Name: כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: למד כיצד לבצע כריתת כבד חלקית בדגי זברה מבוגרים לחקר מנגנוני התחדשות הכבד. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מדויק ושחזור רקמת כבד עם רלוונטיות קלינית למחלות כבד אנושיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

I.M.O. נתמך על ידי NIAAA (F32AA027135). W.G. נתמך על ידי R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870, ואת תוכנית קלאודיה אדמס בר למצוינות בחקר הסרטן. וו.ג'י הוא חוקר מכון פיו במדעי הביו-רפואה.

דגי זברה גדלו וגדלו על פי הנהלים הרגילים. הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים בריגהם ונשים (2016N000405). דגי זברה בוגרים צמו במשך 24 שעות לפני תחילת הפרוטוקול. מי מערכת מתייחסים למים במיכלי דיור דגי זברה במתקן הימי.
1. הכנה ומרדים
<ol><li>הכן 0.016% פתרון Tricaine במי מערכת. זהירות: טריקאין הוא מגרה אם הוא בא במגע עם העיניים, העור או דרכי הנשימה.</li>
	<li>הכן ספוג להחזיק דג זברה מרדים במהלך פרוטוקול הניתוח. חותכים ספוג מלא לרבעים. באמצעות סכין גילוח, להסיר טריז דק של ספוג שפועל במקביל לציר הארוך של רובע הספוג.<ol>
<li>החריץ צריך להיות ארוך מספיק כדי להכיל דג בוגר (זה ישתנה בין גדלים שונים של דגים). לדוגמה, עבור דג מבוגר 35 מ"מ אורך, אורך החריץ צריך להיות 20 מ"מ. הראש והגוף מוחזקים בספוג, אבל הזנב עובר את קצה הספוג(איור 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>השרו את הספוג בתמיסת טריקאין 0.016%.</li>
	<li>יש למקם דגי זברה בוגרים (זכר או נקבה) ב-625 מ"ל של פתרון טריקאין 0.016%.</li>
	<li>דגירה במשך 6 דקות או עד שהדגים לא מגיבים למגע.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים, הסירו בזהירות את הדגים ממיכל ה-Tricaine והניחו את צד גחון הדגים למעלה בחריץ הספוג (איור 1A - B).</li>
	<li>מניחים את הספוג מתחת למיקרוסקופ ניתוח עם תאורה מלמעלה למטה.</li>
</ol>2. ניתוח
<ol><li>בעזרת מלקחיים עדינים, צבוטו את העור וקשקשו בממצע, רק אחוריים ללב(איור 1B).</li>
	<li>באמצעות מספריים קפיץ טעון, לעשות לחתוך מתחת למלקחיים כדי ליצור חור בחלל הגוף(איור 1C - D). יש להקפיד לא לפגוע בלב או בכלי דם גדול, שכן הדבר יגרום לתמותה מוגברת.</li>
	<li>באמצעות מספריים קפיץ טעון, לבצע 3-4 מ"מ הפחתת לאורך הבטן, עיבוד אחורי עד ההסתעפות מגיע סנפירי האגן(איור 1D - E). בשלב זה, האונה הגחונה של הכבד עשויה להיות גלויה דרך ההסתה.</li>
	<li>לסחוט את הצדדים של הספוג ביד אחת כדי לכפות את האיברים הקרביים מתוך חלל הגוף. האונה הגחונה של הכבד תהיה גלויה על גבי המעי(איורים 1F,2A-B). הכבד יופיע כמבנה ורוד או כתום הפרוס על פני המעי החום-זהוב. בעלי חיים המוגדרים כבקרה מזויפת נמצאים בשלב זה.</li>
	<li>סוחטים את המלקחיים העדינות כך ששני הפחיות נוגעות ללב. תוך שמירה על לחץ על הספוג, החלק את הפחיות של המלקחיים העדינות בין הכבד למעי(איור 1G). יש להקפיד לא לנקב את המעי, שכן זה יגרום לתמותה מוגברת.</li>
	<li>לאט לאט הלחץ על המלקחיים, כך שהקישוטים מתרחקים זה מזה(איור 1H). פעולת הזזה זו מנתקת את ההחזקות הרבות של וריד הפורטל בין האונה הגחונית למעי (איור 2B), ויש צורך להסיר את האונה הגחונית. חזור על תהליך זה עד שכל קשרי הפורטל בין הכבד למעי נותקו.</li>
	<li>לקלף את האונה הגחונית מהמעי באמצעות מלקחיים עדינים לחתוך את האונה הגחונית חופשי משאר הכבד(איור 1I).</li>
	<li>הליך זה גורם לכריתת הפטיקטומיה חלקית שליש (איור 1J).</li>
</ol>3. התאוששות
<ol><li>בזהירות להסיר את הדג מן הספוג ומניחים אותו במיכל של מים מערכת.</li>
	<li>מערכת פיפטה מים מעל הזימים במשך כמה דקות עד שהדגים שוחים בכוחות עצמם(איור 1K).</li>
	<li>יש לנטר דגים במשך 2-4 שעות לפני שתחזיר אותם למערכת. אין להאכיל את הדגים במשך 24 שעות מלאות לאחר הניתוח.</li>
	<li>נטר דגים מדי יום למשך הניסוי.</li>
	<li>עם הזמן, ההסתה בקיר הגוף תחלים באופן טבעי ללא צורך בתפרים(איור 1L,2C).</li>
</ol>4. ניתוח אורך האונה הגחונית למעי
<ol><li>המתת חסד כל בעלי החיים המיועדים לניתוח במי קרח במשך 10 דקות עד שכל התנועות האופרקולריות ייפסקו.</li>
	<li>מוציאים את הדג ממי קרח ומניחים אותו בצד הגחון למעלה בחריץ של ספוג.</li>
	<li>באמצעות מספריים קפיץ טעון, לעשות חותך בקיר הגוף הגחון בעמדה הקדמית-אחורית של הלב. לאחר מכן בצעו עוד שני חותכים לאורך הציר הקדמי-אחורי מהחתיכה הראשונה כל הדרך לסנפירי האגן. (איור 2A).</li>
	<li>לקלף את העור ואת השריר כדי לחשוף את איברי הקרביים (איור 2A).</li>
	<li>לרכוש תמונות שדה בהיר ופלואורסצנטי של איברי הקרביים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. שדה ראייה זה יכלול את האזור שבו נפלטה האונה הגחונית. מכיוון שבעלי חיים מורדמים לפני הניתוח, ניתוח מסוג זה מונע הדמיה ארוכת טווח של אותם דגים.</li>
</ol>5. ניתוח יחס משקל כבד לגוף
<ol><li>המתת חסד כל בעלי החיים המיועדים לניתוח במי קרח במשך 10 דקות עד שכל התנועות האופרקולריות ייפסקו.</li>
	<li>מניחים דגים בצינור חרוט 50 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 25 מ"ל של 4% paraformaldehyde ב 1x PBS ו 0.3% Tween לצינור. זהירות: פורמלדהיד רעיל, ופתרונות המכילים פורמלדהיד תמיד צריכים להיות מעובדים במכסה כימי.</li>
	<li>אגוזים ל-48 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בצע ארבע כביסות של 10 דקות ב- PBS 1x ו- 0.3% Tween.</li>
	<li>יש לאחזר דגים עם מלקחיים, ולהכתים יבש על מגבת נייר.</li>
	<li>תקליט את המשקל של כל הדג.</li>
	<li>באמצעות מספריים קפיץ טעון, לעשות חותך בקיר הגוף הגחון בעמדה הקדמית-אחורית של הלב. לאחר מכן, לעשות עוד שני חותכים לרוץ לאורך הציר הקדמי-אחורי מן החותך הראשון כל הדרך לסנפירי האגן. (איור 2A).</li>
	<li>לקלף את העור ואת השריר כדי לחשוף את איברי הקרביים (איור 2A).</li>
	<li>לרכוש תמונות שדה בהיר של הכבד באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות.</li>
	<li>לנתח את הכבד, מניח את חתיכות הכבד על סירת שקילה.</li>
	<li>להקליט את המשקל של הכבד.</li>
</ol>

<ol><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li>
<li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+it+new+again%3A+insight+into+liver+development%2C+regeneration%2C+and+disease+from+zebrafish+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li>
<li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li>
<li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li>
<li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li>
<li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li>
<li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF%CE%B2+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li>
<li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979(2015).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizational+principles+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22The+Liver%3A+Biology+and+Pathobiology%3A+Fifth+Edition%22%5BJournal%5D)">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

ההבדלים האנטומיים בין דגי זברה למודלים של יונקים להתחדשות הכבד מציבים אתגרים ייחודיים לפירוק הכבד. הכבד בדגי זברה נמצא בסמיכות ללב והמעי; פגיעה בשוגג בכל איבר גורמת לתמותה מוגברת. כבד דג הזברה אינו עטוף, מה שמקשה על הנפרדות מהמעי. הכבד מקבל דם עשיר בחומרים מזינים מהמעי דרך ורידים פורטל. ביונקים, ורידים עוזבים את המעי מתכנסים על וריד פורטל ראשוני כי לאחר מכן מתפצל כפי שהוא נכנס לכבד12. לעומת זאת, כבד דג הזברה מקבל את זרימת הדם של הפורטל מסדרה של כלי שיט זעירים שעוברים ישירות מהמעי אל הכבד<strong cl...

בין האיברים המוצקים בבני אדם, הכבד הוא האיבר היחיד המסוגל התחדשות1. זה קריטי, כמו הכבד הוא איבר חיוני, אחראי על פונקציות מטבוליות מפתח, אחסון אנרגיה, ניקוי רעלים בדם, הפרשת חלבוני פלזמה, וייצור מרה2. Hepatocytes שאבדו עקב נזק רעיל או דלקתי מוחלפים בעיקר באמצעות חלוקה של הפטוציטים הנותרים1. מודל ניסיוני קלאסי אחד לחקר התחדשות הכבד הוא כריתת כבד חלקית, שבה אונות בודדות של הכבד מוסרות, ומשאירות את האונות הנותרות שלמות3. הליך זה פותח בתחילה בחולדות, שבהן כשני שלישים ממסת הכבד מוסרים. לאחר כריתת הפטקטומיה חלקית ביונקים, התחדשות מפצה מתרחשת באונות הנותרות עד שהכבד משחזר את המסה הראשונית שלו. ראוי לציין כי כבד היונקים אינו מחליף את האונות החסרות.
דג זברה(דניו ריו)מייצג מודל מתיחה לחקר התחדשות איברים למבוגרים4. כבד דג הזברה, בעודו שונה מבנית מהכבד היונקים, מורכב מאותם סוגי תאים ומשרת את אותה פונקציה כמו ביונקים2. הוא מורכב משלוש אונות, עם שתי אונות הגב ואונה גחונית אחת המשטחות לאורך המעי. כריתת הפטקטומיה חלקית בוצעה בעבר בדגי זברה, עם תיאורים סותרים לגבי מצב ההתחדשות המדויק. בדרך כלל, שליש כריתת hepatectomy חלקית מבוצעת על ידי הסרת האונה הגחוני כולו. דיווחים ראשוניים הצביעו על כך שלאחר הסרת האונה הגחונית, הוא התחדש במלואו בתוך שבוע5,6,7, מה שמצביע על כך שבניגוד לכבד היונקים, כבד דג הזברה מסוגל להתחדשות אפימורפית. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי הסרת האונה הגחונית הביאה להתחדשות מפצה באונות החזיר, ולא להתחדשות האונה הגחונית החסרה, ובסופו של דבר להתאוששות של מסת הכבד בתוך שבוע8,9. פרופיל תמלול של האונות הגעשיות בעקבות כריתה של האונה הגחונית חשף שינויים משמעותיים הקשוריםהתחדשות מפצה 10. בהתחשב בכך שמצב התחדשות הכבד יכול להשתנות עם היקף הפציעה8, שיערנו כי הפערים בתוצאות עשויים להיות עקב שונות טכנית בפרוטוקול כריתת ההפטיקטומיה החלקית בין קבוצות מחקר.
פרוטוקול זה מתאר הליך לביצוע כריתת הפטיקטומיה חלקית שליש על דגי זברה בוגרים על ידי הסרת האונה הגחונית. טכניקה זו תהיה בעלת ערך להערכת מנגנונים של התחדשות הכבד.

<table><tbody><tr><td>16% תמיסה מימית פרפורמלדהיד,</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td> בדרגת EM <td>15700</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה פלקון, פוליפרופילן,</td><td>קורנינג</td> סטרילי <td>352098</td><td></td></tr><tr><td>AS 82/220.R2 PLUS איזון אנליטי</td><td>סולם מצב מפרץ & מערכות, בע"מ</td><td>WL-104-1051</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 מלקחיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>EMS Kuehne Coverglass/דגימה מלקחיים</td><td>מיקרוסקופ אלקטרונים מדעי</td><td>72997-07</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td><td></td></tr><tr><td>Mastertop Cellulose ניקוי קרצוף ספוג</td><td>אמזון</td><td>B07CBSM53Z</td><td></td></tr><tr><td>PBS10X נוזלי Conc 4L</td><td>EMD Millipore</td><td>6505-4L</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו עדינים במיוחד, 3 1/4 אינץ' מכשירי</td><td>מחקר ביו-רפואיים</td> ישרים <td>11-1020</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין מתאן סולפונאט</td><td>סינדל</td><td>TRIC-M-GR-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, פישר ביו-ריאגנטים</td><td>פישר מדעי</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

אי ספיקת כבד היא אחד הגורמים המובילים למוות ברחבי העולם, והתמותה ממחלת כבד כרונית עולה בחדות בארצות הברית. כבדים בריאים מסוגלים להתחדש מנזק רעיל, אך במחלת כבד מתקדמת, היכולת הטבעית של הכבד להתחדש נפגעת. דגי זברה התגלו כמערכת ניסיונית רבת עוצמה לחקר ההתחדשות. הם מודל אידיאלי לחקר התחדשות הכבד מהפטקטומיה החלקית, הליך עם רלוונטיות קלינית ישירה שבה חלק מהכבד מוסר בניתוח, ומשאיר את השאר ללא פגע. אין פרוטוקול סטנדרטי לכריתת הפטי חלקית; מחקרים קודמים המשתמשים במודל זה השתמשו בפרוטוקולים שונים במקצת ודיווחו על תוצאות שונות. מתואר כאן פרוטוקול יעיל, לשחזור לביצוע כריתת hepatectomy חלקית בדגי זברה בוגרים. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להדגים כי דגי זברה מסוגלים להתחדשות אפימורפית של האונה הנתבת. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור עוד יותר את המנגנונים הנדרשים להתחדשות הכבד בדגי זברה.

על מנת לבחון את הפוטנציאל המתחדש של כבד דג הזברה הבוגר, ביצענו כריתת הפטקטומיה חלקית (PHX) בדגי זברה בוגרים. באופן כללי, נבחרו מבוגרים גדולים (30-40 מ"מ אורך) הנעים בין 1.5-2.5 שנים. במסגרת ניסויים בודדים, בעלי חיים נבחרו מאותו טנק, והיו מותאמים לגילם ולגודלם. כבקרה מתאימה, השתמשנו בניתוחים מזויפים שבהם החיה הייתה גם מרדים וקיבלה חתירה גדולה בקיר הגוף הגחון אך התאוששה מבלי להסיר רקמה. שיעורי ההישרדות של פקדי זיוף נעו בין 90%-100% עבור דגי זברה זכרים ונקביים כאחד. שיעורי ההישרדות של בעלי חיים PHX נעו בין 60%-75% עבור דגי ...

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לנצל כלים כימיים וגנטיים זמינים כדי לחקור את המנגנונים של התחדשות הכבד בדגי זברה. כריתת הפטקטומיה חלקית מאפשרת הסרה מדויקת של רקמות כדי לעורר התחדשות הכבד ללא צורך בהשפעות בכל הגוף של פגיעה בכבד רעיל. רק על ידי הבנת המנגנונים המולקולריים והתאים של התחדשות הכבד נוכל לעצב טיפולים חדשים לטיפול בחולים עם מחלת כבד מתקדמת.כדי להתחיל, להסיר את הדגים ממיכל Tricaine באמצעות מלקחיים ולהטמיע אותם בחריץ של ספוג ספוג Tricaine עם הצד הגחוני למעלה. לאחר מכן מניחים את הספוג תחת מיקרוסקופ ניתוח עם תאורה מלמעלה למטה. לצבוט את העור ואת קשקשים רק אחורי ללב עם מלקחיים עדינים וליצור חור בחלל הגוף על ידי ביצוע חתך מתחת למלקחיים עם מספריים טעון האביב.לסובב את הספוג ולעשות חתך שלושה עד ארבעה מילימטר לאורך הבטן על ידי חיתוך posterially לכיוון סנפירי האגן. ואז לסובב את הספוג בחזרה. לסחוט את הצדדים של הספוג ביד אחת כדי לכפות את האיברים הקרביים מתוך חלל הגוף.האונה הגחונית של הכבד נמצאת על גבי המעי, והכבד הוא מבנה ורוד או כתום הפרוס על פני המעי החום הזהוב, וניתן לדמיין אותו בבירור עם פלואורסצנטיות CFP. לסחוט את המלקחיים העדין, כך tines נוגעים זה בזה ולהחליק את הפחיות בין הכבד והמעי. ואז לאט להפריד את הפחיות כדי לשבור את קבצים מצורפים וריד הפורטל בין הכבד והמעי.חזור על תהליך זה עד שכל קשרי הפורטל בין הכבד למעי נותקו, ולמשוך את האונה הגחון מהמעי באמצעות מלקחיים עדינים. חותכים את האונה הגחונית חופשית משאר הכבד. בדיקה של החיה עם פלואורסצנטיות CFP מראה כי האונה הגחונית הוסרה.בסיום, מעבירים בזהירות את הדגים מהספוג למיכל המכיל מי מערכת ומזרים את מי המערכת מעל הזימים לכמה דקות עד שהדגים מתאוששים ושוחים בכוחות עצמו. לאחר המתת חסד של הדג, להסיר אותו ממי קרח. מניחים אותו בחריץ של ספוג עם הצד הגחון למעלה ולעשות חותך של דופן הגוף הגחון בעמדה האחורית הקדמית של הלב.לאחר מכן בצע שני חותכים נוספים משולי ההסתעפות הראשונות המרוצות לאורך הציר האחורי הקדמי לסנפירי האגן, ומקלפים את העור והשריר כדי לחשוף את האיברים הקרביים. כעת ניתן לדמיין את האיברים הקרביים עם מיקרוסקופיית שדה בהירה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. התאוששות הכבד לאחר כריתת הפטקטומיה חלקית הוערכה על ידי חישוב יחס משקל הכבד לגוף, שהיה 1.8% לגברים ו -3.3% עבור נקבות.יחס משקל הכבד לגוף של שני המינים נקבע ביום אפס שלאחר הניתוח, וביום השביעי בבקרות החלקיות של כריתת הפטקטומיה והזיוף. ביום האפס שלאחר הניתוח, לבעלי חיים מזויפים יש אונה גחונית גלויה, אך בבעלי חיים כריתת הפטיקטומיה חלקית, האונה הגחונית נעדרה לחלוטין, מה שגרם לירידה של 30% בזכרים ולירידה של 20% ביחסי משקל הכבד לגוף. ביום השביעי שלאחר הניתוח בבעלי חיים כריתת חציית חלקית, האונה הגחונית לא התחדשה, ויחסי משקל הכבד לגוף בבקרות כריתת חזה ושיפוף חלקיות היו דומים, מה שמצביע על כך שמסת כבד שחזרה לאחר כריתת חזה חלקית.השפעת הזמן על התחדשות האונה הגחונית נקבעה על ידי ביצוע כריתת hepatectomy חלקית מלאה 1/3 ומדידת האונה הגחונית ליחס אורך המעי. האונה הגחונית כבשה 50 עד 100% מאורך המעי בבקרת זיוף, אך צומצמה קשות ב 1/3 בעלי חיים כריתת חלק. בעלי חיים כריתת חלק ביום שלאחר הניתוח 36 היה יחס גחוני למעי מוגבר בהשוואה ליום הראשון שלאחר הניתוח.הגדלה משמעותית סטטיסטית של האונה הגחונית נצפתה בבעלי חיים המתאוששים מהפטיקטומיה חלקית ביום 36 שלאחר הניתוח בהשוואה ליום הראשון, אך לא בבקרות מזויפות. חלק מבעלי החיים חידשו את האונה הגחונית, אך חלקם לא עשו זאת, מה שמצביע על שונות בתגובת הניתוח. החלק הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא להפריד באופן נקי את הכבד ואת המעי, כך האונה הגחון ניתן להסיר לחלוטין.כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה יכולה להתבצע בקווים מוטנטיים או מהונדסים כדי לומר את הדרישות הגנטיות להתחדשות הכבד.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

כליות דג הזברה הוא ביתם של שני גזע / ובתאים כליות hematopoietic מבוגרים, מהווה הזדמנות מעולה ללמוד סוגי תאים אלה וצאצאיהם באורגניזם מודל החולייתנים. הנה, אנחנו מדגימים הליך לנתיחה מפורט המאפשר חוקר לזהות בניתוח להסרת הכליה דג הזברה למבוגרים, אשר יכול לשמש עבור יישומים כגון בידוד התא, השתלה, ומחקרים ביטוי וכליות / או אוכלוסיות תאים דם.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

המאמר מתאר אבלציה ממוקדת בכבד, שיטה לגרימת מוות של הפטוציטים עם מטרונידזול בזחלי דגי זברה טרנסגניים. פרוטוקול הדגימה מתאר את התהליך ליצירה, מניפולציה והערכה של אבלציה ממוקדת בכבד בדגי זברה.

אבלציה ממוקדת בכבד: גרימת מוות של הפטוציטים עם מטרונידזול בזחלי דגי זברה טרנסגניים

השימוש בדגי זברה למחקר קרדיווסקולרי מתרחב למחקר על לבבות בוגרים. עבור יישומים אלה, בידוד מהיר ופשוט של רקמות לב הוא המפתח למניעת שינויים לאחר המוות ולהשגת מספר מספיק של דגימות. כאן, אנו מתארים שיטה מהירה וניתנת לשחזור לניתוח לבבות דגי זברה בוגרים.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

כדי לעזור להעריך את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הכבד המונעת על ידי דג הזברה, הקמנו מודל פגיעה בכבד שבו הפטוציטים המבטאים ניטרורודוקטאז מבוטלים גנטית בטיפול במטרונידזול.  בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לתמרן במיומנות, לנטר ולנתח אבלציה של הפטוציטים והתחדשות כבד מונעת מרה.

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

פיברוזיס מתמשך עם שקיעה של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים מוגזמים מוביל לשחמת. שימוש לרעה באלכוהול הוא אחד הגורמים העיקריים למחלת כבד קשה. הקמנו מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי אתנול כדי לחקור את המנגנונים והאסטרטגיות לקידום התחדשות הפטוציטים בעת פציעה הנגרמת על ידי אלכוהול.

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

פרוטוקול זה מתאר ניתוח היסטולוגית של הכבד מן הזחלים דג הזברה כי טופלו באתנול 2% עבור 24 שעות. טיפול כזה אתנול חריפה התוצאות סטאטוזיס כבד נפיחות של כלי הדם הכבד.

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

זה נשאר אתגר גדול לפתח מותנה נוקאאוט גנטי או יעיל ג'ין-נוקאאוט באיברים דג זברה למבוגרים. כאן אנחנו מדווחים על פרוטוקול עבור ביצוע siRNA בתיווך nanoparticle ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים, ובכך מספק שיטה אובדן-של-פונקציה חדשה ללמוד. האיברים הבוגרים דג זברה ואורגניזמים אחרים מודל.

בתיווך Nanoparticle siRNA ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים

כאן אנו להפגין שיטה לכמת את גודל הכבד בזחל zebrafish, מתן דרך להעריך את ההשפעות של מניפולציות גנטיות ופרמקולוגית על גידול בכבד ופיתוח.

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

במאמר זה אנו מציגים כיצד ליצור מודל של דגי זברה הקשורים למחלת כבד שומני שאינו אלכוהולי (NAFLD) כדי לחקור את ההשפעה של עודף כולסטרול על המיקרו-סביבה של הכבד ועל הנוף של תאי מערכת החיסון.

ניתוח של מיקרו-סביבה של הכבד במהלך התקדמות מוקדמת של קרצינומה הפטוצלולרית שאינה אלכוהולית הקשורה למחלת הכבד השומני בדגי זברה

מתוארת שיטת הזרקה תוך-צפקית חדשה (IP) בדגי זברה בוגרים. בעת טיפול בתרכובות רעילות כגון דוקסורוביצין, הליך זה יעיל יותר משתי שיטות ה- IP שדווחו בעבר. הטכניקה תוכננה להיות מאומצת בקלות על ידי חוקרים בעלי ניסיון מוגבל במודל דגי הזברה.

טכניקת הזרקה תוך צפקית בדגי זברה בוגרים הממזערת נזקי גוף ותמותה נלווית

למד כיצד לבצע כריתת כבד חלקית בדגי זברה מבוגרים לחקר מנגנוני התחדשות הכבד. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מדויק ושחזור רקמת כבד עם רלוונטיות קלינית למחלות כבד אנושיות.

כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים

גלה סרטונים נוספים