אגרוינוקולציה ישירה של שתילי תירס על ידי הזרקה עם וירוס פסיפס זנב שועל רקומביננטי ווירוס פסיפס קנה סוכר שיבוטים זיהומיות

פרוטוקול הזרקה מבוסס אגרובקטריום (אגרובקטריה) מוצג לחיסון של וירוס פסיפס זנב שועל ווירוסי פסיפס קני סוכר לשתילי תירס. חיסון באופן זה מוביל לזיהום ויראלי, השתקת גנים הנגרמת על ידי וירוס של גנים סמן, ו overexpression ויראלי של GFP.

פרוטוקול זה מאפשר חיסון של וקטורים ויראליים ישירות לתוך צמחי תירס שניתן ליישם בקלות ברוב הגדרות המעבדה ללא צורך בציוד מיוחד יקר. חיסון ישיר מבטל את השימוש במחשב מארח חלופי כמקור אינוקולום, וחוסך זמן ומשאבים כאחד. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על וקטורים ויראליים נוספים, קווי תירס, ואולי מינים מונוקוט אחרים.

התחל על ידי שתילת 1 עד 2 זרעי תירס במדיום גידול מבוסס כבול בתוספות קטנות להציב בתוך מגשים. מניחים את המגשים בתא גידול מתחת ל -16 שעות ביום ב 25 מעלות צלזיוס ו 8 שעות לילות ב 22 עד 25 מעלות צלזיוס, או בחממה ב 22 עד 25 מעלות צלזיוס עם 16 שעות ימים ו 8 שעות לילות. באופן קבוע מים צמחים להפרות פעם בשבוע עם 15-5-15 דשן נוזלי ב 330 חלקים למיליון ריכוז.

הכן אגרובקטריום להזרקה על ידי חיסון זן אגרובקטריום המכיל את המבנה הנגיפי הרצוי במדיה LB עם אנטיביוטיקה. לאחר מכן, לדגור בקבוקון או צינורות ב 28 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 225 סל"ד במשך 24 שעות. למחרת, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4, 000 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant.

לאחר מכן, לשטוף את הכדור עם מיליליטר אחד של מים deionized. להשעות מחדש את הכדור במיליליטר אחד של 10 מילימולר מגנזיום גופרתי פתרון, ולמדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר. ואז להתאים אותו ל 1.0.

השתמש שתילי תירס בני 4 עד 7 ימים להזרקת אגרובקטריום. להרכיב את המזרק והמחט. בעדינות להזריק את ההשעיה החיידקית 2-3 מילימטרים מעל הצומת coleoptilular עד שהוא ממלא את coleoptile, או גלוי ב whorl, ממתין על שלב הצמיחה של הצמחים.

הזרקו את כל השתילים והחליפו את המזרק והמחטים להזרקת כל מבנה. אשר זיהום פנוטיפי על ידי התבוננות נגעים מן השתקת הגנים השליטה, נגע לחקות 22 או desaturase פיטואן על העלים. השתמש בהתקן הדמיה פלואורסצנטית להקרנה מהירה של צמחים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לזהות את נוכחותו של ביטוי GFP.

בצע ניתוח ביטוי גנים לגילוי מולקולרי של זיהום. לחלץ RNA הכולל מעלים של צמחים נגועים 14 עד 21 ימים לאחר ההדבקה, ו מסונתז cDNA גדיל הראשון מסונתז כמתואר בכתב היד של הטקסט. בצע תמלול הפוך PCR כדי לאשר זיהום ולקבוע את שלמות הגן או שבר העניין הגנים באמצעות פריימרים ספציפיים המיועדים למבנים ויראליים שונים.

דמיינו את מוצר ה-PCR על ג'ל 1%agarose המכיל כתם חומצת גרעין כדי לקבוע את נוכחותם או היעדרם של וירוסים ורסיסי גן או גן. פרוטוקול זה שימש להחדרת וירוסים רקומביננטיים שתוכננו עבור גנים לשתילי תירס. כ -12 ימים לאחר ההזרקה, השתקת פנוטיפים נצפו על עלים כמו נמק והלבנת פוטו.

הנוכחות של מבנה בעלים לאחר זיהום זוהתה על ידי התבוננות בביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק תחת פלואורסצנטיות באמצעות מסנן GFP אחר. ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק עלים נגועים בנגיף זנב שועל הומחשה כאזורים קטנים של פלואורסצנטיות המופצים על פני העלים וככתמים גדולים בווירוס פסיפס קנה סוכר נגועים בעלים. באמצעות ניתוח ביטוי הגנים, זיהום וירוס פסיפס זנב שועל מערכתי אושרה והשתקה גנים או דיכוי של פיטואן דסטוראז ונגע לחקות 22 נצפתה.

המבנה השתמש גם ביעילות זיהום מושפעת. במקרה של זיהום וירוס פסיפס זנב שועל, וירוס foxtail פסיפס וקטור ריק, ו foxtail פסיפס וירוס נגע לחקות 22 בדרך כלל היו יעילות הזיהום הגבוהה ביותר ב 53% ו 54% בהתאמה. וירוס פסיפס Foxtail פיטואן desaturase ביעילות נמוכה מעט ב 39%, ו foxtail פסיפס וירוס ירוק פלואורסצנטי חלבון, ביעילות הנמוכה ביותר ב 16%בינתיים, יעילות הזיהום של וירוס קנה סוכר פסיפס חלבון פלואורסצנטי ירוק היה 8% תזמון הסימפטומים יתבססו על וקטור ויראלי קו תירס בשימוש.

חוסר פנוטיפ חזותי לא יכול להיות חוסר השתקה או ביטוי. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על טכנולוגיות עריכת גנים על ידי שיפור שיטות המסירה עבור RNAs מדריך.