Name: רקמת קרנית חזירית Explant ללמוד את היעילות של וירוס הרפס סימפלקס-1 אנטי ויראלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: למדו את שיטת רקמת קרנית חזירית ex vivo לבדיקת יעילות תרופות אנטי-ויראליות נגד HSV-1. מודל זה מציע חלופה חסכונית ופחות מורכבת למודלים חיות מסורתיים במחקר תרופות עיניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 ו- RO1 EY029426) ל- D.S. A.A. נתמך על ידי מענק F30EY025981 ממכון העיניים הלאומי, NIH. המחקר נערך באמצעות קרניות החזירים שהתקבלו מחברת Park Packing, שדרת אשלנד 4107, ניו סיטי, שיקגו, IL-60609

כל רקמת החזיר המשמשת במחקר זה סופקה על ידי ארגון פרטי של צד שלישי ואף אחד מהטיפול בבעלי חיים לא בוצע על ידי אוניברסיטת אילינוי באנשי שיקגו.
1. חומרים
<ol><li>
ריאגנטים
	<ol>
<li>השתמש ריאגנטים הבאים לבדיקת פלאק: אבקת methylcellulose, מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), סרום בקר עוברי (FBS), פניצילין וסטרפטומיצין (P /S) לבדיקת פלאק.</li>
		<li>השתמש טבליות סגול קריסטל ואתנול (כיתה ביולוגיה מולקולרית) להכנת פתרון סגול קריסטל לבדיקת פלאק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מדיה צמיחה תא Vero - מדיה שלמה DMEM
	<ol>
<li>פתח את בקבוק המדיה DMEM בתוך מכסה המנוע של תרבות הרקמות. הסר 55 מ"ל של מדיה מהבקבוק באמצעות pipette סרולוגי להשליך אותו. הוסף 50 מ"ל של FBS של P/S ל- DMEM. יש לשמור בקירור ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
פלאק אסאי מדיה - מניה של 5% מתילקולוז מדיה
	<ol>
<li>מדוד 2.5 גרם של אבקת מתילצלולוז עם מגנט ערבוב בתוך בקבוק זכוכית 500 מ"ל וסגור אותו אוטומטית. לאחר הבקבוק מתקרר לטמפרטורת החדר, לקחת 500 מ"ל של מדיה שלמה DMEM המכיל 50 מ"ל של FBS ו 5 מ"ל של P / S ולהוסיף אותו בקבוק זכוכית המכיל methylcellulose.</li>
		<li>מערבבים את זה ב 4 °C במשך 2 ימים באמצעות stirrer מגנטי. יש לשמור בקירור ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנה תקשורתית לקרנית חזירית מובאת
	<ol>
<li>פתח בקבוק מדיה חיונית מינימלית (MEM) בתוך מכסה המנוע של תרבות הרקמות. יש להשליך 10 מ"ל של MEM מהבקבוק באמצעות פיפטה סרולוגית.</li>
		<li>הוסיפו 5 מ"ל של אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS) ו-5 מ"ל של אנטי-מיקוטית-אנטיביוטיקה (AA) לתקשורת והכניסו למקרר ל-4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מאסטר ומלאי עובד של סגול קריסטל:
	<ol>
<li>כדי להפוך את פתרון מלאי סגול קריסטל, להוסיף 1 גרם של אבקת סגול קריסטל ל 100 מ"ל של 20% אתנול במים. מניה זו (1% w / v קריסטל סגול) ניתן לאחסן ולהשתמש עד שנה כאשר מאוחסן במקום חשוך.</li>
		<li>כדי להפוך מלאי עובד מזה, להוסיף 50 מ"ל של פתרון מלאי מקורי 350 מ"ל של מים. הוסף 100mL של אתנול לפתרון זה כדי להפוך 500 mL עובד קריסטל סגול פתרון (0.1% w / v קריסטל סגול). הערה: שני פתרונות אלה צריכים להיות מאוחסנים בחושך.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הליך
<ol><li>בידוד של קרניות חזירים מעיניים שלמות17
	<ol>
<li>עם קבלת עיני החזיר ממוכר מתאים, יש לאחסן בקרח אם יש עיכוב בעיבוד רקמות כפי שמצולמים באיור 1.</li>
		<li>ודא כי ציוד הגנה אישי משמש ושחוק במהלך הליך זה כדי למנוע זיהום, כמו גם תאונות משפוך של הומור הזגום.</li>
		<li>לרסס את אזור העבודה עם 70% אתנול כדי לנקות ולחטא. כדי להבטיח שמרחב העבודה יציב, פזורו כיסוי ספסל והדביקו את הצדדים בצורה מאובטחת כפי שהם בתמונה באיור 2.</li>
		<li>הניחו עיני חזיר על גזה(איור 3). בעזרת גזה בקוטר 50 מ"מ, יש להחזיק את החלק האחורי (איור 4A)של עיני חזיר כפי שמוצג באיור 4B ביד אחת.</li>
		<li>בעזרת מחט של 30 גרם, הכינו בעדינות דקירה בודדת במרכז המשטח האפיתל של העין בזהירות וודאו שאין נזק לסטרומה(איור 5). הדקירה צריכה להיות מוגבלת לאפיתל (~ 100-200 מיקרומטר) כדי למנוע מעורבות סטרומה.</li>
		<li>באמצעות להב מעוקר חד, לעשות עיגול קטן על sclera במרחק 1 מ"מ מן הקרנית. חותכים את קצה הקרנית ומבטיחים שההומור הזגג לא ידלוף באמצעות פעולה מסתובבת מהירה וחלקה של היד(איור 6A). על ידי החזקת הקרנית בקצה הקרנית-סקלרה עם פינצטה שטוחה, חתוך את שאר ממברנות קשירה של העין באמצעות הלהב(איור 6B).</li>
		<li>קח את הקרנית ומניחים אותו בצלחת 12-well מכוסה עם 2 מ"ל של קרנית בינונית. הקרנית צריכה להיות ממוקמת עם הפנים כלפי מעלה, המודגמת בסדרת שלבים באיור 7A-D, איור 8).</li>
		<li>הוסף 5 μL של פתרון הווירוס המכיל 5 x 105 יחידות יצירת פלאק (PFU) של 17 GFP לאתר מושמץ על פני הקרנית. מניחים את הצלחת 12-well המכיל קרני חזיר נגועות באינקובטור עם 5% CO2 עבור 72 שעות.</li>
		<li>יש לרסס לעיניים נוספות שלא נעשה בהן שימוש בניסוי עם 10% אקונומיקה ולהשליך בבטחה בשקיות ביולוגיות.</li>
	</ol></li>
	<li>ויזואליזציה הערה: יש לדמיין את הנגיף כל יום לפני הוספת תרופות.<ol>
<li>הפעל את מיקרוסקופ הסטריאו ואת מקור אור ה- LED ואפשר למנורת המכונה להתחמם לפני הדמיית הקרניות. בזהירות לשאת את צלחת הקרנית למכשיר מבלי להפריע לפתרון. שנה את המסנן כך ש- GFP (380-460 ננומטר) ישמש להסתכל על דגימות. הגדר את זמן החשיפה ל- 500 ms כדי ללכוד תמונות.</li>
		<li>ראשית, מניחים את צלחת הקרנית מתחת לסטריאוסקופ ולוכדים את התמונות בהגדלה הנמוכה ביותר של 7.5x. עקוב אחר זה עם סדרה של תמונות הגדלה הולכות וגדלות (למשל, 15x, 25x, 35x) כך שכל ההתפשטות הנגיפית ויצירת דנדריט דמיינו בבירור</li>
		<li>הקפד להחזיר את הקרניות הנגועות בחזרה לאינקובטור תרבית הרקמות ולשמור את כל התמונות שצולמו.</li>
	</ol></li>
	<li>כימות זיהום וירוס הערה: טיטרים וירוס מן קרניות חזיר יש להעריך כל יום כדי לנתח את ההשפעה של טיפול תרופתי.<ol>
<li>כדי לכמת וירוס, זרע תאי Vero בצפיפות של 5 x 105 של תאים לבאר אם באמצעות צלחת 6-טוב כפי שנעשה בניסוי זה. עשה זאת יום לפני ההדבקה. לדגור על התאים מצופים לילה כדי להבטיח שהם ממפגש לכימות וירוסים.</li>
		<li>Aliquot 500 μL של מדיה חופשית בסרום לתוך צינורות microcentrifuge מרובים. הכנס ספוגית כותנה סטרילית טבולה לתוך צינורות מלאים מדיה חינם סרום. דגימות הכותנה צריכות להיות טבולות ומרטיבות לפחות 5 דקות לפני השימוש.</li>
		<li>מבלי להפריע לתקשורת הבסיסית, העבירו את צלחת הקרנית החזירית הנגועה לארון בטיחות ביולוגית. באמצעות צמר גפן רטוב, לעשות 3 מהפכות בכיוון השעון ו 3 מהפכות נגד כיוון השעון בקוטר של 5 מ"מ ממרכז הקרנית החזירית הנגועה מבלי להפעיל לחץ מוגזם.</li>
		<li>הכנס בחזרה את ספוגית הכותנה לתוך צינור microcentrifuge מלא מדיה סרום ולסובב אותו בכיוון השעון ואנטי בכיוון השעון 5 פעמים. קצה המתכת של ספוגית הכותנה צריך להיחתך כך שהוא מתאים לחלוטין לצינור microcentrifuge ואת המכסה ניתן לסגור.</li>
		<li>מניחים את צינור microcentrifuge המכיל את קצה הכותנה הספוג על מכונת מערבולת ומערבולת במהירות גבוהה במשך 1 דקות.</li>
		<li>בצע כימות וירוס באמצעות מנסרה פלאק על דגימות אלה. הערה: שלב כימות זה צריך להתבצע בימים 2, 4 ובאופן אופציונלי על 6 ימים לאחר ההדבקה.</li>
	</ol></li>
	<li>כימות וירוסים על ידי פלאק אסייד הערה: כדי לבצע פלאק אסייד, לגדול צלחת תאי Vero לתוך צלחת 6 היטב ולהבטיח 90% השפעה של תאים לפני תחילת מבחנה. השתמש בבקבוק 75 ס"מ2 של תאים אלה. כל השלבים שלהלן צריכים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.<ol>
<li>לשטוף את monolayer confluent של תאי Vero בבקבוקון עם 10 מ"ל של תמיסת מלח פוספט טרי (PBS) לאחר שאיפה מדיום התרבות. חזור על שלב הכביסה שוב עם PBS לאחר שאיפה את הסט הראשון של פתרון לשטוף.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין למונו-שכבתית של התא. לדגור על הבקבוקון ב 37 °C (5 דקות). בעין בלתי, ודא שהתאים מנותקים מפני השטח הפנימיים של הבקבוקון. אם לא, המתן עוד 5 דקות לפני שתבחן שוב את הבקבוקון. כאשר נראה שהתאים מנותקים, הוסף 9 מ"ל של מדיה שלמה למונו-שכבתית כדי להבטיח שהתאים יתנתקו לחלוטין ממשטח הבקבוק.</li>
		<li>לאסוף את כל התאים מן הבקבוק יחד עם התקשורת כולה ומניחים אותם בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.</li>
		<li>עבור כל באר של 6 צלחות היטב המשמשים לבדיקת פלאק, להשתמש 300 μL מן צינור צנטריפוגה. למעלה כל באר של צלחת 6 היטב עם 2 מ"ל של מדיה שלמה. השאירו את הצלחות באינקובטור למשך הלילה כדי לאפשר להם לגדול וליצור מונולייר משוחח בכל באר.</li>
		<li>על מנת לבצע בדיקת פלאק, לבצע דילול סדרתי של דגימות צריך להתבצע לפני כימות הנגיף.</li>
		<li>בצעדילול פי 101 של הנגיף בצינורות מיקרו צנטריפוגות באמצעות מדיה חופשית בסרום עד לדילול של 10-8 הוא הגיע. כאשר ב 10-3 דילול, להעביר 1 מ"ל של דילול למונולייר של תאים מצופים לאחר שאיפה את מדיה הצמיחה על התאים מן צלחת 6 באר, זה יהיה שלב הזיהום. לדגור את הצלחת הנגועה ב 37 °C אינקובטור במשך 2 שעות.</li>
		<li>שאפו את אמצעי ההדבקה הקיימים, שטפו עם PBS פעמיים בעדינות כדי לצפות תאים והוסיפו 2 מ"ל של מדיה עמוסה במתיל צלולוז לכל באר לכל 6 בארות. דגירה במשך 72 שעות או עד היווצרות של לוחות ניתן לראות. לוחות ניתן לזהות על ידי היווצרות של פערים קטנים בין תאים ב monolayer התא.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של מתנול לאט לפינה של כל באר, באמצעות הקיר כקצה מנחה. לדגור על צלחת 6 באר בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאט לאט לשאוף את התוכן של כל באר מהצלחת מבלי להפריע או להסעיר את monolayer התא.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של קריסטל סגול עובד פתרון לכל באר של 6 צלחת היטב, הבטחת כל התאים מכוסים. לדגור על צלחת 6 היטב בחושך במשך 30 דקות. יש להשליך את תמיסת הגביש הסגול על ידי שאיפתה ולייבש את בארות על גיליון נייר סופג.</li>
		<li>ספירת מספר הלוחות בבאר הדילול הגבוהה ביותר כדי לכמת את תוכן הווירוס הכולל בפתרון ההתחלתי. חזור על התהליך פעמיים כדי לאשר את טיטר הנגיף.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li>
<li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li>
<li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Adaptation+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States%2C+1988-1994%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li>
<li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li>
<li>Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis%3A+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li>
<li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+%28HSV-1%29+infection+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li>
<li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li>
<li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li>
<li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li>
<li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir%5BTitle%5D)+AND+%22CEN+Case+Report%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li>
<li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyclovir+nephrotoxicity%3A+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention%2C+detection%2C+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Case+Rep+Med%22%5BJournal%5D)">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li>
<li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559(2017).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+Histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li>
<li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861(2018).</li>
<li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li>
</ol>

המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים ואין אינטרסים כלכליים מתחרים.

מחקרים קודמים הראו BX795 יש תפקיד מבטיח כסוכן אנטי ויראלי נגד זיהום HSV-1; על ידי עיכוב קינאז מחייב טנק 1 (TBK1)16. הן TBK1 והן autophagy שיחקו תפקיד בסיוע לעכב זיהום HSV-1 כפי שהוכח על תאי אפיתל הקרנית האנושית. BX795 הוכח כיעיל ביותר עם פעילות אנטי ויראלית בריכוז של 10μM ושימוש הן ניתוח כתם מערבי וניתוח פלאק ויראלי של חלבונים ויראליים מפתח, BX795 הוכח לעכב זיהום HSV-1 דומה לפעילות של TFT16. המחקר על קרניות חזירים עקב אחר אותו ניתוח והשיג תוצאות דומות כפי שהוכח לעיל; BX795 ...

אנשים הסובלים מזיהומים בעיניים לעתים קרובות נגרמים אובדן ראייה1. עם seroprevalence גבוה ברחבי העולם, אנשים נגועים HSV סובלים דלקות עיניים חוזרות אשר מובילים הצטלקות קרנית, קרטיטיס סטרומה וניאווסקולריזציה2,3,4,5. זיהומים HSV הראו גם לגרום בתדירות נמוכה יותר, מגוון של מצבים חמורים בקרב immunocompromised, חולים לא מטופלים כמו דלקת המוח ותחלואה מערכתית6,7,8. תרופות כמו Acyclovir (ACV) ואנלוגי הנוקלאוזיד שלה הראו הצלחה עקבית בריסון זיהום HSV-1 ואפילו לשלוט בהפעלה מחדש, אך השימוש הממושך בתרופות אלה קשור לאי ספיקת כליות, חריגות עובריות ואי הגבלת הופעת עמידות לסמים לזנים ויראליים מתפתחים9,10,11,12,13. מורכבויות הקשורות לזיהומים עיניים HSV-1, נחקרו בעבר במבחנה באמצעות monolayers ו תרביות 3D של תאי הקרנית האנושיים in vivo באמצעות זיהומים מורין או עיני ארנב. בעוד מודלים במבחנה אלה מספקים נתונים משמעותיים על הרכיבים הביולוגיים התאיים של זיהומים HSV-1, הם, עם זאת, אינם מצליחים לחקות את המורכבות המורכבת של רקמת הקרנית ולא עושים הרבה כדי להאיר את ההתפשטות הדנדריטית של הנגיף14. לעומת זאת, למרות שבמערכות vivo תובנות יותר בהצגת התפשטות זיהום בקרנית ותגובות הפעלה חיסוניות במהלך זיהום HSV-1, הם מגיעים עם האזהרה כי הם דורשים חוקרים מיומנים ומתקנים גדולים לטיפול בבעלי חיים להתעלם מהניסויים.
כאן אנו משתמשים בקרנית חזירים כמודל ex vivo כדי לבחון את מערכת הפצע המושרה זיהום HSV-1. הן את הפרמקולוגיה הפוטנציאלית של תרופות מסוימות, כמו גם את התא ואת הביולוגיה המולקולרית של מערכת הפצע הנגרמת על ידי הזיהום ניתן ללמוד באמצעות תרביות explant רקמות. מודל זה עשוי להיות מתוקן גם לשימוש עבור זיהומים ויראליים וחיידקיים אחרים גם כן. במחקר זה, קרניות חזיר שימשו כדי לבדוק את היעילות האנטי ויראלית של מולקולה קטנה פרה-קלינית, BX795. השימוש בקרניות חזירים היה מועדף בשל קלות הגישה וחסכונות העלות. בנוסף, מודלים קרנית חזיר הם מודלים טובים של עיניים אנושיות עם קרניות להיות קל לבודד, בגודל נאות עבור זיהום ויזואליזציה וחזק להתמודד עם15. קרניות חזירים דומות גם למורכבות של מודלים קרניים אנושיים הן בחדירה לקרנית טרנס והן בספיגה מערכתית15. באמצעות מודל זה למחקר, הצלחנו להבהיר כיצד BX795 ראוי לחקירה נוספת כמעכב מוסמך של זיהום וירוס HSV-1 ומוסיף לספרות של סיווגו כתרכובת אנטי ויראלית פוטנציאלית של מולקולה קטנה16.

<table><tbody><tr><td>30 גרם מחטים היפודרמיות.</td><td>בקבוק זכוכית BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>500 מ"ל.</td><td>תומס סיינטיפיק</td><td>844027</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-מיקוטיקה ואנטיביוטיקה (AA)</td><td>GIBCO</td><td>15240096</td><td>Aliquot לתוך צינורות של 5 מ"ל ולשמור קפוא עד לשימוש</td></tr><tr><td>במערבולת ספסל.</td>ארון בטיחות ביולוגית <td>BioDot</td><td>BDVM-3200</td><td></td></tr><tr><td>עם הסמכת Bio-Safety Level-2 (BSL-2).</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Herasafe 2030i</td><td></td></tr><tr><td>Calgiswab 6 אינץ' סידן אלגינט סטרילי ספוגיות סטנדרטיות.</td>מגרד תאים <td>22029501</td><td></td> <td>פוריטני</td></tr><tr><td>- 25 ס"מ</td><td>Biologix BE</td><td>70-1180 70-1250</td><td></td></tr><tr><td>סגול קריסטל</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C6158</td><td>אחסן את האבקה במקום חשוך</td></tr><tr><td>Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני - DMEM</td><td>GIBCO</td><td>חנות 41966029</td><td>ב-4 מעלות; C עד השימוש</td></tr><tr><td>באתנול</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי -FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>Aliquot לתוך צינורות של 50 מ"ל ושומרים קפואים עד לשימוש</td></tr><tr><td>בפינצטה עם קצוות שטוחים &ndash; 2.</td> <td>Harward Instruments</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>מקפיאים --80 &deg;C. -</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>13 100 790</td><td></td></tr><tr><td>קופסת להבים טרייה.</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>TE05091</td><td></td></tr><tr><td>Guaze</td><td>Johnson & תיקיית ג'ונסון</td><td></td><td>108 אינץ' רבוע 12 שכבות</td></tr><tr><td>HSV-1 17GFP</td><td>שגדל בבית</td> <td>-</td> <td>זן מקורי של ד"ר פטרישיה ספירס, אוניברסיטת נורת'ווסטרן. GFP המבטא HSV-1 זן 17</td></tr><tr><td>אינסולין, טרנספרין, סלניום - ITS</td><td>GIBCO</td><td>41400045</td><td>Aliquot לתוך צינורות של 5 מ"ל ולשמור קפוא עד לשימוש</td></tr><tr><td>במערבל מגנטי.</td><td>Thomas Scientific</td><td>H3710-HS</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מתכתיים.</td><td>Harward Instruments</td><td>72-8400</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-פיפטות 1 עד 1000 ומיקרו-ליטר.</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>1159M37</td><td></td></tr><tr><td>מינימום חיוני בינוני - MEM</td><td>GIBCO</td><td>חנות 11095080</td><td>ב-4 מעלות; C עד לשימוש</td></tr><tr><td>ב-OptiMEM&nbsp;</td><td>חנות GIBCO</td><td>31985047</td><td>ב-4 מעלות; C עד לשימוש</td></tr><tr><td>בפניצילין/סטרפטומיצין.</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td>Aliquot לתוך צינורות של 5 מ"ל ושומרים קפואים עד לשימוש</td></tr> במי <tr><td>מלח מאגר פוספט -PBS</td><td>GIBCO</td><td>10010072</td><td>לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>Porcine Corneas</td><td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td><td></td><td>הזמנה מיוחדת לפי בקשה</td></tr><tr><td>נוהל כיסויי ספסל - לפי הצורך.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>S42400</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td><td></td></tr><tr><td>ציוד צנרת סרולוגי.</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>Ezpette Pro</td><td></td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>קארל זייס</td><td>SteREO Discovery V20</td><td></td></tr><tr><td>מגנט ערבוב</td>.<td>תומס סיינטיפיק</td><td>F37120</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית רקמות, T175 ס"מ.</td><td>תומס סיינטיפיק</td><td>T1275</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטורים של תרביות רקמה שיכולים לשמור על 5% CO2 ו-37 מעלות; טמפרטורת C.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Forma 50145523</td><td></td></tr><tr><td>צלחות מטופלות בתרבית רקמות (6 בארות).</td><td>תומס סיינטיפיק</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>GIBCO</td><td>25-300-062</td><td>Aliquot לתוך צינורות של 10 מ"ל ושומרים קפואים עד לשימוש</td></tr><tr><td>בתאי Vero</td><td>אוסף תרביות מסוג אמריקאי ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr></tbody></table>

רקמת קרנית חזירית explant ללמוד את היעילות של וירוס הרפס סימפלקס-1 אנטי ויראלי

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

וירוסים וחיידקים יכולים לגרום למגוון פגמים בקרצוף העין והתנוונות כגון פצעים וכיבים באמצעות זיהום בקרנית. עם seroprevalence הנע בין 60-90% ברחבי העולם, וירוס הרפס סימפלקס סוג-1 (HSV-1) בדרך כלל גורם נגעים ריר של האזור orofacial אשר באים לידי ביטוי גם כמו נגעים ועיוורון הקשורים לזיהום. בעוד התרופות האנטי ויראליות הנוכחיות יעילות, הופעת ההתנגדות וההתמדה של תופעות לוואי רעילות מחייבת פיתוח של תרופות אנטי ויראליות חדשניות נגד פתוגן זה בכל מקום. למרות בהערכת במבחנה מספק כמה נתונים פונקציונליים לגבי אנטי ויראלי המתעורר, הם אינם מדגימים את המורכבות של רקמת העין ב vivo. עם זאת, במחקרים vivo הם יקרים דורשים כוח אדם מאומן, במיוחד כאשר עובדים עם סוכנים ויראליים. לפיכך דגמי ex vivo הם צעדים יעילים אך זולים לבדיקות אנטי ויראליות. כאן אנו דנים בפרוטוקול לחקר זיהום על ידי HSV-1 באמצעות קרניות חזיר ex vivo ושיטה לטיפול בהם באופן מקומי באמצעות תרופות קיימות וחדשניות. אנו גם מדגימים את השיטה לביצוע ביצוע פלאק באמצעות HSV-1. השיטות המפורטות עשויות לשמש לעריכת ניסויים דומים לחקר זיהומים הדומים לפתוגן HSV-1.

כדי להבין את היעילות של האנטי-ויראליים הניסיוניים, הם צריכים להיבדק בהרחבה לפני שהם נשלחים לניסויים קליניים בבני אדם של vivo. בהקשר זה, יש לזהות שליטה חיובית, שליטה שלילית וקבוצות בדיקה. Trifluorothymidine (TFT) שימש זמן רב כטיפול המועדף לטיפול הרפס קרטיטיס topically16. משמש כשליטה חיובית, קבוצות הקרנית שטופלו TFT להראות התפשטות זיהום נמוכה יותר. כשליטה שלילית, השתמשנו ב- DMSO או בבקרת רכב מומסת ב- PBS. BX795, התרופה הניסיונית פרה-קלינית הייתה קבוצת הבדיקה. בסך הכל הוקצו 4 קרניות לכל קבוצה והתרופו...

אנו מתארים את השימוש בקרנית חזירית כדי לבדוק את היעילות האנטי ויראלית של תרופות ניסיוניות.

רקמת קרנית חזירית Explant ללמוד את היעילות של וירוס הרפס סימפלקס-1 אנטי ויראלי

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

הבנת היעילות של תרופות במודלים של בעלי חיים היא עלות ועבודה אינטנסיבית. הפרוטוקול שלנו המשתמש במודל explant רקמת ex vivo הוא נמוך באופן משמעותי הן מבחינת עלות וכוח אדם מדעי הנדרשים כדי לנהל את המחקר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש בעיני חזירים, אשר יש אנטומיה ופיזיולוגיה דומה מאוד לעיניים אנושיות לעומת כמה מודלים בעלי חיים קטנים אחרים.כאשר אנו בודקים תרופות במבחנה, הם עשויים להראות יעילות אשר עשוי להיעדר במודלים של בעלי חיים או בני אדם. מערכות רקמות Ex vivo הן הדרך הטובה ביותר להבין אם ניתן לתרגם את מערכות ההבחנה שלנו לניסויים בבעלי חיים ובבני אדם. מערכת הקרנית החזירית, אם כי פחות עבודה אינטנסיבית, דורשת מיומנויות הכשרה כדי לבודד, לשמור, להדביק ולטפל עם התרופות, במיוחד תהליך הבידוד של קרנית מכל עין החזיר הוא מסובך להביע במילים, אבל דורש הדגמה חזותית.עם קבלת עיני חזיר ממוכר מתאים, יש לאחסן את הרקמות על הקרח עד לעיבוד ולשים את ציוד ההגנה האישי המתאים. לחטא את אזור העבודה עם 70% אתנול ולהבטיח כיסוי ספסל על סביבת העבודה. כאשר אזור העבודה מוכן, מניחים את העיניים על חתיכת גזה של 50 מ"מ והשתמשו בגזה כדי לתפוס את החלק האחורי ביד אחת.באמצעות מחט 30 מד, בזהירות לעשות ניקוב אחד בערך במרכז המשטח האפיתל של העין, דואג לא לפגוע stroma, ולהשתמש בלהב מעוקר חד לעשות חותך קטן על הסקלרה במרחק מ

porcine-corneal-tissue-explant-to-study-efficacy-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

במאמר זה יתאר וידאו השימוש...

דגם גופיים Organotypic הקרני של הרפס סימפלקס סוג אפיתל החריף וירוס אני זיהום

רוב המחקרים של מחלת קרנית herpetic משתמשים במודל זיהום עיקרי. עם זאת, זיהום ראשוני עם HSV-1 אינו בדרך כלל להוביל למחלות אנושיות. כאן אנו מתארים מודל חוזר של מחלה בקרנית herpetic, אשר באופן הדוק יותר מחקה מחלות אנושיות.

Keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד HSK אנוש

סרטון זה מתאר פרוטוקול להגדרת מודל ex vivo לקרטיטיס חיידקית באמצעות כפתור corneoscleral שנותח מהעין החזירית. חיידקים מחוסנים חוצים את חתכי אפיתל הקרנית כדי לפלוש לסטרומה הבסיסית וליצור זיהום בתוך רקמות הקרנית המחקה את זיהום in vivo.

מודל הקרנית Porcine Ex vivo של קרטיטיס חיידקית: טכניקה ליצירת זיהום חיידקי בתאי אפיתל בקרנית

סרטון זה מדגים הליך לא פולשני בסיוע לייזר לפגיעה סלקטיבית בתאי האנדותל של הקרנית בעין החזירית. מודל ex vivo שפותח של נזק לתאי אנדותל יכול לשמש לחקר מחלות של אנדותל הקרנית.

אבלציה סלקטיבית בסיוע לייזר של תאי אנדותל בקרנית חזיר: טכניקה לגרימת פגיעה ממוקדת באנדותל הקרנית עבור מחקרי Ex Vivo

סרטון זה מדגים את השיטה לביצוע בדיקת פלאק באמצעות וירוס המתקבל מקרנית חזיר נגועה. קרנית החזיר משמשת לבדיקת היעילות האנטי-ויראלית של תרופות ניסיוניות.

קביעת יעילות אנטי-ויראלית של תרופות ניסיוניות באמצעות בדיקת פלאק

העור הוא רקמת מטרה אחת של הפתוגן האנושי הרפס סימפלקס וירוס סוג 1 (HSV-1). כדי לחקור את מסלול הפלישה של HSV-1 לרקמה, הקמנו מודל זיהום ex vivo של יריעות אפידרמיס של עכברים המייצגות את שכבת העור החיצונית ביותר.

זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב כדי להגדיר מודל אקס ויוו חזירי של קרטיטיס חיידקי. פסאודומונס ארוגינוזה משמש כאורגניזם אב-טיפוס. מודל חדשני זה מחקה זיהום vivo כמו התפשטות חיידקים תלויה ביכולתו של החיידק לפגוע ברקמת הקרנית.

הקמת דגם חזיר אקס ויוו קרנית לחקר טיפולים תרופתיים נגד קרטיטיס בקטריאלי

פיתחנו מודל חולדה של דלקת קרנית חמורה באמצעות גרידת אפיתל בקרנית בשילוב עם תפרים בקרנית. המחקר העריך דפוסי דלקת בקרנית, התפשטות אפיתל ושינויים בתאי גזע לימבליים בתנאים דלקתיים.

ביסוס מודל דלקת קרנית חמורה בחולדות המבוסס על גרידת אפיתל בקרנית בשילוב תפרי קרנית

תרבית איברים של קרנית חזיר ex vivo וריפוי פצעי אפיתל מספקים אמצעי חסכוני, אתי, ניתן לשחזור וכמותי לבדיקת רעילות העין של כימיקלים. הם גם מסייעים בהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס ויסות אפיתל ותיקון רקמות, ובהערכת טיפולים לטיפול בקרטופתיה סוכרתית ובריפוי פצעים מאוחר.

הערכת רעילות טיפולית וכימית באמצעות קרניות חזיר בתרבית איברים וריפוי פצעי אפיתל

מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

למדו את שיטת רקמת קרנית חזירית ex vivo לבדיקת יעילות תרופות אנטי-ויראליות נגד HSV-1. מודל זה מציע חלופה חסכונית ופחות מורכבת למודלים חיות מסורתיים במחקר תרופות עיניים.

רקמת קרנית חזירית Explant ללמוד את היעילות של וירוס הרפס סימפלקס-1 אנטי ויראלי

גלה סרטונים נוספים