אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתונים טומוגרפיה אלקטרוגנית
March 19th, 2021
הביקוש הגובר לאיסוף נתונים בקנה מידה גדול בטומוגרפיה קריוגנית של אלקטרונים דורש שגרת רכישת תמונות בתפוקה גבוהה. מתואר כאן פרוטוקול המיישם את ההתפתחויות האחרונות של אסטרטגיות רכישה מתקדמות שמטרתן למקסם את יעילות הזמן והתפוקה של איסוף נתונים טומוגרפיים.
ההגדרה של הפעלת איסוף נתונים בקנה מידה גדול היא הליך שגוזל זמן רב שיכול לקצר במידה ניכרת את זמן המיקרוסקופ הנותר הזמין לרכישת סדרת הטיה. שיטה זו מאפשרת התקנה מהירה של רכישת נתוני טומוגרפיה אוטומטית בקנה מידה גדול כדי למקסם את יעילות הזמן של ניסויי טומוגרפיה הדורשים בחירה זהירה של יעדי רכישה. התחל בפתיחת מופע SerialEM דמה.
לאחר מיפוי ריבוע הרשת הראשון, השתמש באפשרות התפריט נווט SerialEM ממוזג כדי לראות את המונטאז' במופע SerialEM הדמה. לחץ פעמיים על חלון הנווט כדי לפתוח את מפת רשת מרובעת. חפש במפה והשתמש באפשרות נווט SerialEM הדמה הוסף נקודות כדי להוסיף נקודות רכישת תמונה ביעד העניין.
לאחר מיפוי הריבועים החדשים, שמור את קובץ הנווט ומזג שוב את הנווט. המשך עד למיפוי כל ריבועי הרשת. שוב, מזג את קובץ הנווט עם מופע SerialEM הבובה.
הפעל את קובץ ה- Script של מפות וירטואליות של Pi EM מתפריט SerialEM הדמה. בחר כלים ובחר מפות עוגן וירטואליות. פעולה זו עשויה להימשך זמן מה בהתאם לגודל ולכמות של מפות ריבוע הרשת, כמו גם את binning של התצוגה ואת מפות התצוגה המקדימה.
כדי להבטיח ביצועי מיקרוסקופ נאותים, השתמש באותה הגדלה ובהגדרת גודל קרן לרכישת נתונים בסדר הבא. הפעל יישור ללא תרדמת SerialEM על-ידי CTF. הכנס ומרכז צמצם אובייקטיבי.
הפעל את אסטיגמציה נכונה של SerialEM באמצעות מנגינה מהירה של CTF ו- GIF. ב- SerialEM, פתח את קובץ הנווט החדש. ביטול בחירת כל נקודות A.
בחר את מפות התצוגה הראשונות. בחר כיווץ. לחץ על פעמיים וסללת את הבחירה בקריסה.
בחר את מיקום מפת התצוגה הראשונה. הקש Shift T ולאחר מכן בחר את מיקום מפת התצוגה האחרונה והקש שוב Shift T. בחרו תמונות מסגרת בודדת במאפייני הקובץ לפתיחת תיבת דו-שיח.
בתיבת הדו-שיח הבאה של מאפייני קובץ, בחר את הפרמטרים הרצויים בהתאם לצרכי ההדמיה ולהגדרת המכשיר. כאשר תתבקש, תן שם עם מספר ולחץ על שמירה. הגדר את בקר סדרת הטיה עבור מיקום TS הראשון.
לאחר סיום, לחץ על אישור כדי להגדיר פרמטרים אלה עבור כל סידרות הטיה לאחר פריט רכישה זה. כל מפות התצוגה המקדימה נבחרות כעת כ- TS עם שם קובץ ממוספר. במידת הצורך, הגדר את מרחק המיקוד/המסלול עבור כל יעד.
לחץ פעמיים על מפת התצוגה כדי לטעון אותה. בחר את מפת התצוגה המקדימה ברשימת הנווטים. לאחר מכן בחר ערוך מוקד בחלון הנווט.
בלוח הבקרה במינון נמוך, סובב ציר בין אזורים כדי למקם את גירסת הניסיון ולהתמקד לאורך ציר הטיית הבמה. לחץ על האזור הרצוי במפת התצוגה שנטענה כדי להגדיר את מיקום גירסת הניסיון של המוקד עבור סדרת הטיה זו ולוודא שלפריט הנווט יש TSP מוגדר. חזור על ההליך עבור כל הפריטים.
ערוך את טווח המיקוד בקובץ ה- PreTomo הפועל לפני כל סדרת הטיה. בתפריט סידרת הטיה של SerialEM, בדוק את קובץ ה- Script של הפעלת TS ובחר את מספר ה- Script של קובץ ה- Script במהלך כל הטיה. בדוק את רמת מיכל החנקן והאם הטורבו האוטומטי נבחר.
בדוק את השטח הפנוי לאחסון נתונים. בתפריט קובץ SerialEM, אל תבחר שמירה רציפה עבור קובץ יומן הרישום. כל סדרת הטיה תקבל קובץ יומן רישום משלה.
לאחר לחיצה על רכישה בפריטים בתפריט הניווט, הפעל את הסקריפט PreTomo. בחר פעילות ראשית לרכוש סדרת הטיה ולאחר מכן בחר הפעל סקריפט לאחר PostTomo. בחר סגור שסתומי עמודה בסוף ולשלוח דואר אלקטרוני בסוף, ולאחר מכן לחץ על ללכת.
71 ריבועים מתאימים נבחרו על מפת הרשת בהגדלה נמוכה יותר. מפות הגדלה בינונית נרכשו עם הגדרות המאפשרות הדמיה ישירה וזיהוי של מדגם העניין, נגיפי קורונה במקרה זה. זמן הרכישה היה שלוש דקות לריבוע, שלוש שעות ו -45 דקות בסך הכל.
עם יצירת המפה הריבועית הראשונה, נפתח מופע SerialEM דמה במחשב נפרד כדי לדמיין את המפה הריבועית ולהוסיף נקודות על יעדים המתאימים לרכישת סדרת הטיה. המינון הנמוך של SerialEM הוגדר ותמונות תצוגה ותצוגה מקדימה של הפניה צולמו ונשמרו כמפות. לאחר מכן ניתן להשתמש במפות האחרונות באופן מיידי במופע SerialEM הדמה כדי ליצור את התצוגה הווירטואלית ואת התצוגה המקדימה הווירטואלית מתמונות המפה הריבועית המתאימות.
מפות התצוגה הווירטואלית שימשו לריכוז ראשוני של היעד, ואחריו מרכז סופי שבוצע בהגדלת הרכישה בפועל של סדרת הטיה באמצעות מפת התצוגה המקדימה הווירטואלית. משתמשים צריכים להרשות לעצמם שפע של זמן כדי לחקור את הנוף לדוגמה. לאחר חיפוש במפות מסוימות, מפתחים תחושה טובה יותר לאזורים באיכות טובה לאיסוף נתונים מהם.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול שנועד לשפר את היעילות של טומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית, תוך התייחסות לצורך באיסוף נתונים בקנה מידה גדול. השיטה מתמקדת באופטימיזציה של הגדרת ההדמיה כדי להבטיח תפוקה גבוהה במהלך רכישת סדרת הטיית, ובכך לשפר משמעותית את ניצול המיקרוסקופ.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום מחקר
- טומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית
- רכישת תמונות בתפוקה גבוהה
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- ביקוש גובר לאיסוף נתונים בקנה מידה גדול
- הגדרות זמן-רב עשויות להגביל את זמן המיקרוסקופ האפקטיבי
- חשיבות שיטות איסוף נתונים טומוגרפיים יעילים
שיטות בשימוש
- פרוטוקול לרכישת נתונים טומוגרפיים אוטומטית
- ניצול SerialEM לניווט במפות ריבוע רשת
- יישום מפות וירטואליות למרכז מטרה
תוצאות עיקריות
- זוהו 71 ריבועי רשת לרכישת נתונים
- איסוף נתונים יעיל עם זמן רכישה כולל של 3 שעות ו-45 דקות
- הוכחה ליכולת הדמיה יעילה של דגימות קורונה
מסקנות
- מחקר זה ממחיש גישה יעילה לתמונות בתפוקה גבוהה בטומוגרפיה
- הממצאים מדגישים את החשיבות של מקסום יעילות הרכישה במחקר ביולוגי
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Efficient cryogenic electron tomography (cryoET) data acquisition is critical for high-resolution structural biology, enabling rapid and reproducible 3D analysis of macromolecular complexes. Automated workflows using SerialEM and PyEM streamline grid mapping and target selection, maximizing microscope utilization and reducing operational bottlenecks. These advances directly impact early discovery and structural validation pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates structural interrogation of biological assemblies in near-native states.
- Supports functional target validation by enabling high-throughput acquisition of tilt series.
- Improves predictive confidence in macromolecular complex analysis for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Enables preparation of validated 3D structural datasets for downstream screening workflows.
- Standardizes acquisition routines, enhancing reproducibility and quantitative output quality.
- Facilitates scalable, automated data collection for reliable compound evaluation platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data acquisition with disease-relevant systems, such as viral particles.
- Ensures continuity from discovery-stage imaging to preclinical structural validation.
- Reduces risk in translational research by supporting robust, high-throughput data generation.
Pipeline & Workflow Integration
This automated cryoET workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting structural hypothesis testing and target de-risking.
- Discovery Biology: Enables rapid hypothesis testing and pathway clarification via high-resolution 3D imaging.
- Screening: Provides reproducible, quantitative tilt series datasets for assay readiness.
- Analytics: Delivers standardized measurements and readouts for comparative structural analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when imaging disease-relevant complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for automated tomography data acquisition across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of data acquisition sessions.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by maximizing instrument time.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryoEM instrumentation and data analysis software.
- Depends on access to high-end transmission electron microscopes and computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters and data management practices.
- May require adaptation for different sample types or grid formats.
- Operational limitations include manual input for initial target selection and quality assessment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Selecting the Targets
1:31
Generate Virtual Maps
2:07
Microscope Tuning
2:43
Set up Navigator
4:05
Set the Focus/Track Positions
5:00
Set up Additional Scripts
5:27
Run
6:19
Results: Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition
7:46
Conclusion
