התבוננות בתפקוד אי ואינטראקציות תא חיסוני איון בפרוסות רקמת הלבלב חי

הפרוטוקול שלנו יעזור לענות על ההשפעה שיש לאינטראקציות של תאי מערכת החיסון על פונקציונליות האי. שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה מאפשרת לחקור את הפיזיולוגיה והתפקוד של האי תוך שמירה על הרקמות שבבסיס הפתולוגיות והמיקרו-סביבה הטבעית. שיטה זו יכולה לספק תובנה על תהליכי המחלה של מחלות לבלב, כגון דלקת לבלב, סוכרת מסוג I וסוכרת מסוג II.

כדי להתחיל, לסדר את הבלוקים על מחזיק הדגימה באופן כזה שהם לא יעלה על רוחב הלהב, להבטיח כי הלהב יכול לנוע קדימה המרחק הפחות אפשרי כאשר הוויברטום נע לאט. החל קו של דבק סופר על מחזיק הדגימה, מה שהופך שכבה דקה באמצעות קצה מתקן הדבק, ולאחר מכן להפוך את בלוקי הרקמה על הדבק, כך הצד הקרוב לרקמה פונה כלפי מעלה. דוחפים בעדינות את הבלוקים ומניחים לדבק להתייבש במשך שלוש דקות.

לאחר מכן, חבר את הצלחת לויברטום עם בורג והתאם את גובה הלהב ומרחק הנסיעה כך הלהב נע על פני אורך בלוקים רק בקושי מעליהם. דחף בעדינות את הבלוקים עם המלקחיים כדי לבדוק שהדבק התייבש, ולאחר מכן מלא את מגש הוויברטום בתמיסה חוץ-תאית צוננת עד שהלהב מכוסה. הגדר את הוויברטום כדי להפוך פרוסות של עובי 120 מיקרומטר ולהתחיל אותו, ולאחר מכן להתבונן הפרוסות יורד בלוקים רקמה.

הרם את הפרוסות כאשר הם צפים מהבלוק על ידי הצבת מברשת צבע או מלקחיים מתחתיהם ומניחים את הפרוסות במאגר ביקרבונט קרבס-רינגר המכיל שלושה מילימילימטרים D-גלוקוז ומעכב טריפסין. מניחים את הצלחות המכילות את הפרוסות על נדנדה ודגר בטמפרטורת החדר במשך שעה ב-25 סל"ד. אם הפרוסות צריכות להישמר זמן רב יותר, מניחים את הפרוסות ב 15 מיליליטר של תרבות פרוסה בינוני ומניחים את הצלחת באינקובטור.

לדגור על הפרוסות המוכנות ב 37 מעלות צלזיוס ללימודים באותו יום או להעביר את הפרוסות כי הם מתורבתים ב 24 מעלות צלזיוס לילה ל 37 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת לפני הניסוי. הפעילו את המיקרוסקופ לפחות שעה לפני ההקלטה ושוו את החממה העליונה של הבמה ל-37 מעלות צלזיוס. אבטחו את צלחת הפטרי התחתונה של הכיסוי המכילה את הפרוסה על הבמה.

מקד את המיקרוסקופ על-ידי הגדרת המטרה 10X במצב Brightfield ואתר את האיים באמצעות מצב השדה הבהיר על-ידי חיפוש אליפסות בצבע חום כתום בתוך הפרוסה. החלף את המיקרוסקופ להדמיה קונפוקלית על-ידי לחיצה על לחצן CS בבקר מסך המגע של המיקרוסקופ. כדי להציג את האיים באמצעות רפלקטיביות, הפעל את גלאי הלייזר 638 וגלאי PMT.

הגדר את עוצמת הלייזר בין אחוז אחד ל- 2% וכבה את מסנני החרץ. השתמש לייזר 405 ננומטר גלאי PMT כדי לצפות בכתם חומצת הגרעין. הגלאי ההיברידי לזיהוי נוגדני CD8 וגלאי לייזר והיברידי 488 ננומטר לצפייה בטטרמר האינסולין.

מרכז את האי העניין בשדה הראייה באמצעות ידיות X ו- Y של בקר הבמה. ברגע שנמצאת אי עניין, עבור למטרה 20X והגדל את התצוגה כך שהאי תופס את רוב המסגרת. קח z-מחסנית של האי, ולאחר מכן למצוא את החלקים האופטיים הטובים ביותר שבו לתאים חיים וכל תאי החיסון שמסביב נמצאים בפוקוס.

הגדר את המיקרוסקופ להקליטה במצב XYZT ומיטב את ההגדרות כדי להקליט ערימת z של השלבים שנבחרו כל 20 דקות על-פני תקופה של מספר שעות. האיים בפרוסת רקמת הלבלב דמיינו באמצעות ברייטפילד ושיקפו מיקרוסקופיה קלה. האינסולין באיים מגביר את הגרגרנות וגורם לספיגה של כמויות גדולות של אור משתקף, ומגביר את הנראות של האיים.

הכדאיות של פרוסת רקמת לבלב אנושית חיה הוערכה על ידי כתמים. התאים החיים מסומנים בירוק ובתאים המתים בכחול. אינדיקטור חיובי נוסף לבישאיות הוא פעילות בזאלית נצפית.

כאשר פרוסת לבלב חיה נטענת עם חיווי סידן חדיר לתא, גירוי גלוקוז נצפתה הן בפרוסות העכבר והן בפרוסות הלבלב האנושיות. הפלואורסצנטיות של תאים בודדים במהלך גירוי גלוקוז הייתה גם כימות. איונים שלמים וחולים נצפו באמצעות כתמי dithizone ומיקרוסקופיה אור משתקף.

האיים החולים מתחילים לאבד צפיפות עקב חדירת תאי החיסון ומוות תאים. ניתן לזהות אוכלוסיות תאי מערכת החיסון באמצעות נוגדני CD8 וכתמים בטטרמר אינסולין. כתמים משותפים מצביעים על כך שהתאים הם תא T אפקטים שמתמקדים במיוחד באנטיגן האינסולין.

הדבר הקריטי ביותר לזכור בהליך זה הוא לשמור את הפרוסות בפתרונות מעכב פרוטאז בכל עת. בעקבות הליך זה, פונקציונליות רבה בניסויים בתאי החיסון יכולה להתבצע ומאפשרת את ההשפעה של אינטראקציות תא החיסון ותפקוד האי להיות נחקר.