Name: התבוננות בתפקוד אי ואינטראקציות תא חיסוני איון בפרוסות רקמת הלבלב חי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: למד את שיטת פרוסות רקמת הלבלב החי לחקירת תפקוד האיים ואינטראקציות עם תאים חיסוניים. שיטה זו שומרת על המיקרו-סביבה הטבעית ומאפשרת מחקר מחלות כמו סוכרת מסוג 1 ו-2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 ו P01 AI042288. מחקר זה בוצע בתמיכת הרשת לתורמי איברי לבלב עם סוכרת (nPOD; RRID:SCR_014641), פרויקט מחקר סוכרת מסוג 1 משותף בחסות JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R), וקרן הצדקה של לאונה M. והארי ב. הלמסלי (גרנט #2018PG-T1D053). התוכן והשקפות המובעים הם באחריות המחברים ואינם משקפים בהכרח את ההשקפה הרשמית של nPOD. ארגונים לרכש איברים (OPO) משתפים פעולה עם nPOD כדי לספק משאבי מחקר רשומים ב- http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. תודה לד"ר קווין אוטו, אוניברסיטת פלורידה, על שסיפקת את הוויברטום ששימש ליצירת פרוסות עכבר.

<ol><li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li>
<li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%3A+etiology+and+reversibility%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li>
<li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+the+study+of+islet+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology.</a> Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).</li>
<li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li>
<li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+persisting+%CE%B2+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).</li>
<li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li>
<li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anesthesia+and+analgesia+in+laboratory+animals%22">Anesthesia and analgesia in laboratory animals</a>. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).</li>
<li>Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine%2C+porcine%2C+and+bovine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li>
<li>Gál, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).</li>
<li>Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638(2013).</li>
<li>Stožer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).</li>
<li>Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136(2021).</li>
<li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li>
<li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706(2013).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר את הדור של פרוסות הלבלב ואת ההליכים הדרושים כדי להעסיק את הפרוסות במחקרים פונקציונליים ואימוניולוגיים. ישנם יתרונות רבים לשימוש בפרוסות לבלב חיות. עם זאת, ישנם מספר צעדים קריטיים החיוניים עבור הרקמה להישאר קיימא ושימושי במהלך פרוטוקולי הניסוי המתוארים. זה הכרחי לעבוד במהירות. יש למזער את משך הזמן בין הזרקת הלבלב לבין יצירת הפרוסות על הוויברטום כדי לשמור על כדאיות הרקמה. הכדאיות משופרת גם על ידי שמירה על הלבלב ב- ECS קר לפני חיתוך בניגוד לטמפרטורת החדר ECS. חשוב לציין, פרוסות לא צריך להיות בינו...

מעורבות הלבלב היא פתוגנומית למחלות כגון דלקת הלבלב, T1D ו- T2D1,2,3. חקר התפקוד באיים מבודדים כרוך בדרך כלל בהסרת האיים מסביבתם4. שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה פותחה כדי לאפשר את חקר רקמת הלבלב תוך שמירה על מיקרו-סביבה שלמה של איונים והימנעות משימוש בהליכי בידוד איים מלחיצים5,6,7. פרוסות רקמת הלבלב מרקמת התורם האנושי שימשו בהצלחה לחקר T1D והפגינו תהליכים של אובדן תאי ביתא וחוסר תפקוד בנוסף לחדירה לתאי החיסון8,9,10,11,12,13. ניתן ליישם את שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה הן על העכבר והן על רקמת הלבלב האנושית5,6,8. פרוסות רקמת הלבלב האנושית מרקמות תורמי איברים מתקבלות באמצעות שיתוף פעולה עם הרשת לתורמי איברי לבלב עם סוכרת (nPOD). פרוסות עכבר ניתן ליצור ממגוון של זני עכבר שונים.
פרוטוקול זה יתמקד ללא השמנת יתר סוכרת-רקומבינציה הפעלת גן-1-null (NOD. ראג1-/-) וקולטן תא T מהונדס (AI4) (הנהון. ראג1-/-. AI4 α/β) זני עכבר. הנהון. עכברי Rag1-/- אינם מסוגלים לפתח תאי T ו- B עקב הפרעה בגן מפעיל רקומבינציה 1 (Rag1)14. הנהון. ראג1-/-. עכברי AI4 α/β משמשים כמודל לסוכרת מסוג 1 מואצת מכיוון שהם מייצרים שיבוט תא T יחיד המכוון לאפיטופ של אינסולין, וכתוצאה מכך חדירת איים עקבית והתפתחות מחלה מהירה15. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר נהלים למחקרים פונקציונליים ואימונולוגיים באמצעות פרוסות לבלב אנושיות ועכבר חיות באמצעות יישום של גישות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הטכניקות המתוארות כאן כוללות הערכות כדאיות, זיהוי איון ומיקום, הקלטות Ca2+ ציטוטוסוליות, כמו גם כתמים וזיהוי של אוכלוסיות תאי החיסון.

<table><tbody><tr><td>#3 סטייל אזמל ידית</td><td>פישרברנד</td><td>12-000-163</td><td></td></tr><tr><td>1 מ' HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td>HEPES Buffer, תמיסה</td></tr><tr><td>1M 10 ס"מ קורנינג צלחת תרבית לא מטופלת</td><td></td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק Luer-Lok BD</td><td></td><td>301029</td><td>מזרק BD עם קצות Luer-Lok</td></tr><tr><td>27 גרם מחט</td><td></td><td>BD BD 305109</td><td>BD שימוש כללי ודיוקGlide מחטים היפודרמיות</td></tr><tr><td>35 מ"מ כיסוי צלחת פטרי תחתונה</td><td>זכוכית Ibidi</td><td>81156</td><td>&micro;-צלחת 35 מ"מ, מזרק גבוה</td></tr><tr><td>50 מ"ל</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>8 בארות כיסוי זכוכית</td> כיסוי <td>Ibidi</td><td>80826</td><td>&micro;-Slide 8 Well</td></tr><tr><td>APC נגד עכבר CD8a נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>199898</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>C5670</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>CaCl2 (דיהידרט)</td></tr><tr><td>נדנדה דיגיטלית קומפקטית</td><td>תרמו פישר 88880020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>חור סיכה&thinsp;= 1.5-2 יחידות אווריריות; נרכש עם צמצם מספרי של 10x/0.40 HC PL APO CS2 יבש ו-20x/0.75 צמצם מספרי HC PL APO CS2 יעדים יבשים ב-512&thinsp; וזמנים; &thinsp; רזולוציה של 512 פיקסלים</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G7021</td><td>C6H12O6</td></tr><tr><td>ddiH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td>דימתיל סולפוקסיד</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Decon Laboratories</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 35 מ"מ צלחת תרבית רקמות</td><td>קורנינג</td><td>353001</td><td>פלקון קל לאחיזה כלי תרבית רקמות</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>נוצה מס' 10 להב כירורגי</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי</td><td>7204410</td><td></td></tr><tr><td>fluo-4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>חדיר לתאים Ca2+ מחוון</td></tr> בקרת <tr><td>ג'ל סופר דבק</td><td>Loctite</td><td>45198</td><td></td></tr><tr><td>Graefe מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים מוקשים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Hanks תמיסת מלח מאוזנת</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>C8H18N2O4S</td></tr><tr><td>דלי קרח</td><td>פישרברנד</td><td>03-395-150</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>פטרסון וטרינרי</td><td>NDC 14043-704-05</td><td></td></tr><tr><td>ג'ונס הופקינס בולדוג מהדק</td><td>רובוז חנות כירורגית</td><td>RS-7440</td><td>&nbsp; ישר; לחץ של 500-900 גרם; אורך 1.5 אינץ'</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34705</td><td>Kimtech Science&trade; קימוויפס וסחר; מגבי משימות עדינים, ערכת 2 שכבות</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD כדאיות/ציטוטוקסיות</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>ערכה זו מכילה את צבע התאים החיים Calcein-AM.</td></tr><tr><td>גלוקוז נמוך DMEM</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td>MgCl2 (hexahydrate)</td></tr> <tr><td>מגנזיום סולפט heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>MgSO4 (heptahydrate)</td></tr><tr><td>פלטפורמה מחוממת מגנטית פלטפורמת</td><td>Warner Instruments</td><td>PM-1</td><td>לתא הדמיה לגירוי דינמי הקלטות</td></tr><tr><td>מיקרוגל</td><td>GE</td><td>JES1460DSWW</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene מסנן מזרק</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>726-2520</td><td></td></tr><tr><td>מס' 4 מכחול</td><td>מייקלס</td><td>10269140</td><td></td></tr><tr><td>תא הדמיה פתוח לאמבט יהלום</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>RC-26</td><td>תא הדמיה להקלטות גירוי דינמי</td></tr><tr><td>אורגון ירוק 488 BAPTA-1-AM</td><td>Invitrogen</td><td>מחוון O6807</td><td>חדיר לתאים Ca2+</td></tr><tr><td>תא הדמיה לילה</td><td>Okolab</td><td>H201-LG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PBS Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td>להכנת אגרוז לדור פרוסות</td></tr><tr><td>אינסולין טטרמר PE עם תווית</td><td>Emory מחקר רצף ליבת</td><td>YAIENYLEL</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Razor Blades Electron</td><td>Microscopy Sciences</td><td>71998</td><td>לוויברטום; פלדת אל חלד כפולה, RPMI</td></tr><tr><td>1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque נקודת התכה נמוכה</td><td>Lonza</td><td>50101</td><td>להכנת אגרוז ליצירת פרוסות</td></tr><tr><td>עוגן פרוסה</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1421</td><td></td></tr><tr><td>עוגן פרוסה (הדמיה דינמית)</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>עוגן פרוסה לתא</td></tr> <tr><td>הדמיה דינמינתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא</td><td>S5761</td><td>NaHCO<תת>3</תת></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונוהידרט</td><td>סיגמא</td><td>S9638</td><td>NaH<תת>2</תת>PO<תת>4 </תת>(מונוהידרט)</td></tr><tr><td>מעכב טריפסין פולי סויה</td><td>סיגמא</td><td>T6522-1G</td><td>מעכב טריפסין משלב גליצין מקס (פולי סויה)</td></tr><tr><td> מתאם</td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20MW-AL</td><td>כדי להתאים תא הדמיה להקלטות גירוי דינמי על במת המיקרוסקופ</td></tr><tr><td>חממה על הבמה</td><td>Okolab</td><td>H201</td><td></td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>Leica</td><td>IC90 E MSV266</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX כחול כתם תא מת</td><td>Invitrogen</td><td>S34857</td><td>כתם חומצת גרעין כחול-פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>העברת</td><td>Pipet Falcon</td><td>357575</td><td>Falcon&trade; פלסטיק חד פעמי העברה צנרת</td></tr><tr><td>מערכת בקרת שסתום</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>VCS-8</td><td>מערכת להקלטות גירוי דינמי</td></tr><tr><td>Vibratome VT1000 S</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FSGPD02</td><td>Fisherbrand Isotemp לשימוש כללי דלוקס אמבט מים GPD 02</td></tr></tbody></table>

התבוננות בתפקוד אי ואינטראקציות תא חיסוני איון בפרוסות רקמת הלבלב חי

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

פרוסות רקמת לבלב חיות מאפשרות לחקור פיזיולוגיה ותפקוד של איון בהקשר של מיקרו-סביבה שלמה של אי. פרוסות מוכנות מרקמת לבלב אנושית ועכבר חיה המוטבעת באגרוז וחותכת באמצעות ויברטום. שיטה זו מאפשרת לרקמה לשמור על כדאיות ותפקוד בנוסף לשימור פתולוגיות הבסיסיות כגון סוג 1 (T1D) וסוכרת מסוג 2 (T2D). שיטת הפרוסה מאפשרת כיוונים חדשים בחקר הלבלב באמצעות תחזוקת המבנים המורכבים ואינטראקציות בין-תאיות שונות המרכיבות את הרקמות האנדוקריניות והאקסוקריניות של הלבלב. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע כתמים ומיקרוסקופיה בזמן לשגות של תאי מערכת החיסון אנדוגני חיים בתוך פרוסות הלבלב יחד עם הערכות של פיזיולוגיה של אי. יתר על כן, גישה זו יכולה להיות מעודנת כדי להבחין אוכלוסיות תאי החיסון ספציפיים עבור אנטיגנים תאי אי באמצעות ריאגנטים מורכבים-multimer היסטו-תאימות גדולה.

פרוטוקול זה יניב פרוסות רקמת לבלב חיות המתאימות הן למחקרי פונקציונליות והן להקלטות תאי מערכת החיסון. מראה פרוסה הן בבהירות והן באור משתקף מוצג באיור 1A,B. כפי שנדון, איונים ניתן למצוא בפרוסות באמצעות אור משתקף בשל הגרגריות המוגברת שלהם המתרחשת בגלל תוכן האינסולין שלהם (איור 1C) והם נצפים בבירור בהשוואה לרקמת הרקע כאשר נעשה שימוש באור משתקף. יש להעריך את הכדאיות לאחר יצירת הפרוסה, ואין לרשום איונים אם יותר מ-20% מהאי אינו בר קיימא. אי בעל כדאיות ...

מחקר זה מציג את היישום של פרוסות רקמת לבלב חי לחקר פיזיולוגיה של איון ואינטראקציות תא חיסוני איון.

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

הפרוטוקול שלנו יעזור לענות על ההשפעה שיש לאינטראקציות של תאי מערכת החיסון על פונקציונליות האי. שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה מאפשרת לחקור את הפיזיולוגיה והתפקוד של האי תוך שמירה על הרקמות שבבסיס הפתולוגיות והמיקרו-סביבה הטבעית. שיטה זו יכולה לספק תובנה על תהליכי המחלה של מחלות לבלב, כגון דלקת לבלב, סוכרת מסוג I וסוכרת מסוג II.כדי להתחיל, לסדר את הבלוקים על מחזיק הדגימה באופן כזה שהם לא יעלה על רוחב הלהב, להבטיח כי הלהב יכול לנוע קדימה המרחק הפחות אפשרי כאשר הוויברטום נע לאט. החל קו של דבק סופר על מחזיק הדגימה, מה שהופך שכבה דקה באמצעות קצה מתקן הדבק, ולאחר מכן להפוך את בלוקי הרקמה על הדבק, כך הצד הקרוב לרקמה פונה כלפי מעלה. דוחפים בעדינות את הבלוקים ומניחים לדבק להתייבש במשך שלוש דקות.לאחר מכן, חבר את הצלחת לויברטום עם בורג והתאם את גובה הלהב ומרחק הנסיעה כך הלהב נע על פני אורך בלוקים רק בקושי מעליהם. דחף בעדינות את הבלוקים עם המלקחיים כדי לבדוק שהדבק התייבש, ולאחר מכן מלא את מגש הוויברטום בתמיסה חוץ-תאית צוננת עד שהלהב מכוסה. הגדר את הוויברטום כדי להפוך פרוסות של עובי 120 מיקרומטר ולהתחיל אותו, ולאחר מכן להתבונן הפרוסות יורד בלוקים רקמה.הרם את הפרוסות כאשר הם צפים מהבלוק על ידי הצבת מברשת צבע או מלקחיים מתחתיהם ומניחים את הפרוסות במאגר ביקרבונט קרבס-רינגר המכיל שלושה מילימילימטרים D-גלוקוז ומעכב טריפסין. מניחים את הצלחות המכילות את הפרוסות על נדנדה ודגר בטמפרטורת החדר במשך שעה ב-25 סל"ד. אם הפרוסות צריכות להישמר זמן רב יותר, מניחים את הפרוסות ב 15 מיליליטר של תרבות פרוסה בינוני ומניחים את הצלחת באינקובטור.לדגור על הפרוסות המוכנות ב 37 מעלות צלזיוס ללימודים באותו יום או להעביר את הפרוסות כי הם מתורבתים ב 24 מעלות צלזיוס לילה ל 37 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת לפני הניסוי. הפעילו את המיקרוסקופ לפחות שעה לפני ההקלטה ושוו את החממה העליונה של הבמה ל-37 מעלות צלזיוס. אבטחו את צלחת הפטרי התחתונה של הכיסוי המכילה את הפרוסה על הבמה.מקד את המיקרוסקופ על-ידי הגדרת המטרה 10X במצב Brightfield ואתר את האיים באמצעות מצב השדה הבהיר על-ידי חיפוש אליפסות בצבע חום כתום בתוך הפרוסה. החלף את המיקרוסקופ להדמיה קונפוקלית על-ידי לחיצה על לחצן CS בבקר מסך המגע של המיקרוסקופ. כדי להציג את האיים באמצעות רפלקטיביות, הפעל את גלאי הלייזר 638 וגלאי PMT.הגדר את עוצמת הלייזר בין אחוז אחד ל- 2% וכבה את מסנני החרץ. השתמש לייזר 405 ננומטר גלאי PMT כדי לצפות בכתם חומצת הגרעין. הגלאי ההיברידי לזיהוי נוגדני CD8 וגלאי לייזר והיברידי 488 ננומטר לצפייה בטטרמר האינסולין.מרכז את האי העניין בשדה הראייה באמצעות ידיות X ו- Y של בקר הבמה. ברגע שנמצאת אי עניין, עבור למטרה 20X והגדל את התצוגה כך שהאי תופס את רוב המסגרת. קח z-מחסנית של האי, ולאחר מכן למצוא את החלקים האופטיים הטובים ביותר שבו לתאים חיים וכל תאי החיסון שמסביב נמצאים בפוקוס.הגדר את המיקרוסקופ להקליטה במצב XYZT ומיטב את ההגדרות כדי להקליט ערימת z של השלבים שנבחרו כל 20 דקות על-פני תקופה של מספר שעות. האיים בפרוסת רקמת הלבלב דמיינו באמצעות ברייטפילד ושיקפו מיקרוסקופיה קלה. האינסולין באיים מגביר את הגרגרנות וגורם לספיגה של כמויות גדולות של אור משתקף, ומגביר את הנראות של האיים.הכדאיות של פרוסת רקמת לבלב אנושית חיה הוערכה על ידי כתמים. התאים החיים מסומנים בירוק ובתאים המתים בכחול. אינדיקטור חיובי נוסף לבישאיות הוא פעילות בזאלית נצפית.כאשר פרוסת לבלב חיה נטענת עם חיווי סידן חדיר לתא, גירוי גלוקוז נצפתה הן בפרוסות העכבר והן בפרוסות הלבלב האנושיות. הפלואורסצנטיות של תאים בודדים במהלך גירוי גלוקוז הייתה גם כימות. איונים שלמים וחולים נצפו באמצעות כתמי dithizone ומיקרוסקופיה אור משתקף.האיים החולים מתחילים לאבד צפיפות עקב חדירת תאי החיסון ומוות תאים. ניתן לזהות אוכלוסיות תאי מערכת החיסון באמצעות נוגדני CD8 וכתמים בטטרמר אינסולין. כתמים משותפים מצביעים על כך שהתאים הם תא T אפקטים שמתמקדים במיוחד באנטיגן האינסולין.הדבר הקריטי ביותר לזכור בהליך זה הוא לשמור את הפרוסות בפתרונות מעכב פרוטאז בכל עת. בעקבות הליך זה, פונקציונליות רבה בניסויים בתאי החיסון יכולה להתבצע ומאפשרת את ההשפעה של אינטראקציות תא החיסון ותפקוד האי להיות נחקר.

observing-islet-function-islet-immune-cell-interactions-live

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטות רומן בעזרת מחשב של רכש בקנה מידה גדול וניתוח של immunohistochemically דגימות הלבלב מוכתם מתוארים: (1) ללכוד Slice וירטואלי של הסעיף כולו; (2) ניתוח המוניים בקנה מידה גדול של נתונים, (3) שחזור וירטואלי Slices 2D ; (4) מיפוי 3D איון; ו (5) ניתוח מתמטי.

בסיוע מחשב ויזואליזציה בקנה מידה גדול כימות המוניים הלבלב איילט, התפלגות גודל ואדריכלות

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבידוד איים ממודל העכבר של סוכרת מסוג 2, Leprdb ופרטים על בדיקת תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין מאיים שלמים המשתמשת במיקרוסקופ 2 פוטונים.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

Ex-vivo הלבלב איון מחקרים חשובים לחקר הסוכרת. קיימות טכניקות ללמוד איונים בתרבית באדריכלות תלת-ממדי מקורי שלהם הן זמן רב, לא יעיל, הנמצאים בשימוש לעיתים רחוקות. עבודה זו מתאר שיטה חדשה, פשוט ויעיל ליצירת באיכות גבוהה פרפין מקטעי איונים תרבותי שלם.

הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח כמותי של היווצרות חלבון mitophagy במיוחד בתאי ביתא מדגימות איון האנושי העיקרי. טכניקה זו ובכך מאפשרת ניתוח של mitophagy מתוך חומר ביולוגי מוגבל, אשר חיוניים בדגימות יקרות של תא הלבלב האנושי.

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור דימות וכימות הדינמיקה סידן באוכלוסיות תאים הטרוגנית, כגון תאים איון הלבלב. כתבים פלורסנט מועברים לתוך שכבת היקפי של תאים בתוך איון, אשר לאחר מכן מאויית והתמונה, ועל ניתוח לתאים של הדינמיקה של עוצמת הניאון מבוצעת.

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

מטרת הפרוטוקול היא לעקוב באופן רציף אחר הדינמיקה של תהליך הלבלב האנושי ועל הפונדקאי התורם לעומת תאי התורם. זה מושגת על ידי השתלת איונים אנושיים לתוך התא הקדמי של העין (ACE) של NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-נמען העכבר ואחריו הדמיה חוזרת של 2 פוטין.

אורכי בהדמיית Vivo וכמת של השתלת אי הלבלב האנושי ותורם תאים מארחים בתא העין הקדמית

אנו מציגים את ההכנה של פרוסות רקמת לבלב חריפה ואת השימוש בהן במיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית לחקר דינמיקת סידן בו זמנית במספר רב של תאים חיים, לאורך תקופות זמן ארוכות, ועם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה.

מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית של דינמיקת סידן בפרוסות רקמת לבלב חריפה של עכבר

In vivo הדמיה ברזולוציה גבוהה של הלבלב היה קל עם חלון הדמיה תוך וינטלית הלבלב.

הדמיה מיוצבת של אורך ב-Vivo ברמה התאית של הלבלב במודל מורין עם חלון הדמיה תוך-וינטלית של הלבלב

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרוסות לבלב אנושיות מתורמי איברים שנפטרו כדי לחקור את תפקוד התאים בתנאים כמעט פיזיולוגיים. גישה חדשנית זו מאפשרת לחקור איים נורמליים ופגועים מבנית ואת יחסי הגומלין המורכבים בין תאים אנדוקריניים ואקסוקריניים.

יצירת פרוסות רקמת לבלב אנושית לחקר פיזיולוגיה אנדוקרינית ואקסוקרינית של הלבלב

למד את שיטת פרוסות רקמת הלבלב החי לחקירת תפקוד האיים ואינטראקציות עם תאים חיסוניים. שיטה זו שומרת על המיקרו-סביבה הטבעית ומאפשרת מחקר מחלות כמו סוכרת מסוג 1 ו-2.

התבוננות בתפקוד אי ואינטראקציות תא חיסוני איון בפרוסות רקמת הלבלב חי

גלה סרטונים נוספים