כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים
4 באפריל 2021
פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.
פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לנצל כלים כימיים וגנטיים זמינים כדי לחקור את המנגנונים של התחדשות הכבד בדגי זברה. כריתת הפטקטומיה חלקית מאפשרת הסרה מדויקת של רקמות כדי לעורר התחדשות הכבד ללא צורך בהשפעות בכל הגוף של פגיעה בכבד רעיל. רק על ידי הבנת המנגנונים המולקולריים והתאים של התחדשות הכבד נוכל לעצב טיפולים חדשים לטיפול בחולים עם מחלת כבד מתקדמת.
כדי להתחיל, להסיר את הדגים ממיכל Tricaine באמצעות מלקחיים ולהטמיע אותם בחריץ של ספוג ספוג Tricaine עם הצד הגחוני למעלה. לאחר מכן מניחים את הספוג תחת מיקרוסקופ ניתוח עם תאורה מלמעלה למטה. לצבוט את העור ואת קשקשים רק אחורי ללב עם מלקחיים עדינים וליצור חור בחלל הגוף על ידי ביצוע חתך מתחת למלקחיים עם מספריים טעון האביב.
לסובב את הספוג ולעשות חתך שלושה עד ארבעה מילימטר לאורך הבטן על ידי חיתוך posterially לכיוון סנפירי האגן. ואז לסובב את הספוג בחזרה. לסחוט את הצדדים של הספוג ביד אחת כדי לכפות את האיברים הקרביים מתוך חלל הגוף.
האונה הגחונית של הכבד נמצאת על גבי המעי, והכבד הוא מבנה ורוד או כתום הפרוס על פני המעי החום הזהוב, וניתן לדמיין אותו בבירור עם פלואורסצנטיות CFP. לסחוט את המלקחיים העדין, כך tines נוגעים זה בזה ולהחליק את הפחיות בין הכבד והמעי. ואז לאט להפריד את הפחיות כדי לשבור את קבצים מצורפים וריד הפורטל בין הכבד והמעי.
חזור על תהליך זה עד שכל קשרי הפורטל בין הכבד למעי נותקו, ולמשוך את האונה הגחון מהמעי באמצעות מלקחיים עדינים. חותכים את האונה הגחונית חופשית משאר הכבד. בדיקה של החיה עם פלואורסצנטיות CFP מראה כי האונה הגחונית הוסרה.
בסיום, מעבירים בזהירות את הדגים מהספוג למיכל המכיל מי מערכת ומזרים את מי המערכת מעל הזימים לכמה דקות עד שהדגים מתאוששים ושוחים בכוחות עצמו. לאחר המתת חסד של הדג, להסיר אותו ממי קרח. מניחים אותו בחריץ של ספוג עם הצד הגחון למעלה ולעשות חותך של דופן הגוף הגחון בעמדה האחורית הקדמית של הלב.
לאחר מכן בצע שני חותכים נוספים משולי ההסתעפות הראשונות המרוצות לאורך הציר האחורי הקדמי לסנפירי האגן, ומקלפים את העור והשריר כדי לחשוף את האיברים הקרביים. כעת ניתן לדמיין את האיברים הקרביים עם מיקרוסקופיית שדה בהירה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. התאוששות הכבד לאחר כריתת הפטקטומיה חלקית הוערכה על ידי חישוב יחס משקל הכבד לגוף, שהיה 1.8% לגברים ו -3.3% עבור נקבות.
יחס משקל הכבד לגוף של שני המינים נקבע ביום אפס שלאחר הניתוח, וביום השביעי בבקרות החלקיות של כריתת הפטקטומיה והזיוף. ביום האפס שלאחר הניתוח, לבעלי חיים מזויפים יש אונה גחונית גלויה, אך בבעלי חיים כריתת הפטיקטומיה חלקית, האונה הגחונית נעדרה לחלוטין, מה שגרם לירידה של 30% בזכרים ולירידה של 20% ביחסי משקל הכבד לגוף. ביום השביעי שלאחר הניתוח בבעלי חיים כריתת חציית חלקית, האונה הגחונית לא התחדשה, ויחסי משקל הכבד לגוף בבקרות כריתת חזה ושיפוף חלקיות היו דומים, מה שמצביע על כך שמסת כבד שחזרה לאחר כריתת חזה חלקית.
השפעת הזמן על התחדשות האונה הגחונית נקבעה על ידי ביצוע כריתת hepatectomy חלקית מלאה 1/3 ומדידת האונה הגחונית ליחס אורך המעי. האונה הגחונית כבשה 50 עד 100% מאורך המעי בבקרת זיוף, אך צומצמה קשות ב 1/3 בעלי חיים כריתת חלק. בעלי חיים כריתת חלק ביום שלאחר הניתוח 36 היה יחס גחוני למעי מוגבר בהשוואה ליום הראשון שלאחר הניתוח.
הגדלה משמעותית סטטיסטית של האונה הגחונית נצפתה בבעלי חיים המתאוששים מהפטיקטומיה חלקית ביום 36 שלאחר הניתוח בהשוואה ליום הראשון, אך לא בבקרות מזויפות. חלק מבעלי החיים חידשו את האונה הגחונית, אך חלקם לא עשו זאת, מה שמצביע על שונות בתגובת הניתוח. החלק הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא להפריד באופן נקי את הכבד ואת המעי, כך האונה הגחון ניתן להסיר לחלוטין.
כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה יכולה להתבצע בקווים מוטנטיים או מהונדסים כדי לומר את הדרישות הגנטיות להתחדשות הכבד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט וניתן לשחזור לביצוע כריתה חלקית של הכבד (partial hepatectomy) בדגי זהב בוגרים, המאפשרת מחקר מדויק של התחדשות הכבד. השיטה מאפשרת לחוקרים לבחון את המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס צמיחתו מחדש של הכבד, תוך שימוש בדג הזהב כאורגניזם מודל בעל רלוונטיות קלינית ישירה למחלות כבד בבני אדם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה רגנרטיבית
- פיזיולוגיה של הכבד
- מערכות מודל של דגי זברה
רקע
- כשל כבדי הוא בעיה בריאותית עולמית מרכזית, עם עלייה בשיעורי התמותה ממחלות כבד כרוניות.
- כבדים בריאים יכולים להתחדש לאחר פגיעה, אך יכולת זו פגומה במחלות בשלבים מתקדמים.
- דגי זברה מהווים מודל רב-עוצמה לחקר התחדשות איברים, כולל צמיחה מחדש של הכבד לאחר כריתה חלקית של הכבד (partial hepatectomy).
- הפרוטוקולים הקיימים לכריתה חלקית של הכבד בדגי זברה משתנים, מה שמוביל לתוצאות לא עקביות.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור לכריתה חלקית של הכבד בדגי zebrafish בוגרים.
- הדגמת היכולת של zebrafish ל 재생רציה של נאח הכבד שהוסר.
- מתן פלטפורמה למחקר נוסף של מנגנונים גנטיים ומולקולריים של רגנרציה של הכבד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דגי זברה בוגרים מושכבים תחת הרדמה עם הצד הגחוני כלפי מעלה על ספוג ספוג ב-Tricaine.
- מבוצעת חתך מדויק כדי לגשת לכבד, ואת האונה הגחונית מפרידים בזהירות מהמעי ומסירים.
- ההחלמה לאחר הניתוח מנוטרת, וההתחדשות של הכבד מוערכת באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה.
- יחסי המשקל של הכבד למשקל הגוף ויחסי האורך של האונה הגחונית למעי נמדדים בנקודות זמן שונות לאחר הניתוח.
תוצאות עיקריות
- כריתה חלקית של הכבד מובילה להפחתה ראשונית משמעותית ביחס שבין משקל הכבד למשקל הגוף (30% בזכרים, 20% בנקבות).
- עד ליום ה-7 לאחר הניתוח, מסת הכבד משתקמת במידה רבה, עם יחסים הדומים לאלה של קבוצות הביקורת (sham).
- התחדשות של האונה הבטנית נצפתה בחלק מהבעלי החיים, אך לא בכולם, עד ליום ה-36 לאחר הניתוח, מה שמעיד על שונות בתגובה הרגנרטיבית.
- הפרוטוקול מאפשר יישום בשורות מוטנטיות או טרנסגניות של דגי זבראפיש (zebrafish) כדי לבחון דרישות גנטיות לתהליך ההתחדשות.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר כריתה חלקית מדויקת וניתנת לשחזור של הכבד בדגי זהב בוגרים.
- דגי זהב מסוגלים להצמיח מחדש רקמת כבד לאחר הסרה כירורגית של האונה הוונטרלית.
- השיטה מקלה על ביצוע מחקרים מפורטים של המנגנונים השולטים בהצמחה מחדש של הכבד, עם השלכות פוטנציאליות לפיתוח טיפולי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
כריתה חלקית של הכבד בדגי zebrafish בוגרים מספקת מודל כמותי הניתן לשחזור לבחינת מנגנוי רגנרציה של הכבד הרלוונטי למחלות בבני אדם. פרוטוקול זה מאפשר הסרה מדויקת של רקמה והערכה של הרגנרציה, ובכך תומך בתיקוף של מטרות ובצמצום סיכונים מנגנוניים בשלבי הגילוי המוקדמים. תאימותו לכלים גנטיים וכימיים ממצבת אותו כתהליך עבודה בסיסי למחקר פרה-קליני בביולוגיה של הכבד.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה מונחית-השערות של מסלולי התחדשות בעקבות פגיעה מבוקרת בכבד.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות גנטיות או פרמקולוגיות המשפיעות על צמיחה מחדש של הכבד.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד תגובות התחדשות מרעילות סיסטמית.
- מספק נקודות קצה כמותיות לצורך מיון תיקי פיתוח ותעדוף מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס מודל פגיעה סטנדרטי וניתן לשחזור לצורך סריקת תרכובות או סריקה גנטית בהמשך.
- מספק פלטים כמותיים, כגון יחס בין משקל הכבד למשקל הגוף ויחס בין האונה למעי, לצורך פיתוח הבדיקה.
- מאפשר הערכה ניתנת לשחזור של יכולת התחדשות בין קבוצות ניסוי שונות.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה בקווי דגי zebrafish טרנסגניים או מוטנטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה אחד עם נקודות סיום רגנרטיביות רלוונטיות למחלה לצורך חקירת סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- מספק רצף מהשלב של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מנגנוני רגנרציה.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי התקדמות מותאמת סיכון, המבוססות על מדדי רגנרציה כמותיים.
- תומך בהפחתת סיכונים חזויה עבור אסטרטגיות טיפוליות המכוונות לכבד.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהוא מאפשר פגיעה מבוקרת, הערכה כמותית של התחדשות, ובדיקה גנטית או פרמקולוגית במודל של חולית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובהבהרה של מסלולים עבור התחדשות הכבד.
- סריקה: מספקת מודלים של פגיעה הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה עם פלטים כמותיים.
- אנליטיקה: מספקת נקודות סיום מדידות, כגון יחס משקל כבד למשקל גוף ויחס אונה למעי, לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאי הגילוי לאישור פרה-קליני במערכת רלוונטית למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר למחקרים גנטיים, כימיים ומכניסטיים בביולוגיה של הכבד.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי התחדשות כבד.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הערכת הפגיעה וההתחדשות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים ביולוגית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות לרפואה רגנרטיבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בדגי זברה (zebrafish), במיקרו-כירורגיה ובטיפול לאחר ניתוח.
- דורש גישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ולתשתית דימוג כמותית.
- מחייב סטנדרטיזציה של נהלים כירורגיים ואנליטיים בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה לרקעים גנטיים שונים ולקווי טרנסגניקה לצורך מחקרים מכניסטיים.
- תלוי בהפרדה מדויקת של רקמות כדי להבטיח תוצאות רגנרטיביות הניתנות לשחזור.
