הכנת רשת מיקרוסקופית קריו-אלקטרון למחקרים שנפתרו בזמן באמצעות מערכת רובוטית חדשנית, Spotiton

באמצעות המערכת הרובוטית Spotiton, ניתן לערבב ולעורר חלבון בעל עניין עם שותף אינטראקציה על רשת מיקרוסקופ אלקטרונים במהירות של עד 90 אלפיות השנייה. פרוטוקול זה מאפשר לכידה של אישורי חלבון ביניים שהם ארעיים מכדי להילכד על ידי טכניקות הכנת רשת סטנדרטיות. Spotiton נפתר זמן יכול ליידע מערכות ביולוגיות או ביוכימיות תת שנייה כגון הפעלת ערוץ ממברנה, DNA או סינתזת RNA, או אינטראקציה מוקדמת של תרופה או נוגדן עם חלבון היעד שלה.

על המשתמש לנהל בו-זמנית מספר רכיבים המשפיעים ישירות על איכות הרשת. חשוב להבין את המערכת לפני השימוש ויש סבלנות בעת הכנת רשתות. כדי להתחיל, פתח את השסתום הראשי על מיכל אספקת החנקן ולהבטיח את מאגר המערכת מלא במים אולטרה-ספירה ללא גז.

הפעל את המחשב ואת מערכת Spotiton ברצועת החשמל מרובת שקעים. לחץ על סמל שולחן העבודה כדי לפתוח את ממשק המשתמש של תוכנת Spotiton. בתפריט כלים, בחר את Initialize שלבים כדי לאתחל ולבית את שלושת הרובוטים הצירים ואת הרכבת ראש מתקן מסתובב, להבטיח את טיפים מתקן מצביעים למטה לפני אתחול וביות.

בתפריט הראשי, לחץ על עבור למיקום בטוח כדי לשלוח את הרובוטים למיקום הבטוח. בכרטיסיה Aspirate, בחר Prime כדי לשטוף את ראשי המתקן מספר פעמים במים מהמאגר. ממשיכים עד שניתן לראות שני זרמי מים רצופים מגיחים מהקצוות.

בכרטיסיה בדיקה, שלח עצה אחת למצלמת הבדיקה ובדוק מי אש, תוך התאמת משרעת עד לייצור טיפות נפרדות. לחץ על לחצן הקלט בצג המצלמה העליון כדי להקליט סרטון של קצה אחד יורה. שלח את טיפ 2 למצלמת הבדיקה.

הפעל את הווידאו של קצה אחד יורה בצג בצד ימין באותו זמן קצה שני ירה בצג המצלמה העליונה, התאמת דפוס הייצור טיפה משני מכשירי. הסר את הפינצטה מההרכב על רובוט הרשת באמצעות מפתח אלן שסופק. על ספסל סמוך, מקם ננו-חוט רשת בדיקה בקצה בלוק הרשת.

תפס בזהירות את שפת הרשת ומיקם אותה כראוי בפינצטה. ואז תטען מחדש את פינצטה. בכרטיסיה Cryo, לחץ על עצה למצלמה כדי להעביר קצה אחד לשדה הראייה של מצלמת נתיב הצלילה העליונה, כדי להבטיח ש- Live נבחר בצג המצלמה העליון.

הפעל וכוון את נורית המצלמה העליונה. מקם עצה אחת הנראית בצג המצלמה העליונה, על-ידי לחיצה על העכבר בתוך הצג. לחץ על רשת למצלמה כדי למקם את הרשת מול המצלמה העליונה, ולאחר מכן להתאים שוב את קצה מיקום אחד במידת הצורך.

בכרטיסיה Cryo, ודא שרשת Vitrified לא נבחרה, לחץ על יעד התור ולאחר מכן על צלילה. להעריך את התמונות העליונות והתחתון כדי לאשר את מכשירי פועלים כרגיל. לדלל שתי דגימות לריכוז הרצוי עם חוצץ מתאים, באופן אידיאלי באמצעות אותו הדבר עבור שניהם, ולמלא את קערת קריוגן עם חנקן נוזלי.

פלזמה לנקות שלוש עד ארבע רשתות ננו-חוט באמצעות חמישה וואט מימן וחמצן, ו 1.5 דקות כנקודת ההתחלה. חבר את nebulizer ולצפות האדים לצאת היציאה המרכזית של כובע nebulizer. צפה בצג הלחות החיה בחלון הראשי או פתח את מעקב הלחות של הסביבה תחת דוחות והסביבה.

בדוק את רמות הלחות בתא ובאזורי התכריכים. מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של כל דגימה לכוסות לדוגמה. טען את כוסות הדגימה לתוך מגש ההחזקה עם מדגם עבור קצה אחד בצד שמאל עבור קצה שני בצד ימין.

ואז לדחוף את המגש בחזרה לתוך המכונה עד שהוא יושב. בכרטיסיה שאיפה, בחר שלושה מיקרו-יטריטרים כדי שאיפה של עוצמת הקול על-ידי כל עצה. ודאו שמגש הדגימה יושב בבטחה, לחצו על Aspirate והתבוננו בשלב הפיפטה מעבירים את ראשי המתקן לכוסות לדוגמה.

אמת שאיפה מוצלחת של שתי הדגימות על ידי הסרת כוסות המדגם והתבוננות בירידה ברמות הנוזל. בכרטיסיה בדיקה, שלח כל טיפ למצלמת הבדיקה כדי לאשר חלוקה ללא הפרעה. התאימו את המשרעת לפי הצורך כדי להתאים את היווצרות הטיפות מכל קצה.

טען רשת פלזמה טרייה ניקה לתוך פינצטה, אבל לא לעלות פינצטה עדיין. ודא כי רמת הלחות גבוהה לכ 90 עד 95%מלא את האתאן ולבצע אש בדיקה סופית של שני הטיפים מול מצלמת הבדיקה, המאשרת שאין חסימה. בכרטיסיה קריו, לחץ על עצה למצלמה.

תבדוק אתאן. אם נוצר קרח אתאן, להמיס לפי הצורך עם גז אתאן נוסף. הר את פינצטה עם הרשת על במת הרשת.

בכרטיסיה Cryo, לחץ על רשת למצלמה, והבטח שהקצה הראשון ממוקם כראוי בצג המצלמה העליון. לחץ על רשת Vitrified, יעד תור, ולאחר מכן לצלול. לחץ על אישור כאשר התבקש לפקד על רובוט הרשת לקפוץ את הרשת מאתאן לחנגן נוזלי ולשחרר אותו על המדף השקוע.

בדוק תמונות של הרשת כדי להחליט אם יש לשמור אותה או למחוק אותה. אם שומרים על הרשת, מלקחיים עדינים קרירים מראש, תופסים בעדינות את הרשת בקצה ומניחים אותה בחריץ תיבת רשת, החל מהחריץ הראשון משמאל לחריץ ובכיוון השעון. השתמש במציג הניסויים כדי לסקור ולהשוות את תמונות הרשת מהמצלמות העליונות והתחתונות יחד עם הגדרות המכונה ומדידות הלחות בזמן הצלילה על-ידי בחירת דוחות וניסויים.

תמונות של רשתות שהוכנו במהלך מפגש Spotiton אחד שנפתר בזמן על ידי ערבוב RNA פולימראז באוליגומר DNA זוג בסיס 105 הנושא רצף מקדם במשך 150 אלפיות השנייה לפני vitrification מוצגים כאן. מתוך שש הרשתות, רק אחת מראה פתילות תת-אופטימלית. התבנית של תצהיר קרח על רשת מנומרת תואמת באופן הדוק לתבנית הנוזל שהופקדה הנראית בתמונת המצלמה העליונה.

פתיל יעיל של הדגימות המעורבות מתרחש לאורך מוטות הרשת המכוסים ננו-חוט שבו המדגם לעתים רחוקות עולה על גדותיו לריבועים הסמוכים לאלה שבהם הוא נחת. בריבועים מלאים בקרח, הקרח הוא בדרך כלל העבה ביותר בתוך חורים במרכז הריבוע והופך דק יותר בחורים קרובים יותר לסורגי הרשת. חורים הסמוכים לסורגי הרשת הם לעתים קרובות ריקים, בשל קרבה nanowires.

הכנה נכונה וטיפול ברשתות nanowire יבטיח עובי קרח טוב על רשתות מדגם מעורב. מערכת Spotiton גם מאפשרת למשתמש להפקיד את שתי הדגימות בנפרד על רשת אחת, ומאפשרת איסוף של פקד לא מעורב במהלך אותה הפעלת תחזוקת רשת. Spotiton אפשרה לכידת המתווכים הראשונים בביטוי גנים חיידקיים בזמן אמת.

מכיוון שהם נוצרים בציר זמן של תת-שנייה, המבנים שלהם לא היו ידועים עד כה.