מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

פרוטוקול זה יש יתרונות רבים על פני מטבולומיה שמרים בשימוש הנוכחי כי יש לו ספציפיות גבוהה, רגישות גבוהה, וגם זה יכול פרופיל סוגים רבים ושונים של מטבוליטים, כולל isomeric, איזוברי, הידרופילי, הידרופובית, מולקולות הידרופוביות. שיטת ההרוויון המשמשת בפרוטוקול זה עוצרת את כל התגובות אנזימטיות תוך הפחתת משמעותית של דליפת מטבוליטים מהתאים. ספריית MS1 המובנית בפרוטוקול זה היא מריצות MS2 השונות.

לאחר תרבות לילה ב 30 מעלות צלזיוס ו 200 מהפכות לדקה, לקבוע את מספר תאי שמרים למיליליטר של תרבות ולהוסיף חמישה מיליליטר של פתרון מלאי מעוקר 20% של גלוקוז לכל אחד משני צלוחיות Erlenmeyer המכיל 45 מיליליטר של מדיום YP autoclaved לכל בקבוקון. השתמש פיפטה העברה סטרילית להוסיף חמש פעמים 10 לתאי שמרים השביעי לכל בקבוק ולגדל את תאי השמרים לפחות 24 שעות נוספות ב 30 מעלות צלזיוס ב 200 סיבובים לדקה. עבור מיצוי מטבוליט, לאחר תרבית, לאסוף את תאי שמרים על ידי צנטריפוגה במהירות להסיר את supernatant.

מניחים את הצינור על קרח יבש ומוסיפים שני מיליליטר של מינוס 20 מעלות צלזיוס כלורופורם, מיליליטר אחד של מינוס 20 מעלות צלזיוס מתנול, מיליליטר אחד של מים טהורים ננו קר כקרח, ו 200 microliters של 425 עד 600 חרוזי זכוכית שטף חומצה מיקרון לתאים. כאשר החרוזים נוספו, מניחים את הצינור מכוסה בנייר אלומיניום בערכת מחזיק צינור קצף עם שכר טרחה ומערבולת המדגם במשך 30 דקות במהירות בינונית בארבע מעלות צלזיוס כדי להקל על מיצוי מטבוליט. לאחר מכן, לדגור על הצינור במשך 15 דקות על קרח לפני centrifuging המדגם כדי לאפשר הפרדה של השלב מימי העליון מן הפסולת האמצעית וחלבון ושלבים אורגניים נמוכים יותר.

השתמש micropipette להעביר כ 400 microliters של השלב מימי העליון לצינור שטוף ומסומן 1.5 מיליליטר המכיל 800 microliters של מינוס 20 מעלות צלזיוס acetonitrile. לאחר מכן צנטריפוגה הדגימה ולהעביר 800 microliters של החלק העליון של supernatant למוסג ספקטרומטריית מסה מסה מחסן עבור אחסון אפס מעלות עד כרומטוגרפיה נוזלית יחד ניתוח ספקטרומטריית מסה. כדי להפריד את מטבוליטים שחולצו, ultrasonicate את באטלס מדגם במשך 15 דקות, ואחריו שלושה מערבולות 10 שניות בטמפרטורת החדר.

לאחר מערבולת, מניחים את הנקינה לתוך צלחת הבאר של הכרומטוגרף הנוזלי ומגדירים את העמודה ל -45 מעלות צלזיוס עם קצב זרימה של 0.25 מיליליטר לדקה ואת צלחת הבאר לאפס מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש בטבלה כדי להגדיר את מעברי הצבע הכרומטוגרפיה הנוזלית עבור הניתוח. לאחר ההפרדה, השתמש 10 נפחי מדגם microliter של ההזרקה הן במצב חיובי יינון אלקטרוספראי חיובי ושלילי בספקטרומטר מסה מצויד יינון אלקטרוספרי מחומם כדי לזהות ולכומת את מטבוליטים מסיסים במים.

בסוף הניתוח, פתח את הנתונים הגולמיים בתוכנת ניתוח מורכבת מתאימה והשתמש בספריית הפיצול הספקטרלית ההמונית כדי להתאים את ספקטרום המסה לביאור המטבוליטים שזוהו בניתוח. ניתן לזהות את המסות המדויקות של דפוסי MS1 והאיזוטופים כדי לאפשר ביאור של המטבוליטים באמצעות מסדי נתונים מקוונים. לאחר מכן השתמש בספריית מסדי הנתונים והספקטרום כדי לחפש את ספקטרום MS2 של הנתונים הגולמיים.

למחרת, לאחר מרווה את תאי השמרים, לשטוף ביסודיות את התאים עם 15 מיליליטר של חיץ ABC ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. resuspend הכדור במיליליטר אחד של חוצץ ABC טרי ולהוסיף 500 microliters של פתרון יוד propidium לתאים. מערבולת המדגם שלוש פעמים במשך 10 שניות לכל מערבולת ודגרת התאים במשך 10 דקות על קרח מוגן מפני אור.

בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של חיץ ABC טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, יש להזרים את הכדור ל-300 מיקרוליטרים של חיץ ABC טרי ולהוסיף 10 מיקרוליטרים של השעיית התא שנוצרה לשקופית מיקרוסקופ. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי ללכוד ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית ותמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות של התאים עם המסננים מוגדרים אורך גל עירור של 593 ננומטר ואורך גל פליטה של 636 ננומטר.

לאחר מכן השתמש בתוכנית ניתוח תמונה מתאימה כדי לספור את מספר התא הכולל של תאים בתמונות brightfield ופלואורסצנטיות, ולקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות של כתמים עבור תאים בודדים. שיטת מרווה התאים שהשתנתה גורמת לנזק נמוך משמעותית לקרום הפלזמה ולקיר התא מאשר שיטת ההרוואת 80% הלא-חוצצה במינוס 40 מעלות צלזיוס. ואכן, כמעט כל התאים הכפופים להרוות באמצעות השיטה שונה להפגין פליטת פלואורסצנטיות אדומה, אשר אופייני לתאי שמרים שבהם קרום הפלזמה וקיר התא אינם פגומים.

לעומת זאת, כמעט כל התאים הכפופים להרוות באמצעות מתנול 80% ללא אגירה ב 40 מעלות צלזיוס שיטה הציג פליטת פלואורסצנטיות ירוקה, אשר אופייני לתאי שמרים שבהם קרום הפלזמה וקיר התא נפגעים באופן משמעותי. שיטת מרווה התאים שהשתנתה גורמת גם לדליפת מטבוליטים מסיסים במים מתאי שמרים מאשר שיטת ההרוואת 80% הלא-חוצצה במינוס 40 מעלות צלזיוס. ערכי הסטת זמן השמירה של תקני מטבוליט מסיסים במים נמוכים משמעותית וצורות השיא חדות משמעותית עבור עמודת הפאזה הזויטרונית בהשוואה לעמודת הפאזה ההפוכה.

יתרון נוסף של שיטת ספקטרומטריית המסה הדו-מצעית הכרומטוגרפית הנוזלית הוא היכולת להשתמש בעמודת הפאזה הזויטרונית כדי להפריד ביעילות מטבוליטים שונים מסיסים במים עם תכונות מבניות, פיזיות וכימיות מגוונות. הקפד לעשות את יוד propidium עומד בחושך וגם הקפד לאסוף את השלב העליון תוך לא להפריע לשלב האמצעי. אם אין אפשרות לייאר כל MSP עקב היעדר הספריה הספקטרלית MS2, השתמש ב- NMR כדי להמחיש מבנה זה.