בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

פרוטוקול בידוד זה של הפטוציטים של חולדה מבוסס על כריתת הכבד לפני התקרבות העיכול. הפרוטוקול מציג מערכת פרפוזיה משולבת קומפקטית וניידת לבידוד תאים. טכניקה זו כוללת מחזור קולגןאז אשר מפחית את נפח השימוש בקולגאז, ומספק גמישות רבה יותר בהארכת זמן העיכול תוך הבטחת תפוקת כבידה גבוהה ותפקוד ספציפי של הפטוציטים.

שים את החולדה במכסה המנוע. לאחר חיתוך שרירי הבטן, לדחוף את המעיים ימינה עם הגב של המלקחיים המעוקלים. שברו את הממברנה שמתחת לצינור המרה עם קצה המלקחיים המעוקלים ללולאה של התפר סביב וריד הפורטל וצינור המרה.

השתמשו בתפר כירורגי משי כדי ליצור ליגטורה רופפת מאוד סביב וריד הפורטל קרוב לכבד, רגע לפני שהווריד מסתעף שמאלה וימינה לאונות כבד שונות. כשני עד שלושה סנטימטרים במעלה הזרם של הליגטורה הראשונה, רגע לפני שווריד הקיבה מסתעף מווריד הפורטל, יוצרים חור דרך הרקמה שמתחת לווריד הפורטל עם קצות שני זוגות מלקחיים מעוקלים. לאחר מכן מתחו את החור כדי לתמוך בווריד הפורטל במהלך התותח.

מניעת הצטברות לחץ בכבד על ידי הפחתת מהירות המשאבה לארבעה סל"ד לקצב זרימה של כשלושה מיליליטר לדקה. וודאו שהזרימה החוצה של המאגר נטול הסידן מהקטטר התוך ורידי מצטמצמת לטפטוף איטי. תוך כדי תמיכה עדינה בווריד הפורטל עם מלקחיים, החזיקו את הצנתר התוך ורידי כששיפוע המחט פונה כלפי מעלה.

ולהכניס את המחט לווריד הפורטל בזווית של 10 עד 20 מעלות. ואז לאט לאט להתקדם עד שכל השיפוע נמצא בתוך הווריד. הכנסה נכונה אמורה לגרום לצביעת צבע הכבד.

מקדמים את הצינורית מעל המחט, ומחזירים את המחט שמאחורי הצינורית על ידי משיכת הכנף לאחור עם האצבע המורה תוך החזקת הצנתר עם האגודל והאצבע האמצעית. מאבטחים את וריד הפורטל על הצנתר באמצעות קליפס וריד וגוזר מתחת לווריד הפורטל כדי למנוע הפרעה בזרימה. לאחר מכן, חותכים את הווריד הנבוב התחתון התת-היפטי כדי למנוע את הצטברות הלחץ בכבד, ומתבוננים בדחפים המדרבנים את הדם כדי להבטיח את החתך הנכון.

הגדל את מהירות המשאבה ל-38 סל"ד לקבלת קצב זרימה של כ-33 מיליליטר לדקה. ולשטוף את הכבד שלוש פעמים על ידי סגירת הווריד הנבוב התחתון האינפרא-היפטי עם מלקחיים למשך שתיים-שלוש שניות, ואז לפתוח אותו מחדש. על מנת לחדור את כל אונות הכבד, להתאים את המיקום של קצה הצינורית ולוודא כי הוא ממוקם לפני וריד הפורטל מסתעף לאונות כבד שונות.

לאחר מכן, הדקו את הליגטורה הרופפת סביב וריד הפורטל, מעט במעלה הזרם של נקודת ההסתעפות, והבטיחו את מיקום הצינורית בווריד הפורטל כדי למנוע זרימה אחורית של החיץ על ידי יצירת שלושה קשרים בנקודה שבה המחט הקשה תומכת בצינורית, בין הצינורית לחור הצדדי. לאחר כריתת הכבד לאפשר לכבד להחדיר עם חיץ ללא סידן במשך 12 דקות. לאחר מכן, הדקו את מהדק הרולר של חיץ ללא סידן ושחררו את מהדק הרולר של מאגר הקולגאזאז כדי לשנות את מאגר הזלוף.

לאחר שחיץ הקולגאז מגיע לכבד, שטפו את הכבד שלוש פעמים על ידי סגירת הווריד הנבוב התחתון הסופרהפטי למשך שתיים עד שלוש שניות ופתיחתו מחדש. הזיזו בזהירות את הכבד לשלב שמעל הכוס לצורך סירקולציה של חיץ הקולגאז על ידי החזקת הסרעפת עם מלקחיים תוך תמיכה בצנתר, תוך הקפדה שלא למשוך את הצנתר כדי למנוע ניתוק מקרי. מעכלים את הכבד במשך 12 דקות, ומפסיקים את הזלוף כאשר הכבד מאבד את המרקם החום החלק שלו והופך לעיסה.

להאריך את זמן העיכול במידת הצורך. לאחר העיכול של הכבד לחתוך את וריד הפורטל בזהירות להסיר את צינורית. ואז להעביר את הכבד לתוך DMEM קר כדי לבודד את hepatocytes.

יש להקיש בעדינות על הכבד באמצעות הישבן של המלקחיים המעוקלים כדי לשבור ולקלף את כמוסת הבוהק. ושחררו את תאי הכבד על ידי הסטה עדינה של הכבד ב-DMEM עד שהתאים יתנתקו לחלוטין בתקשורת. הכדאיות של הפטוציטים הייתה בין 88 ל -94.8% כפי שנקבע על ידי טריפ וספירה כחולה.

התשואה של הפטוציטים מחולדות במשקל 200 עד 300 גרם הייתה עד פי חמישה 10 עד התאים השמיני לכל בידוד. התמונות הייצוגיות מציגות תרחיף תאי כבד לא מנוצלים ותרחיף הפטוציטים מטוהר. טוהר ההפטוציטים המבודדים היה כ-96.8%, אשר כומת על ידי ספירת תאים מוכתמים פלואורסצנטיים חיוביים לאלבומין ביחס למספר הכולל של גרעיני התאים.

בתמונות המייצגות המוצגות בצבע כוזב, ירוק מייצג את האלבומין, וכחול מציין את גרעיני התא עם אלבומין. גרעיני תאים ללא אלבומין מודגשים באדום. ההפטוציטים בתרבית הכריך יצרו קנאליקולי מרה מובחן, והיה להם מגע טוב עם תאי התא.

כפי שמוצג על ידי מבחני אלבומין, אוריאה וציטוכרום P450, הפטוציטים הפגינו הפרשת אוריאה ואלבומין גבוהה. ביום השלישי, הפטוציטים הפגינו פעילות אנזימים גבוהה עבור CYP1A2, CYP2B1/2 ו-CYP3B2. היו מוכנים נפשית לפני הכנסת המחט לווריד הפורטל.

עם ההחדרה, המנתח יצטרך להמשיך ללא דופק עד שמהירות המשאבה הוגברה לאחר חיתוך ה- IVC.