast death, border zone repopulation, and density peaks at day 28 post-ischemia—key temporal windows for antifibrotic intervention testing.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes pro-fibrotic spindle-shaped fibroblasts in ischemia from small, rounded phenotypes in hypertension, informing target-specific pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing spatially resolved phenotypic data that bridges in vitro findings and functional outcomes in preclinical models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of fibroblast activation, migration, and proliferation in 3D tissue context, clarifying pathway-level contributions to fibrosis.
- Screening: Generates quantitative imaging outputs (fibroblast density, alignment, morphology) suitable for high-content analysis in compound screening cascades.
- Analytics: Supports morphometric and spatial statistical analysis of fibroblast networks, enabling comparison across genotypes, injuries, and time points.
- Translational Research: Links fibroblast dynamics to ventricular remodeling timelines, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue clearing and imaging platform applicable to multiple cardiovascular disease models and cell types beyond fibroblasts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in fibroblast function by preserving native tissue architecture and fluorescent signal integrity.
- Operational Value: Eliminates need for sectioning and staining, reducing workflow variability and increasing throughput for 3D phenotyping.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by revealing on-target fibroblast responses that predict functional outcomes in heart failure models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antifibrotic targets based on spatially validated target engagement and phenotypic modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac surgery, perfusion fixation, and hydrogel-based tissue clearing techniques.
- Dependent on access to active electrophoresis equipment, confocal microscopy, and RIMS/glycerol mounting solutions.
- Necessitates standardization of clearing duration and temperature to prevent over-clearing or autofluorescence in injured tissue.
- Adaptation to other disease models may require optimization of decolorization time to reduce heme-derived background without quenching GFP signal.
- Practical limitation: Long-term imaging stability depends on proper RIMS equilibration to prevent refractive index mismatch and signal degradation.
