שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

מחקרים אלה שואפים לספק מערכות מודל חזקות לשחזור כדי לבצע מחקרים ספציפיים אוריינטציה של אפיתל המעי. אורגנואידים אפיים יכולים להיווצר במספרים גבוהים ולהבטיח הקרנת תפוקה גבוהה. קל יותר לתמרן את המונוליירים ומציעים גישה לסימנים אפיים ובזליליים כאחד.

ודא כי גודל organoids הוא 150 עד 250 מיקרומטר קוטר לפני תחילת פרוטוקול היפוך. הסר בזהירות ולהשליך את המדיום מכל באר המכילה organoids מבלי לשבש את כיפת ECM. מוסיפים מיליליטר אחד של תמיסת דיסוציאציה קרה כקרח לכל באר ודגר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.

בזהירות להוציא את הכיפות על ידי צנרת לאט עם קצה מצופה, דואג לא לשבש ולפצל את organoids. מעבירים את ההשעיה האורגנוידית לצלחת המטופלת בתמיסה נגד הדבקה ומניחים את הצלחת על שייקר בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות להסיר את הצלחת בעדינות pipette את הפתרון למעלה ולמטה באמצעות קצה פיפטה מיליליטר אחד מצופה פתרון אנטי דבק.

מניחים את הצלחת על השייקר בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות. הסר את הצלחת ולתת organoids להתיישב על ידי כוח המשיכה במשך 1 עד 2 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר organoids להתיישב, להסיר כמה שיותר של פתרון דיסוציאציה ככל האפשר לשטוף אותם על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של DMEM F-12.

אפשר לאורגנואידים למכתם ולהסיר את הסופר-טבעי. ואז לחזור על הכביסה. הסר כמה שיותר של DMEM F-12 ככל האפשר ולהוסיף 0.5 מיליליטר של מדיום הרחבת organoid מעיים.

דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת לבצע שינוי בינוני חלקי על ידי הטיית הצלחת בזווית של 25 עד 30 מעלות והסרת בינוני לאורך קיר הבאר דואג לא להסיר organoids מושעה. הוסף 0.4 מיליליטר של התפשטות organoid מעיים בינוני ודגורה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים.

אם נוצרו אגרגטים השתמש בקצה פיפטה מיליליטר אחד מצופה בתמיסה אנטי דבקה כדי לגטות את האגרגטים על ידי צנרת למעלה ולמטה 20 פעמים תוך לחיצה על קצה הקצה לתחתית הצלחת. הוסף מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין-EDTA מחומם מראש כדי resuspend organoids. ומערבבים ביסודיות כדי להבטיח השעיה אחידה.

הוסף עד מיליליטר אחד נוסף של טריפסין-EDTA עבור מספר רב של תאים, או אם כמות משמעותית של ECM נשאר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד 10 דקות, ולאחר מכן לערבב ביסודיות עם פיפטה מיליליטר אחד כדי לשבש את organoids כך שהם מנותקים לחלוטין לתאים בודדים או שברים קטנים. כדי לנתק לחלוטין שברים או organoids שלם להמשיך את הדגירה עם טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס עוד שלוש עד חמש דקות.

לאחר organoids הם מנותקים מספיק להוסיף נפח שווה של DMEM F-12 ו pipette למעלה ולמטה לערבב ביסודיות. הפעל את טריפסין-EDTA על-ידי הוספת 10%FBS לתאים. שברי צנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס.

אם האורגנוידים המנותקים לא הצליחו לבלבל את התאים ביסודיות על ידי צנרת למעלה ולמטה וצנטריפוגה אותם שוב. הסר בזהירות כמה שיותר על-טבעי ככל האפשר. משאיר רק את גלולה התא.

Resuspend התאים ב 100 microliters של מדיום בידול אורגנויד מעיים עבור כל באר להיות זרע. כוונון אמצעי האחסון בהתאם לגדלי באר גדולים או קטנים יותר. הסר את הצלחות מצופות מן האינקובטור ולהסיר את תמיסה מטריצת קרום המרתף עודף מכל באר.

הוסף 100 מיקרוליטרים של השעיית התא לבאר העליונה של כל תוספת תרבית תא ו -500 מיקרוליטרים של בידול אורגנויד במעיים מדיום לבאר התחתונה. ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. החלף את המדיום הן בבאר העליונה והן בבאר התחתונה כל יומיים עד שלושה ימים.

כדי להקים תרבית ALI להסיר מדיום מן הבאר העליונה והתחתון, ולהוסיף בינוני בידול אורגנויד מעיים טריים לבאר התחתונה משאיר את הבאר העליונה ריקה. האורגנוידים במעיים עם מדיום הרחבת אורגנויד במעיים הציגו מורפולוגיה ציסטית. כאשר ECM מוסר כמה organoids נוטים לצבור במהלך שלושת הימים הראשונים צריך להיות שף ב כדי להגדיל את מספר organoid.

אורגנוידים מעיים בתרבית ECM המשיכו להתרחב ולהציג היווצרות ספונטנית של מבנים ניצנים משניים. Organoids נשמר במשך חמישה ימים בהיעדר מטריצה חוץ תאית הציג צורות מוארכות, ציסטיות, ולא סדיר. הביטוי של סמנים לא טיפוסיים, כגון villin ו- ZO-1 זוהה בצד החיצוני של האפיתל שנחשף למדיום.

אורגנוידים משובצים ECM מוכתמים בגרעין, villin ו- ZO-1 המדגימים קוטביות בזאלית אפית שבה הצד האפילי פונה ללומן של האורגנויד. ברגע שהוקם המונו-שכבתית נוצרו תאים צמתים הדוקים ושכבה ממפגשית. השכבה המשתלבת מכוונת גם את הווילין שלה המכיל גבול מברשת לכיוון הצד האפיקלי של האפיתל, ויוצרת מתחמי חלבון רב-חלבונים ZO-1 בין התאים.

מעבר לתרבות ALI גרם לבידול נוסף עם תאי גאבל בולטים יותר אשר היה דמיוני על ידי כתמים עבור חלבון mucin המופרש MUC2 כדי לגרום היפוך הקוטביות זה חיוני כדי להסיר את כל ECM מבלי לשבש או פיצול organoids. שינויים בתקשורת צריכים להיעשות גם בזהירות כדי למנוע הסרת כל organoids מושעה. הבטחת כי ישנם תאים בודדים מספיקים להקמת תרבות monolayer הוא דטרמיננטה מרכזית של איכותה.

פונקציות ספציפיות אפיות כגון ספיגת חומרים מזינים או אינטראקציות פתוגן מארח יכול עכשיו הוא למד במערכות רלוונטיות שמתאימות לצרכים של החוקרים.