Name: ניקוי רקמות מבוסס בהירות מעודן עבור ארגון פיברובלסט תלת מימדי בלבבות עכבר בריאים ופצועים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: למד שיטת ניקוי רקמות מתקדמת ללב עכבר המאפשרת הדמיה תלת-ממדית של פיברובלסטים לבביים בזמן אמת. הפרוטוקול מפחית פלואורסצנציה רקעית ושומר על סימון תאים ללא צביעה נוספת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר את CCHMC Confocal הדמיה ליבה על הסיוע וההדרכה שלהם בפיתוח של מודל זה, כמו גם מאט באטי מהנדסה קלינית עבור העיצוב של כל החלקים המודפסים 3D. דמטריה פישר נתמכה על ידי מענק הכשרה מהמכונים הלאומיים לבריאות (NHLBI, T32 HL125204) וג'פרי ד. מולקנטין נתמך על ידי המכון הרפואי הווארד יוז.

<ol><li>Nagaraju, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+phenotype+and+reversibility+of+fibrosis+in+patients+With+end-stage+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).</li>
<li>Yoon, S., Eom, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%3A+present+status+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions.</a> Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).</li>
<li>Borlaug, B. A., Redfield, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diastolic+and+systolic+heart+failure+are+distinct+phenotypes+within+the+heart+failure+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum.</a> Circulation. 123, 2006-2014 (2011).</li>
<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the cardiac fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Sadeghi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+3D+cardiac+fibrotic+tissue+to+study+fibrotic+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434(2017).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li>
<li>Bruns, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricular+fibroblast+secretome+drives+cardiomyocyte+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation.</a> PLoS One. 14 (8), 0220573(2019).</li>
<li>Skiöldebrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+activation+of+human+cardiac+fibroblasts+leads+to+altered+calcium+signaling%2C+decreased+connexin+43+expression+and+increased+glutamate+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion.</a> Heliyon. 3 (10), 00406(2017).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+pegasos+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method.</a> Cell Research. 28, 803-818 (2018).</li>
<li>Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+cardiac+injury+response+of+targeted+cell+populations+via+cleared+heart+three-dimensional+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transparent+intact+cardiac+tissue+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution.</a> Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Yokoyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sympathetic+hyperinnervation+and+denervation+after+myocardial+infarction+by+three-dimensional+assessment+of+the+cardiac+sympathetic+network+in+cleared+transparent+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts.</a> PLoS One. 12 (7), 0182072(2017).</li>
<li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-of-Acrylamide+SDS-based+Tissue+Clearing+%28FASTClear%29+for+three+dimensional+visualization+of+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue.</a> Scientific Reports. 7, 5188(2017).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Nehrhoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+in+CUBIC-cleared+mouse+heart+tissue%3A+going+deeper%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper.</a> Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).</li>
<li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+reporter+mouse+line+for+Cre-+and+FLP-dependent+lineage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis.</a> Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+Routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li>Means, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+S1P2+and+S1P3+receptor-mediated+Akt+activation+protects+against+in+vivo+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circuatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).</li>
<li>Michael, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+ischemia+and+reperfusion%3A+A+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circuatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).</li>
<li>Ahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myocardial+infarcts+of+a+predictable+size+and+location+by+branch+pattern+probability-assisted+coronary+ligation+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Joural+of+Physiology%3A+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice.</a> American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).</li>
<li>Patten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+remodeling+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circuatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).</li>
<li>Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+echocardiographic+assessment+of+left+ventricular+dimensions+and+function+after+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).</li>
<li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577, 405-409 (2020).</li>
<li>Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist+mechanics+of+the+left+ventricle.+Principles+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%3A+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).</li>
<li>Arts, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+three-dimensional+motion+patterns+of+the+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).</li>
<li>Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+muscle+actin-positive+cells+in+healing+human+myocardial+scars%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars.</a> American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).</li>
<li>Hashmi, S., Al-Salam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%3A+A+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison.</a> International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין גילויים הקשורים לתוכן כתב היד הזה.

מאמר זה מציג שיטה מעודנת לניקוי רקמות המאפשרת הדמיה של פיברובלסטים לבביים ב vivo, הן בבסיס הפציעה והן בעקבותיה, כדי לאפיין ולהבין טוב יותר פיברובלסטים בלב העכבר. פרוטוקול משופר זה מטפל במגבלות בפרוטוקולים קיימים לניקוי רקמות שניסו לזהות סוגי תאים ספציפיים בלב הבוגר או בילודים12,13,14,16,17,20. בניסיונות הראשונים לנקות את לב ה...

למרות cardiomyocytes מהווים את שבר הנפח הגדול ביותר בלב, fibroblasts לב הם בשפע יותר והם מעורבים באופן קריטי בוויסות התכונות המבניות הבסיסיות של איבר זה. פיברובלסטים לבביים הם ניידים מאוד, מגיבים מכנית, ופנוטיפיים הנעים בהתאם למידת ההפעלה שלהם. פיברובלסטים לב נחוצים כדי לשמור על רמות נורמליות של מטריצה חוץ תאית (ECM), וייצור ECM מעט מדי או יותר מדי על ידי תאים אלה יכול להוביל למחלה1,2,3. בהתחשב בחשיבותם במחלות, פיברובלסטים לב הפכו לנושא חשוב יותר ויותר של חקירה לקראת זיהוי אסטרטגיות טיפול חדשניות, במיוחד בניסיון להגביל פיברוזיס מוגזם4,5,6,7. לאחר פציעה, fibroblasts להפעיל ולהבדיל לתוך סוג תא סינתטי יותר המכונה myofibroblast, אשר יכול להיות שגשוג להפריש ECM בשפע, כמו גם יש פעילות התכווצות המסייעת לשפץ את החדרים.
בעוד פיברובלסטים לב הוערכו בהרחבה עבור המאפיינים שלהם בתרבויות 2-D6,8,9,10, הרבה פחות מובן של המאפיינים שלהם ואת הדינמיקה בלב חי 3-D, או בבסיס או עם גירוי המחלה. כאן, שיטה מעודנת תוארה רקמה לנקות את לב העכבר הבוגר תוך שמירה על פלואורסצנטיות של fibroblasts שכותרתו עם Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer מערכת כתב גנטי. בתוך הלב, Tcf21 הוא סמן ספציפי יחסית של פיברובלסטים שקטים4. לאחר טמוקסיפן ניתנת כדי להפעיל את החלבון MerCreMer בלתי ניתן להסבר, למעשה כל fibroblasts רגיעה לצמיתות להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) מן הלוקוס Rosa26, אשר מאפשר המעקב שלהם vivo.
קיימים פרוטוקולים רבים לניקוי רקמות מבוססים, שחלקם הוחלו על הלב11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, רבים של ריאגנטים המשמשים פרוטוקולים ניקוי רקמות שונים נמצאו להרוות אותות פלואורסצנטיים אנדוגני18. בנוסף, הלב הבוגר קשה לנקות בשל שפע של חלבונים המכילים קבוצת heme המייצרים שפעת אוטומטית19. לכן, מטרת פרוטוקול זה הייתה לשמר פלואורסצנטיות סמן פיברובלסט עם עיכוב בו זמנית של שפעת אוטומטית heme בלב הבוגר הפצוע להדמיה אופטימלית 3-D ב vivo12,13,14,16,17,20.
מחקרים קודמים שניסו לבחון את פיברובלסט הלב ב vivo השתמשו נוגדנים perfused לתייג תאים אלה, אם כי מחקרים כאלה היו מוגבלים על ידי חדירת נוגדנים ומבנה כלי דם לב14,16,17,20. למרות סלמון ואח 'הראו ניקוי רקמות עם שמירה על פלואורסצנטיות עצבית אקטואלי בלב יילודים, ו Nehrhoff et al. הראו תחזוקה של פלואורסצנטיות סימון תאים מיאלואידיים, שמירה על פלואורסצנטיות אנדוגני דרך כל הקיר החדרי עדיין לא הוכח, כולל הדמיה של fibroblasts לב למבוגרים בבסיס או בעקבות פציעה13,20. פרוטוקול ניקוי רקמות זה מזקק תערובת של פרוטוקולים קודמים המבוססים על שיטת CLARITY (מערכת ממסים נוקשה אקרילאמיד-היברידית-היברידית/חיסונית/בהידרוגל רקמה תואמת איטו-הכלאה) ו- PEGASOS (מערכת ממס הקשורה לפוליאתילן גליקול (PEG). פרוטוקול מעודן זה התיר בדיקה חזקה יותר של פיברובלסטים לב בלב העכבר בבסיס וכיצד הם מגיבים לסוגים שונים של פציעה. הפרוטוקול הוא פשוט לשחזור יעזור לאפיין את ההתנהגות של פיברובלסטים לב vivo.

<table><tbody><tr><td>4-0 משי קלוע</td><td>Ethicon</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>8-0 פרולן</td><td></td><td>Ethicon 8730H</td><td></td></tr><tr><td>40% תמיסת אקרילאמיד</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>Angiotensin II</td><td>Sigma</td><td>A9525-50G</td><td></td></tr><tr><td>משחת דמעות מלאכותית</td><td>Covetrus</td><td>048272</td><td></td></tr><tr><td>DABCO (1,4-diazabicyclo [2.2. 2] אוקטן)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>D27802-25G</td><td></td></tr><tr><td>GLUture דבק רקמות מקומי</td><td>World Precision Instruments</td><td>503763</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H0777</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Start Analysis Software</td><td>Oxford Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>משאבות מיקרו-אוסמוטיות</td><td>Alzet</td><td>דגם 1002</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Elements Analysis Software</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ניקון A1R HD מיקרוסקופ זקוף</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>צ'או אוטוקלאב רגיל</td><td>Labdiet</td><td>5010</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide</td><td>CosmoBio</td><td>AXS-1002424</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>פנילפרין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>P6126-10G</td><td></td></tr><tr><td>פוטו-יוזם</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td></td></tr><tr><td>Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-GT (ROSA) 26Sortm1 (CAG-lacZ, -EGFP) Glh/J ]</td><td>Jackson Laboratories</td><td>Jax מלאי מס 012429</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן כלוריד</td><td>Hospira, Inc.</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>טמוקסיפן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>טמוקסיפן מזון</td><td>Envigo</td><td>TD.130860</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Quadrol, N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, חומר להסרת צבע</td><td>Millipore Sigma</td><td>122262-1L</td><td></td></tr><tr><td>X-Clarity תא פינוי אלקטרופורטי</td><td>Logos Biosystems</td><td>C30001</td><td></td></tr><tr><td>X-Clarity פתרון ניקוי אלקטרופורטי</td><td>Logos Biosystems</td><td>C13001</td><td></td></tr><tr><td>X-Clarity סל רקמות אלקטרופורזה</td><td>Logos Biosystems</td><td>C12001</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק סל רקמות אלקטרופורזה X-Clarity Logos</td><td>Biosystems</td><td>C12002</td><td></td></tr></tbody></table>

ניקוי רקמות מבוסס בהירות מעודן עבור ארגון פיברובלסט תלת מימדי בלבבות עכבר בריאים ופצועים

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

מחלות לב וכלי דם הן הגורם השכיח ביותר לתמותה ברחבי העולם, והוא מסומן לעתים קרובות על ידי פיברוזיס לב מוגבר שיכול להוביל נוקשות חדרית מוגברת עם תפקוד לב שונה. עלייה זו פיברוזיס חדרית לב נובעת הפעלה של פיברובלסטים תושב, אם כי איך תאים אלה פועלים בתוך הלב 3 מימדי (3-D), בבסיס או לאחר ההפעלה, אינו מובן היטב. כדי לבחון כיצד פיברובלסטים תורמים למחלות לב ולדינמיקה שלהם בלב תלת-ממדי, פותחה שיטת ניקוי והדמיה מעודנת המבוססת על CLARITY המציגה פיברובלסטים לבביים בעלי תווית פלואורסצנטית בתוך לב העכבר כולו. פיברובלסטים תושבי רקמות תויגו גנטית באמצעות רוזה26-loxP-eGFP עכברים כתב פלורסנט חצה עם פיברובלסט הלב המבטא Tcf21-MerCreMer לדפוק בקו. טכניקה זו שימשה כדי לבחון דינמיקה לוקליזציה fibroblast לאורך כל החדר השמאלי הבוגר בעכברים בריאים במודלים עכבר סיבי של מחלות לב. מעניין, במודל פציעה אחד, דפוסים ייחודיים של פיברובלסטים לב נצפו בלב העכבר הפצוע שעקב אחר רצועות של סיבים עטופים בכיוון הכווץ. במודלים של פגיעה איסכמית, התרחש מוות פיברובלסטי, ואחריו אכלוס מחדש מאזור הגבול האוטם. באופן קולקטיבי, טכניקת הבהרה זו של רקמת לב מעודנת ומערכת הדמיה דיגיטלית מאפשרת הדמיה תלת-ממדית של פיברובלסטים לבביים בלב ללא מגבלות של כשל חדירת נוגדנים או בעיות קודמות סביב פלואורסצנטיות אבודה עקב עיבוד רקמות.

פיברובלסטים לבביים חיוניים לתפקוד בסיסי של הלב, כמו גם לתגובה לפגיעה לבבית. ניסיונות קודמים להבין את הסידור והמורפולוגיה של תאים אלה נערכו בעיקר בהגדרות דו-ממדיות. עם זאת, פורסמה טכניקת הדמיה תלת-ממדית מעודנת של רקמת לב (איור 2)ותל-ממדית, המאפשרת הדמיה מתקדמת ומפורטת יותר של פיברובלסטים לבביים. בטכניקת הדמיה זו נמצאו פיברובלסטים צפופים בעלי מורפולוגיה מרוכלת בלבבות לא נפגעים(איור 3, סרטונים משלימים S1–4).
לאחר ניקוי ר...

שיטה מעודנת של ניקוי רקמות פותחה והוחלה על לב העכבר הבוגר. שיטה זו נועדה לנקות רקמת לב צפופה ו autofluorescent, תוך שמירה על פלואורסצנטיות פיברובלסט שכותרתו המיוחסת לאסטרטגיה כתב גנטי.

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

פרוטוקול ניקוי רקמות חדשני זה משפר את הטכנולוגיה הקיימת כדי לאפשר מבט מדויק יותר ב- vivo על סוגי תאים ספציפיים בלב והתנהגותם בתנאי פציעה. פרוטוקול זה הוא מהיר ופשוט למדי. זה מאפשר שמירה על פלואורסצנטיות מארקה עם הפרעה מינימלית מן פלואורסצנטיות אוטומטית רקמת רקע ללא צורך כתם תא או רקמות.התחל באמצעות כרית גזה ספוגה באתנול של 70% כדי לנקות את פני השטח הגחוניים של העכבר הניסיוני. השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך רוחבי של שלושה סנטימטרים, כשלושה מטרים מתחת לתהליך xiphoid ולשחרר את העכבר מהבטן לתהליך xiphoid כדי להפריד את העור מרקמת דופן הבטן הבסיסית. בצע חתך רוחבי של שני סנטימטרים ברקמת דופן הבטן התת עורית, שלושה סנטימטרים מתחת לתהליך xiphoid ולעשות חתך אנכי מן החתך הזה במעלה קו האמצע דרך כלוב הצלעות.הצמד את כלוב הצלעות בחזרה כדי לחשוף את הלב. ולהשתמש מזרק 10 מיליליטר מצויד במחט 27 מד להזריק PBS קר לתוך קאווה vena מעולה ואבי העורקים. כאשר כל הדם כבר סמוק מהלב, לספק 10 מיליליטר של קר 4%PFA לתוך ורידים מעולה אבי העורקים כדי להתחיל את תהליך הקיבעון.כאשר כל התיקון כבר הבזיק, בלו את הלב ולהשתמש אזמל להב ישר כדי להפריד את atria, החדר הימני מחיצה ואת החדר השמאלי. מניחים את הלב לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר של קר 4%PFA עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס על מאגוז. למחרת בבוקר, הוסיפו פתרון יוזם 0.25% לתמיסת הידרוג'לים שהוכנה זה עתה והעבירו את הלב לג'ל ההידרו.לעטוף את הצינור חרוט בנייר כסף עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס ללא הפרעה פיזית. למחרת בבוקר לחמם את הצינור באמבטיה חרוזים 37 מעלות צלזיוס במשך 2.5 שעות לפני השימוש מלקחיים להעביר בזהירות את הלב לתוך צינור 15 מיליליטר של PBS. לשטוף את הלב שלוש פעמים PBS במשך שעה אחת לכל לשטוף ב 37 מעלות צלזיוס על מאגוז ולהעביר את הלב לתוך הסל של מכונת אלקטרופורזה פעילה.לאבטח את המכסה במקום ולמלא את מאגר תא אלקטרופורזה פעיל עם פתרון ניקוי אלקטרופורזה. ברגע שהתא מלא, להטביע את הסל בתמיסה ולהדק את המכסה על מכונת האלקטרופורזה למקומו. לאחר מכן הפעל את מכונת האלקטרופורזה ב 1.5 אמפר ו 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.לאחר אלקטרופורזה, בדוק את הראייה של הלב כדי לוודא שלא נותרה רקמה אטומה. לשטוף את הלב פינה שלוש פעמים ב 15 מיליליטר שתיים במשך שעה אחת PBS טרי ב 37 מעלות צלזיוס לכל לשטוף על מוצף. לפני שקוע את הלב סוכן decolorizing כדי להפחית פלואורסצנטיות אוטומטי heme.לאחר 48 שעות, לשטוף את הלב שלוש פעמים PBS כפי שהוכח ולשקול את הלב RIMS מוכן טרי במשך 48 שעות לפני ההדמיה. להדמיה תלת-ממדית של הלב הנקה, תחילה, הניחו שכבה דקה של שומן ואקום על תחתית מאגר תחתון מודפס בתלת-ממד, באותו גובה שבו נראית הדגימה. מלא את המאגר ב- RIMS והשתמש בקצה פיפטה כדי להסיר בועות.בזהירות למקם את הלב RIMS עם הקיר החדר השמאלי פונה כלפי מעלה, דואג כי אין בועות שהוכנסו לתוך הפתרון. השתמש גריז ואקום לצרף להחליק כיסוי זכוכית על פני השטח התחתון של פיסת המאגר העליון מודפס 3D ומניחים את מכסה המאגר העליון למטה על המאגרים התחתונים, דואג למנוע בועות. ואז למלא את המאגרים העליונים עם גליצרול.השתמש במיקרוסקופ קונפוקאלי כדי לדמות את הלבבות המנוקוים. שילוב של ניקוי רקמת לב מעודנת עם הדמיה תלת-ממדית מאפשר הדמיה מפורטת ומתקדמת של פיברובלסטים לבביים. באמצעות טכניקת הדמיה זו, fibroblasts הם נצפו להיות צפוף ארוז יש מורפולוגיה צירים בלבבות לא נפגעים.לאחר פציעת רפרופוזיה איסכמיה, אובדן של פיברובלסטים לב נראה באזור איסכמי במשך שלושת הימים הראשונים לאחר פציעה. ביום השביעי וה-14, הפיברובלסטים היגרו או התפשטו כדי לאכלס מחדש את אזור הרקמות הפצועות. ביום ה-28, אוכלוסיית הפיברובלסטים הלבביים המקיפים את האזורים הפצועים של הלב נמצאים בצפיפות הגבוהה ביותר שלהם.יום וחצי לאחר פציעת אוטם שריר הלב, מעט פיברובלסטים נשארים בחדר השמאלי הפצוע. ביום השלישי, לעומת זאת, הפיברובלסטים מתרחבים ונוכחים ברוב החדר השמאלי. בניגוד לניתוח איסכמי, עירוי של אנגיוטנסין 2 ופנולפרין במשך מספר שבועות אינו גורם לאובדן רקמת לב ודילול קיר.במקום זאת, פיברובלסט ליישר לאורך הציר של דפוס התכווצות סליל ימני כפי שניתן לראות בעת שימוש מעודן פרוטוקול ניקוי רקמות. בנוסף, לאחר טיפול אנגיוטנסין 2 ו phenolefrin, fibroblasts מופיעים קטנים מעוגלים בניגוד לצורת ציר שנצפו במודלים של תפוצת איסכמיה ופציעה אוטם שריר הלב. הסליקה האלקטרופורטית צריכה להתבצע בזהירות במיוחד כאשר עובדים עם לבבות שעברו פרוטוקולי פציעה.פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך כיצד פיברובלסטים לב מגיבים לפציעה ב vivo. סמני פלואורסצנט שונים יכולים לשמש גם כדי להבין כיצד הלב מגיב לפציעה ברמה התאית.

refined-clarity-based-tissue-clearing-for-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מתואר מודל בעל יכולת שחזור גבוהה לאוטם שריר הלב בעכברים עם מניפולציות פולשניות מינימליות. ניתן לבצע את המודל בקלות, וכתוצאה מכך יכולת שחזור ושיעור הישרדות גבוהים. לפיכך, המודל המתואר יפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים כמתבקש על ידי עקרון 3R (החלפה, עידון והפחתה).

נוהל כירורגי זעיר פולשנית של גרימת אוטם שריר הלב בעכברים

פרוטוקול וידאו שלב אחר שלב של כריתה אפיקלית מודגם במחקר זה. כריתה אפיקלית היא גישה כירורגית שהודגשה לאחרונה במחקר התחדשות לב של יונקים. מחקר זה עשוי לקדם את היישום של כריתה אפיקלית כמתודולוגיה סטנדרטית במחקר על המנגנון העומד בבסיס התחדשות הלב.

דגם פסגת כריתת עכבר כדי ללמוד התחדשות לב יונקים מוקדמת

אנו מתארים פרוטוקול להדמיה נפחית של תאים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי עמוק בתוך לבבות עובריים שלמים ולאחר לידה. תוך שימוש בשיטות ניקוי רקמות בשילוב עם צביעה שלמה, ניתן לדמות תאים בודדים עם תווית חלבון פלואורסצנטי בתוך לב עוברי או לאחר לידה בצורה ברורה ומדויקת.

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

מחקר זה משתמש בטכניקה מיקרוסקופ (LSFM) אור גיליונות פלורסצנטיות דו-צדדית תאורה בשילוב עם קרחת אופטי ללמוד את הלב מאתר.

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

התפשטות הקרדיוציט לאחר הפציעה היא תהליך דינאמי הדורש סימפוניה של רמזים בלתי-מיכיים מאוכלוסיות תאים שאינן מיוציט. ניצול מעקב אחר השושלת, בהירות פסיבית, ושלושה מימדים שלמים של מיקרוסקופ ההרכבה טכניקות, אנחנו יכולים לנתח את ההשפעה של מגוון סוגי תאים על תיקון לב והתחדשות.

לכידת תגובת פגיעה לב של אוכלוסיות תאים ממוקדות באמצעות לב נקי תלת מימדי הדמיה

קבלת אוכלוסייה טהורה של פיברותקיעות חיונית כדי ללמוד את תפקידם בתיקון פצעים פיברוזיס. המתואר כאן היא שיטה מפורטת כדי לבודד את הפיברוכדורים ומיוריסותליות מלבבות העכבר שנפגעו ונפצעו ולאחר מכן אפיון הטוהר והפונקציונליות שלהם על ידי immunofluorescence RTPCR, מיון תאים בסיוע פלואורסצנטית, ו התכווצות ג'ל לקולגן.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

אנו מדווחים על שיטה לשחזור מזוסקופי של לב העכבר כולו על ידי שילוב של התקדמות חדשה בטרנספורמציה וצביעה של רקמות עם פיתוח של מיקרוסקופ אור סרוק אקסיאלי.

הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם

העברת תאים מונחית אולטרסאונד סביב האתר של אוטם שריר הלב בעכברים היא דרך בטוחה, יעילה ונוחה להשתלת תאים.

השתלת קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אולטרסאונד בעכברים עם אוטם שריר הלב

הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופ מתקדם של יריעות אור יחד עם שיטות מותאמות לניקוי רקמות כדי לחקור מבנים לבביים מורכבים בלבבות מכרסמים, טומן בחובו פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש.

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

שחזור תלת מימדי (תלת מימדי) של נזק לבבי באוטם שריר הלב החריף (repAMI) מאפשר כימות נאמן ולוקליזציה משותפת של דפוסים המשפיעים על המחלה הקשורים. כאן, ניתנת גישת הדמיה מונחית יריעת אור אוטומטית למדידה בו-זמנית של נזק לבבי, אזור בסיכון ותגובת תאי חיסון.

ניתוח תלת מימד סימולטני של נזק לבבי ותגובה חיסונית באוטם שריר הלב החריף באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור

פרוטוקול זה מציג צינור הדמיה מקיף להמחשה ומידום מורפולוגיית תאי כוכב כבדיים ברקמת כבד שלמה. גישה זו משלבת תיוג פלואורסצנטי של פיברובלסטים באמצעות גנטיקה של עכברים, הכנת רקמה מבוססת פרפוזיה בכבד במקום , ושיטת ניקוי רקמות iDISCO מותאמת להשגת שקיפות אופטית.

מיפוי מורפולוגיית תאי כוכב כבדיים במודלים של עכברים של פיברוזיס כבד

למד שיטת ניקוי רקמות מתקדמת ללב עכבר המאפשרת הדמיה תלת-ממדית של פיברובלסטים לבביים בזמן אמת. הפרוטוקול מפחית פלואורסצנציה רקעית ושומר על סימון תאים ללא צביעה נוספת.

ניקוי רקמות מבוסס בהירות מעודן עבור ארגון פיברובלסט תלת מימדי בלבבות עכבר בריאים ופצועים

גלה סרטונים נוספים