Name: במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: למדו פרוטוקולים מבוססי מבחנה לניתוח פעילות ליגאז E3 אוביקוויטין, שיתוף פעולה E2-E3 ובחירת סובסטרטים. השיטות מאפשרות הערכת פונקציית ליגאז ומיון זוגות אנזימים ללא ציוד מיוחד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על דיון ביקורתי ועצות מועילות על כתב היד. אנו מתנצלים על כך שלא ציינו תרומות יקרות ערך בשל מגבלת גודל. עבודה זו נתמכת על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 ואשכול מצוינות EXC 229 / CECAD ל- TH. עבודה זו מומנה על ידי דויטשה פורשונגסגמיינסכאפט (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה - EXC 2030 - 390661388 ו - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 a T.H. gefördert.

1. הכנת חוצצים וריאגנטים
הערה: מאגרים ותרוממים שהוכנו ידנית במעבדה מפורטים להלן. כל המאגרים ושאר הריאגנטים המשמשים בפרוטוקולים נרכשו ממקורות שונים ושימשו בהתאם להוראות היצרנים.
<ol><li>הכן תמיסת מלח 10x חוצץ פוספט (10x PBS). לשם כך, יש לערבב 1.37 M נתרן כלורי (NaCl), 27 mM אשלגן כלורי (KCl), 80 מ"מ של דיסודיום-מימן-פוספט דיהידראט (Na2HPO4.2H2O), ו-20 מ"ר של אשלגן-דיהידרוגן פוספט (KH2PO4)ב-1 ליטר של H2O מזוקק כפול (ddH2O). יש לאפס את ה-PBS 10x ולהכין פתרון PBS 1x ב-ddH2O.<ol>
<li>Autoclaving מתבצע במשך 15 דקות ב 121 °C (70 °F) ו 98.9 kPa. הערה: השעבוד האוטומטי מתבצע בתנאים אלה עבור כל המאגרים והפתרונות. אם לא צוין אחרת, פתרונות מאוחסנים בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן 1 ליטר של פתרון PBS-Tween (PBS-T) על-ידי הוספת 0.1% Tween ל- 1 ליטר של PBS 1x.</li>
	<li>הכן 10 מ"ל של 0.5 M L-ליסין פתרון מלאי על ידי המסת L-ליסין ב ddH2O. Aliquot L-ליסין ב 1 מ"ל מנות, ולאחסן אותם ב -20 °C עד לשימוש נוסף. הערה: L-ליסין ניתן להקפיא ולהפשיר שוב ושוב.</li>
	<li>הכן פתרון 0.25 M אתילן דיאמין טטרה חומצה אצטית (EDTA) על ידי המסת EDTA ב 200 מ"ל של ddH2O.<ol>
<li>התאימו את ה-pH ל-8.0 עם נתרן הידרוקסיד (NaOH).</li>
		<li>כוונן את עוצמת הקול ל- 250 מ"ל עם ddH2O.</li>
		<li>תבודד את הפתרון באופן אוטומטי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן 10 מ"ל של 20 מ"ג / מ"ל פתרון אלבומין סרום בקר (BSA) על ידי המסת BSA ב ddH2O. חנות ב -20 °C ב 200 aliquots μL. הערה: ניתן להקפיא ולהפשיר את BSA שוב ושוב.</li>
	<li>הכן 1 ליטר של 2-(N-morpholino)אתאן חומצה גופרתית (MES) חוצץ פועל על ידי המסת 50 mM MES, בסיס 50 מ"מ טריס, 3.47 מ"מ נתרן דודציל סולפט (SDS), ו 1.03 מ"מ EDTA ב 0.9 L של ddH2O. לאחר ערבוב נכון, כוונן את עוצמת הקול ל- 1 ליטר.<ol>
<li>רמת ה-pH של מאגר 1x היא 7.6. אין להתאים את ה-pH עם חומצה או בסיס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן 200 מ"ל של פתרון חסימה (5% חלב) על ידי המסת 10 גרם אבקת חלב ב 1x PBS-T. יש לאחסן את פתרון החסימה ב- 4 °C (75°F) למשך עד שבוע.</li>
	<li>הכן 1 ליטר של מאגר העברה (ראה טבלת החומרים) בהתאם להוראת היצרנים.</li>
	<li>הכן 2x SDS מאגר מדגם על ידי המסת בסיס טריס 125 mM, 4% SDS, 4% גליצל, 0.03% ברומופנול כחול, ו 50 μL / mL של β-mercaptoethanol ב 50 מ"ל ddH2O. Aliquot ב 1 mL מנות, ולאחסן ב -20 °C עד לשימוש.</li>
</ol>2. במבחנה אוטומטית בכל תוקף
<ol><li>הכנה וביצוע של אסאי<ol>
<li>חשב את הנפח של כל ריאגנט הנדרש לכל תגובה בהתבסס על הטוחנות הנתונות של החלבונים וריכוז החלבון של פתרונות החלבון. לפי תגובת כל-סיביות אוטומטית, השתמש ב- 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 ו- 50 μM Ub. כוונן את עוצמת התגובה ל- 20 μL עם ddH2O. הערה: פתרון ATP ומאגר בכל עת נרכשו כפתרונות מלאי 10x ושימשו ב- 1x.</li>
		<li>הכן ערכת צנרת לכל התגובות. בדוק תשעה אנזימי E2 שונים ליכולתם לתפקד (I) עם CHIP, (II) עם מוטציה CHIP(H260Q) לא פעילה קטליטית, ו- (III) ללא CHIP בתגובות בודדות בכל מקום.</li>
		<li>כדי להימנע משגיאות צנרת, הכינו תערובת אב על קרח המכילה את הנפח הנדרש לכל התגובות בתוספת תגובה נוספת אחת. חשב את כמות תערובת האב הנדרשת לכל תגובה. הערה: רכיבי מיקס ראשיים הם ריאגנטים הנדרשים באותה מידה עבור כל תגובה, כלומר., E1, E3, Ub, ATP ומאגר בכל עת.</li>
		<li>הוסף ddH2O ותערובת מאסטר לצינורות תגובת שרשרת פולימראז (PCR). שמור את הצינורות על קרח.</li>
		<li>לפני תחילת תגובות בכל מקום על ידי הוספת אנזימי E2, להגדיר רוכב אופניים תרמי PCR עם התוכנית הבאה: 2 שעות, 37 °C (50 °F) ואחריו 4 °C (50 °F), לאין שיעור.</li>
		<li>הוסף 1 μM של אנזימי E2 בצינורות המתאימים, ודגר את הדגימות ב- PCR תרמי מחזור עבור פרק הזמן שצוין.</li>
		<li>לאחר 2 שעות, הוסף מאגר דגימת SDS לכל תגובה, וערבב על-ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים. הערה: אמצעי האחסון הנדרש של מאגר המדגם תלוי בריכוז המלאי של מאגר הדגימה. כאן, 20 μL של 2x SDS מאגר מדגם נוספו לכל תגובה.</li>
		<li>מרתיחים את הדגימות מיד ב 95 °C במשך 5 דקות, ולהמשיך עם אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide (PAGE). יש לאחסן את החלבונים המושקעים ב-20 °C (70 °F).</li>
	</ol></li>
	<li>אלקטרופורזה ג'ל וכתם מערבי<ol>
<li>לאחר ההפשרה, לסובב את הדגימות במשך כ 10 s ולטעון את ג'ל SDS-PAGE. השתמש בסולם חלבונים כהתייחסות לגודל. הערה: כאן, 4-12% ג'לים הדרגתיים Bis-Tris ו 3 μL של סולם חלבון שימשו. חלק את אמצעי האחסון לדוגמה וטען שני ג'לים באופן שווה באמצעות 20 μL של כל מדגם.</li>
		<li>הפעל את הג'ל ב 160-200 V במשך כ 30-45 דקות, כך הקדמי מדגם מגיע לתחתית הג'ל.</li>
		<li>מעבירים כל ג'ל למיכל פלסטיק מלא במאגר סופג למחצה, ודגר אותו במשך 2-5 דקות ב- RT. הסר את ג'ל הערימה.</li>
		<li>הכן שתי חתיכות של נייר סופג בגודל ג'ל וקרום ניטרוצלולוז בגודל ג'ל לכל ג'ל SDS וספוג מראש במאגר סופג למחצה. להרכיב את כריך כתם מערבי (WB) בתא WB מלמטה למעלה בסדר הבא: נייר סופג, קרום חנקן, ג'ל SDS-PAGE, נייר סופג.</li>
		<li>הסר בועות אוויר שאולי נלכדו בין שכבות הכריך. לשם כך, להשתמש רולר לגלגל בזהירות על הכריך כמה פעמים.</li>
		<li>סגור את התא, ואפשר למאגר כתם עודף להתנקז.</li>
		<li>מקם את התא בהתקן הכתמים המתאים, והשתמש בתוכנית הבאה לכתמים למחצה: 25 V, 1.0 A, 30 דקות.</li>
		<li>מעבירים את הממברנה הכתומה למיכל פלסטיק מלא בתמיסת חסימה, ודגר במשך 30 דקות ב- RT.</li>
		<li>הכן את פתרון הנוגדנים העיקרי על ידי הוספת הנוגדן ל- 10 מ"ל של PBS-T המכיל ריאגנט חסימה (ראה טבלת החומרים). הערה: ריכוז העבודה של הנוגדן הוא ספציפי לנוגדנים. במקרה זה, נוגדן נגד אוביקוויטין של עכבר חד-שבטי שימש בדילול של 1:5,000. עבור הג'ל השני, נוגדן ארנב חד שבטי נגד שבב שימש בשעה 1:5,000 ב PBS-T / חסימת ריאגנט.</li>
		<li>החלף את פתרון החסימה בתמיסת הנוגדנים העיקרית, ודגר למשך הלילה ב 4 °C (70 °F) על רוקר.</li>
		<li>לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS-T.</li>
		<li>הכן את פתרון הנוגדנים המשני על ידי הוספת הנוגדן המתאים ל-10 מ"ל של PBS-T. הערה: כאן, נוגדנים נגד עכבר ועכבר נגד ארנב משמשים בדילול של 1:10,000.</li>
		<li>לדגור את הממברנה עם הנוגדן המשני במשך 1 שעות ב RT על רוקר.</li>
		<li>לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 5 דקות עם PBS-T.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח נתונים<ol>
<li>הוסיפו ריאגנטים לגילוי כתמים מערביים לנוגדנים מצומדים של פרוקסידאז חזרת (HRP) לממברנה השטופה בהתאם להוראות היצרן, ולכוד את אות ה-HRP באמצעות סרטי רנטגן או מצלמת התקן מצמידה טעינה(איור 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. במבחנה מצע בכל
<ol><li>הכנה וביצוע של אסאי<ol>
<li>חשב את הנפח של כל ריאגנט הנדרש לכל תגובה, בהתבסס על הטחינה הנתונה של החלבונים וריכוז החלבון של פתרונות החלבון. לפי תגובת מצע בכל זמן, השתמש ב- 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 מצע μM ו- 50 μM Ub. השתמש בפתרון ATP 10x ובמאגר 10x בכל עת ב- 1x. כוונן את עוצמת הקול של תגובת המצע בכל זמן ל- 20 μL עם ddH2O.</li>
		<li>הכן ערכת צנרת לכל התגובות. כלול תגובות בקרה מתאימות המוודאות שכל המצע הוא ספציפי ל- E3. השתמש בחלבון UNC-45B כמצע מייצג של CHIP ומוטנט שבב לא פעיל קטליטית (H260Q) כפקד. הכן את התגובות הבאות: E1, E2, תערובת Ub (כולל Ub, ATP, מאגר בכל עת); E1, E2, תערובת Ub, UNC-45B; E1, E2, תערובת Ub, CHIP(H260Q), UNC-45B; ו- E1, E2, תערובת Ub, CHIP, UNC-45B.</li>
		<li>כדי להימנע משגיאות צנרת, הכינו תערובת אב על קרח המכילה את הנפח הנדרש לכל התגובות בתוספת תגובה נוספת אחת. חשב את עוצמת הקול של תמהיל האב הנדרש לכל תגובה. הערה: רכיבי מיקס ראשיים לבדיקה זו כוללים E1, E2, Ub, ATP ומאגר בכל עת.</li>
		<li>הוסף רכיבי תגובה בסדר הבא: ddH2O, מצע, ligase E3.</li>
		<li>לפני תחילת התגובה בכל מקום על ידי תוספת של תערובת מאסטר, להגדיר רוכב אופניים תרמי PCR עם התוכנית הבאה: 2 שעות, 37 °C (50 °F) ואחריו 4 °C (50 °F), לאין שיעור.</li>
		<li>הוסף את תערובת האב לכל צינור, ודגר את הדגימות ב- PCR תרמי מחזור עבור פרק הזמן שצוין.</li>
		<li>לאחר 2 שעות, הוסף 2x מאגר מדגם SDS לכל תגובה, וערבב על-ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים.</li>
		<li>לאחר הריצה, להרתיח את הדגימות מיד ב 95 °C (5 דקות), ולהמשיך עם דף. לחלופין, לאחסן את החלבונים denatured ב -20 °C (70 °F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>אלקטרופורזה ג'ל וכתם מערבי<ol>
<li>בצע אלקטרופורזה ג'ל כתם מערבי כמתואר בסעיף 2.2. השתמש בנוגדנים ספציפיים לזיהוי המצע והליגאז E3, בהתאמה. הערה: כאן, UNC-45B מותך לתג חלבון פוליפפטיד המופק ממוצר הגן c-myc המאפשר שימוש בנוגדן נוגדן עכבר חד שבטי נגד MYC. אנטי-MYC משמש בשעה 1:10,000.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח נתונים<ol>
<li>בצע ניתוח נתונים כמתואר בסעיף 2.3 (איור 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ליסין פריקה אסייד
<ol><li>הכנה וביצוע של אסאי<ol><li>טעינת האנזים E2 עם Ub על ידי E1<ol>
<li>חשב את הנפח של כל ריאגנט הנדרש לכל תגובה בהתבסס על הטוחנות הנתונות של החלבונים וריכוז החלבון של פתרונות החלבון. לפי תגובת טעינה, השתמש ב-2 מיקרומטר E1, 4 מיקרומטר E2 ו-4 סיביקוויטין נטול ליצין (Ub K0). השתמש במאגר ATP 10x וב- 10x בכל עת ב- 1x. כוונן את עוצמת התגובה לטעינה ל- 20 μL עם ddH20. הערה: מוטציית Ub K0 נטולת ליזינה משמשת לאכיפת הייצור הבלעדי של E2 מונו-בכל. ניתן להשתמש גם ב-Ub מסוג פראי; עם זאת, זה עלול להוביל שינויים מגוונים E2 ~ Ub (למשל.,פולי-בכל מקום של E2), אשר קשה יותר לנתח. לשימוש ראשון או בעת שימוש באנזים E2 חדש, לקבוע את רמת טעינת Ub על E2 שניתן להשיג על ידי E1. כדי לקבוע את התשואה של טעינה, לדמיין E2 לא טעון לעומת טעון באמצעות כתמי קומאסי. כאן, כמחצית Ub K0 הומר באופן אמין UBE2D2 ~ Ub בעת שימוש ביחסים שווימולריים של UBE2D2 ו Ub K0(איור משלים S2A).</li>
			<li>הכן ערכת צנרת לתגובת הטעינה. כוונן את עוצמת תגובת הטעינה לתגובות הפריקה הבאות לפי בחירה, למשל., השתמש ב- CHIP וב- CHIP(H260Q) בתגובות פריקה בודדות. לכן, להכין כפול את הנפח של תגובת טעינה אחת. הערה: בפעם הראשונה, לבדוק ריכוזים שונים של ligase E3 של בחירה כדי לפקח על תנאי פריקה אופטימליים, ולנתח אותם על ידי סופג מערבי. במצב אידיאלי, הפריקה של Ub מ- E2 תגדל עם הזמן עד שרצועת החלבון E2 ~ Ub בהתאמה תיעלם.</li>
			<li>לדגור על תגובת הטעינה במשך 15 דקות ב 37 °C (50 °F).</li>
		</ol></li>
		<li>סיום תגובת הטעינה<ol>
<li>עצור את תגובת הטעינה על ידי הוספת apyrase בריכוז סופי של 1.8 U / mL. בצע את הדגירה עם apyrase במשך 5 דקות ב RT, ואחריו תוספת של EDTA בריכוז הסופי של 30 מ "ר. כוונן את עוצמת התגובה לטעינה ל- 30 μL עם ddH2O. הערה: Apyrase משמש להמרת מולקולות ATP למולקולות ADP (אדנוסין דיפוספט). מכיוון שהפעילות של האנזים E1 תלויה ב-ATP, E1 כבר לא יכול לטעון E2. EDTA משמש גם כדי להבטיח כי E1 מעוכב על ידי מרווה Mg2 + יונים כי הם גורמים משותפים הדרושים עבור E1. נפח האפיראז הנדרש כדי לעצור את התגובה יכול להשתנות בין תנאי ההסמכה. למרות apyrase לבד כבר quenches מולקולות ATP זמין, שילוב של apyrase ו EDTA היה יעיל יותר לעצור את תגובת הטעינה עבור זוג E1-UBE2D2. כמו עצירת התגובה היא גורם קריטי עבור שחזור בדיקה, עצירה יעילה צריך להיבדק עבור זוגות E1-E2 חדשים. למטרה זו, הגדר תגובת טעינה, עצור אותה ואסוף דגימות בנקודות זמן ספציפיות, לדוגמה,לאחר 2, 5, 10 ו- 15 דקות. רמות שאינן משתנות של E2 ~ Ub מצביעות על כך שהתגובה נעצרה, וכי התיאסטר היה יציב בתקופה זו של זמן (איור משלים S2B).</li>
		</ol></li>
		<li>פריקת E2 ~ Ub על ידי E3<ol>
<li>הכן ארבע צינורות המתאימים לנקודות הזמן השונות (t0, t1, t2, t3); להוסיף חיץ מדגם ללא צמצום (6.7 μL של 4x ליתיום דודסיל סולפט (LDS) חוצץ) לכל צינור. הערה: אל תשתמש בסוכן הפחתת במאגר לדוגמה.</li>
			<li>הסר 6 μL מתגובת הטעינה שהופסקה עבור t0, וכוון את עוצמת הקול ל- 20 μL עם ddH2O.</li>
			<li>לדגור על מדגם t0 במשך 10 דקות ב 70 °C (70 °F). הערה: אין להרתיח את המדגם על ידי הארכת זמן הדגירה כמו thioesters הם מעבדה בטמפרטורות גבוהות יותר.</li>
			<li>חשב את הנפח של כל ריאגנט הנדרש לכל תגובת פריקה. השתמש 24 μL הנותרים של E2 טעון, ולהוסיף 10 mM L-ליסין, 1 מ"ג / מיליליטר BSA, ו 500 ננומטר של ליגאז E3. השתמש במאגר בכל עת ב- 1x, וכוון את עוצמת הקול ל- 80 μL עם ddH2O.</li>
			<li>הכן ערכת צנרת עבור כל תגובות הפריקה והשתמש ב- CHIP(H260Q) כפקד בנוסף ל- CHIP(WT).</li>
			<li>הגדר תגובות פריקה על קרח על-ידי הוספת הרכיבים הנדרשים בסדר הבא: ddH2O, מאגר בכל העולם, BSA, ליסין, ligase E3, ואת E2 טעון כדי להתחיל את התגובה.</li>
			<li>לדגור על תגובת הפריקה ב-RT.</li>
			<li>קח דגימות לאחר 5, 30, ו 60 דקות על ידי העברת 20 μL של תגובת הפריקה לתוך צינורות מדגם בהתאמה. הערה: נקודות זמן מתאימות המאפשרות ניטור נכון של הפריקה יכולות להשתנות בין זוגות E2-E3.</li>
			<li>מערבולת המדגם מיד, ודגרה אותו ב 70 °C (70 °F) במשך 10 דקות.</li>
			<li>המשך ישירות עם PAGE. הערה: E2 ~ Ub thioesters יכול להיות מעבדה גם לאחר denaturing במאגר מדגם. לכן, אלקטרופורזה ג'ל צריך להתבצע ישירות לאחר ביצוע בדיקות.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>אלקטרופורזה ג'ל וכתם מערבי<ol>
<li>בצע את אלקטרופורזה ג'ל ואת הכתם המערבי כמתואר בסעיף 2.2. השתמש בנוגדן ספציפי Ub, ואם זמין, גם להשתמש בנוגדן ספציפי E3 שגדל במין אחר, המאפשר זיהוי בו זמנית של אות Ub ו- E3 ligase.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח נתונים<ol>
<li>בצע ניתוח נתונים כמתואר בסעיף 2.3 (איור 3).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestra+for+assembly+and+fate+of+polyubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains.</a> Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).</li>
<li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+structures%2C+functions%2C+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li>
<li>Dye, B. T., Schulman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanisms+underlying+posttranslational+modification+by+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).</li>
<li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ubiquitination+factor%2C+E4%2C+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li>
<li>Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiubiquitylation+by+E4+enzymes%3A+%27one+size%27+doesn%27t+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all.</a> Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).</li>
<li>Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2+enzymes%3A+more+than+just+the+middle+men%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">E2 enzymes: more than just the middle men.</a> Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).</li>
<li>Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+demographics+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The demographics of the ubiquitin system.</a> Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).</li>
<li>Buetow, L., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+catalysis+and+regulation+of+E3+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).</li>
<li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7, 6(2021).</li>
<li>Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U+box+proteins+as+a+new+family+of+ubiquitin-protein+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).</li>
<li>Herhaus, L., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+ubiquitin+code+through+post-translational+modification%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Expanding the ubiquitin code through post-translational modification.</a> EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).</li>
<li>Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RING+domain+E3+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RING domain E3 ubiquitin ligases.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).</li>
<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lingering+mysteries+of+ubiquitin-chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly.</a> Cell. 124 (1), 27-34 (2006).</li>
<li>Hoppe, T., Cohen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organismal+protein+homeostasis+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Organismal protein homeostasis mechanisms.</a> Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).</li>
<li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+protein+quality+control+removes+unfolded+CFTR+from+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane.</a> Science. 329 (5993), 805-810 (1997).</li>
<li>Tawo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+ligase+CHIP+integrates+proteostasis+and+aging+by+regulation+of+insulin+receptor+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover.</a> Cell. 169 (3), 470-482 (2017).</li>
<li>Albert, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIP+ubiquitylates+NOXA+and+induces+its+lysosomal+degradation+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage.</a> Cell Death and Disease. 11 (9), 740(2020).</li>
<li>Hoppe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+myosin-directed+chaperone+UNC-45+by+a+novel+E3%2FE4-multiubiquitylation+complex+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans.</a> Cell. 118 (3), 337-349 (2004).</li>
<li>Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quality+control+gets+muscle+into+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein quality control gets muscle into shape.</a> Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).</li>
<li>Janiesch, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-selective+chaperone+CDC-48%2Fp97+links+myosin+assembly+to+human+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy.</a> Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).</li>
<li>Donkervoort, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+variants+in+the+myosin+chaperone+UNC-45B+cause+progressive+myopathy+with+eccentric+cores%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores.</a> The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).</li>
<li>Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIP+is+a+chaperone-dependent+E3+ligase+that+ubiquitylates+unfolded+protein%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein.</a> EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIP+is+a+U-box-dependent+E3+ubiquitin+ligase%3A+identification+of+Hsc70+as+a+target+for+ubiquitylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).</li>
<li>Yang, Y., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+apoptosis%3A+the+ubiquitous+way%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of apoptosis: the ubiquitous way.</a> The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).</li>
<li>Lamothe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAF6+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RANKL+signaling+and+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).</li>
<li>Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoubiquitination+of+BCA2+RING+E3+ligase+regulates+its+own+stability+and+affects+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration.</a> Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385(2008).</li>
<li>Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+UbcH5%2Fubiquitin+noncovalent+complex+is+required+for+processive+BRCA1-directed+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination.</a> Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).</li>
<li>Sakata, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+UbcH5b%7Eubiquitin+intermediate%3A+Insight+into+the+formation+of+the+self-assembled+E2%7EUb+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates.</a> Structure. 18 (1), 138-147 (2010).</li>
<li>Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mms2-Ubc13+covalently+bound+to+ubiquitin+reveals+the+structural+basis+of+linkage-specific+polyubiquitin+chain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).</li>
<li>Buetow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+primed+RING+E3-E2+ubiquitin+complex+by+non-covalent+ubiquitin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin.</a> Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).</li>
<li>Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIRC7-E2+ubiquitin+conjugate+structure+reveals+the+mechanism+of+ubiquitin+transfer+by+a+RING+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).</li>
<li>McKenna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncovalent+interaction+between+ubiquitin+and+the+human+DNA+repair+protein+Mms2+is+required+for+Ubc13-mediated+polyubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).</li>
<li>Plechanovová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+ubiquitylation+by+dimeric+RING+ligase+RNF4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4.</a> Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).</li>
<li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li>
<li>Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+p53%3A+TRIM24+enters+the+RING%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Regulation of p53: TRIM24 enters the RING.</a> Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).</li>
<li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin modifications.</a> Cell Research. 26, 399-422 (2016).</li>
<li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K63-linked+polyubiquitination+in+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).</li>
<li>Dammer, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyubiquitin+linkage+profiles+in+three+models+of+proteolytic+stress+suggest+the+etiology+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

מאמר זה מתאר שיטות בסיסיות במבחנה בכל העולם לניתוח של פונקציית ligase E3. בעת ביצוע במבחנה בכל מקום בדיקות, יש לקחת בחשבון כי כמה אנזימי E2 יכולים לבצע auto-בכל מקום בשל ההתקפה של ציסטאין הפעיל שלהם על שאריות ליצין שלהם הממוקמים בסמיכות לאתר הפעיל30. כדי לעקוף בעיה זו, השימוש במוטנט E2 מומלץ שבו שאריות ליצין בהתאמה מוחלפות עבור ארגינין, אשר גורם אנזים E2 פעיל קטליטית כי הוא עמיד אוטומטית בכל מקום32. זה בעל חשיבות מיוחדת בעת ניטור העברת Ub באמצעות בדיקת פרי...

בכל מקום הוא התהליך שבו Ub מקושר באופן קוולנטי לחלבוןמצע 1. שינוי Ub מזורז על ידי תגובות אנזימטיות רצופות המערבות פעולה של שלושה מחלקות אנזימים שונות, כלומר., אנזימים מפעילי Ub (E1s), אנזימים ההולכים ub (E2s), ליגסות Ub (E3s) ואולי גורמי התארכות שרשרת Ub (E4s)2,3,4,5. לאחר אדנוסין טריפוספט (ATP)- ומגנזיום (Mg2 +) הפעלה תלויה של Ub על ידי E1, האתר הפעיל ציסטאין של E1 תוקף את גליצין C-מסוף של Ub, ויוצר קומפלקס thioester (Ub ~ E1). האנרגיה שנשאבת מהידרוליזה ATP גורמת ל- Ub להגיע למצב מעבר באנרגיה גבוהה, אשר נשמר לאורך מפל האנזים הבא. לאחר מכן, האנזים E2 מעביר את Ub מופעל לציסטאין הקטליטי הפנימי שלו, ובכך יוצר קשר Ub ~ E2 תיאסטר חולף. לאחר מכן, Ub מועבר לחלבון המצע.
זה יכול להיעשות בשתי דרכים. ייתכן שהליגאז E3 ייקשר תחילה ל- E2, או שליגאז E3 יכול לאגד ישירות את Ub. הדרך האחרונה גורמת להיווצרות של E3 ~ Ub ביניים. בכל מקרה, Ub מקושר לחלבון המצע על ידי היווצרות קשר איזופפטיד בין קבוצת קרבוקסיל C-terminal של Ub לבין קבוצת האמינו ליסין Ɛ של המצע6. הגנום האנושי מקודד שני E1s, כ 40 E2s, ויותר מ 600 פוטטיבי בכל מקום רצועות7. בהתבסס על מנגנון העברת Ub של E3, רצועות Ub מחולקות לשלוש קטגוריות המערבות הומולוגית לסוג E6AP C-Terminus (HECT), גן חדש מעניין באמת (RING)/U-box- type, וטבעת בין רצועות מסוג RING (RBR)8. במחקר זה, U-box המכיל ליגאז, טרמינל קרבוקסיל של חלבון אינטראקציה HSC70 (CHIP), משמש כאנזים E3 מייצג. בניגוד לאנזימי E3 מסוג HECT היוצרים Ub ~ E3 thioesters, תחום U-box של CHIP קושר E2 ~ Ub ומקדם את העברת Ub / מצע הבאים ישירות מן האנזים E28,9. בהתבסס על החשיבות של תיבת U עבור פונקציה אנזימטית, מוטציה U-box שבב לא פעיל, CHIP(H260Q), משמש כפקד. CHIP(H260Q) אינו מצליח להיקשר ל- E2s הקוגנייט שלו, ובכך מאבד את פעילות ה- E3 ligase10.
בכל מקום חלבון ממלא תפקיד מכריע בוויסות שפע של אירועים תאיים בתאים אאוקריוטים. ניתן לייחס את מגוון התוצאות התאיות המקודמות על ידי צירוף הפיך של מולקולות Ub לחלבונים מצעיים למאפיינים המולקולריים של Ub. כמו Ub עצמו מכיל שבעה שאריות ליסן (K) עבור כל כולה נוספת, יש מגוון עשיר של סוגי שרשרת Ub עם גדלים שונים ו / או טופולוגיות11. לדוגמה, מצעים יכולים להשתנות על ידי מולקולת Ub אחת באחת (מונו-נביקולציה) או ליזינים מרובים (multi-mono-ubiquitylation), ואפילו על ידי שרשראות Ub (פולי-ubiquitylation)11. שרשראות Ub נוצרות הומו או הטרוטיפיות באמצעות שאריות ליצין זהות או שונות של Ub, מה שעלול אף לגרום לרשתות Ub מסועפות9. לכן, כל החלבון מוביל לסידורים מגוונים של מולקולות Ub המספקות מידע ספציפי, למשל., עבור השפלה, הפעלה או לוקליזציה של חלבונים מצומדים12,13. אותות Ub שונים אלה מאפשרים תכנות מחדש מהיר של מסלולי איתות תאיים, המהווה דרישה חשובה ליכולתו של התא להגיב לצרכים הסביבתיים המשתנים.
היבט מרכזי של בכל מקום קשור לבקרת איכות חלבון. חלבונים תותומים או פגומים באופן בלתי הפיך חייבים להיות מושפלים ומוחלפים בחלבונים מסונתזים חדשים כדי לשמור על הומאוסטזיס חלבון או פרוטאוסטזיס14. בקרת האיכות E3 ligase, CHIP, משתפת פעולה עם מלווים מולקולריים בהשפלה תלוית Ub של חלבונים פגומים9,15,16,17. חוץ מזה, CHIP מווסת את היציבות של המלווה מכוון מיוסין, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), אשר מתואם היטב עם תפקוד שרירים וחריגות מהרמות האופטימליות להוביל מיופתיה אנושית18,19,20,21. השפלה של UNC-45B על ידי פרוטאסום 26S הוא בתיווך על ידי התקשרות של שרשרת פולי-Ub הקשורה K489. בהיעדר חלבוני מצע, CHIP מבצעת10,22,23,המאפיין את רינג / U-box E3 רצועות אוביקוויטין24,25 ונחשב לווסת פעילות ligase26. יישום שיטות בדיקת ההחמצה המופרכות המתוארות במאמר זה סייע לזהות באופן שיטתי אנזימי E2 המשתלבים עם CHIP כדי לקדם היווצרות של שרשראות פולי-Ub בחינם ו/או כל-כל אוטומטי של CHIP (פרוטוקול סעיף 2). יתר על כן, כל מקום תלוי שבב של UNC-45B נצפתה, שהוא מצע ידוע של E3 ligase18,19 (פרוטוקול סעיף 3). בסופו של דבר, העברה תלוית שבב של Ub מופעל מן Ub ~ E2 thioester היה במעקב (פרוטוקול סעיף 4).

<table><tbody><tr><td>אמרשן פרוטראן 0.1 ומיקרו; m NC</td><td>GE Healthcare</td><td>10600000</td><td>ממברנת ניטרוצלולוזה</td></tr><tr><td>אנטי-CHIP</td><td>איתות תאים</td><td>2080</td><td>נוגדן ארנב חד-שבטי נגד CHIP, שיבוט C3B6</td></tr><tr><td>Anti-MYC</td><td>Roche</td><td>OP10</td><td>נוגדן חד-שבטי נגד MYC עכבר, שיבוט 9E10</td></tr><tr><td>אנטי-יוביקוויטין</td><td>אפסטייט</td><td>05-944</td><td>נוגדן נגד Ub עכבר חד-שבטי, שיבוט P4D1-A11</td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma</td><td>A6535-100UN</td><td></td></tr><tr><td>ATP (10x)</td><td>Enzo</td><td>12091903</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A6003-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>מאגר דגימה LDS (4x)</td><td>novex</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>L-ליזין</td><td>סיגמא</td><td>L5501-5G</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Roth</td><td>4256.4</td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>VWR כימיקלים</td><td>2,08,47,307</td><td>100%</td></tr> <tr><td>Milchpulver</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>P029.3</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE נוגד חמצון</td><td>invitrogen</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>העברת NuPAGE מאגר (20x)</td><td>novex</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>סרגל עמודים בתוספת</td><td>Thermo Fisher</td><td>26619</td><td>סולם חלבון</td></tr><tr><td>RotiBlock</td><td></td><td>Roth A151.1</td><td>מגיב חוסם</td></tr><tr><td>SDS (20%)</td><td>Roth</td><td>1057.1</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Thermal Cycler</td><td>Bio Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo</td><td>Bio Rad</td><td>1704150EDU</td><td>Transfer System</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>UbcH סט אנזימים</td><td>BostonBiochem</td><td>K-980B</td><td>E2 אנזימים</td></tr><tr><td>יוביקוויטין</td><td>BostonBiochem</td><td>U-100H</td><td></td></tr><tr><td>אנזים מפעיל יוביקוויטין E1</td><td>Enzo</td><td>BML-UW941U-0050</td><td></td></tr><tr><td>מאגר Ubiquitylation (10x)</td><td>Enzo</td><td>BML-KW9885-001</td><td></td></tr><tr><td>נייר סופג Whatman</td><td>Bio Rad</td><td>1703969</td><td>נייר סינון עבה במיוחד</td></tr></tbody></table>

במבחנה ניתוח של e3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

החיבור הקוולנטי של אוביקוויטין (Ub) לשאריות ליזינה פנימיות של חלבון מצע, תהליך המכונה בכל מקום, מייצג את אחד השינויים הפוסט-תרגומיים החשובים ביותר באורגניזמים אאוקריוטים. Ubiquitylation מתווך על ידי מפל רציף של שלושה מחלקות אנזימים כולל אנזימים מפעילי אוביקוויטין (אנזימי E1), אנזימים ההולכים אוביקוויטין (אנזימי E2) ורצועות אוביקוויטין (אנזימי E3), ולפעמים, גורמי התארכות בשרשרת אוביקוויטין (אנזימי E4). כאן, בפרוטוקולים במבחנה לבדיקות בכל מקום מסופקים, המאפשרים הערכה של E3 אוביקוויטין פעילות ligase, שיתוף הפעולה בין זוגות E2-E3, ובחירת מצע. זוגות E2-E3 שיתופיים יכולים להיות מוקרנים על ידי ניטור הדור של רשתות פולי-אוביקוויטין בחינם ו / או כל מקום אוטומטי של ligase E3. מצע בכל העולם מוגדר על ידי כריכה סלקטיבית של ligase E3 והוא יכול להיות מזוהה על ידי סופג מערבי של התגובה במבחנה. יתר על כן, E2 ~ Ub פריקה בדיקה מתוארת, המהווה כלי שימושי להערכה ישירה של שיתוף פעולה פונקציונלי E2-E3. כאן, העברה תלויה E3 של אוביקוויטין מתבצעת מן האנזים E2 המתאים על חומצות אמינו ליצין חינם (חיקוי מצע בכל מקום) או ליזינים פנימיים של E3 ligase עצמו (auto-בכל מקום). לסיכום, שלושה פרוטוקולי במבחנה שונים מסופקים כי הם מהירים וקלים לביצוע כדי לטפל בפונקציונליות קטליטית E3 ligase.

כדי לזהות אנזימי E2 שמשתפים פעולה עם שבב ligase ubiquitin, קבוצה של מועמדים E2 נבדק בתגובות הפרט במבחנה בכל מקום. זוגות E2-E3 שיתופיים היו במעקב על ידי היווצרות של E3 תלויי כלוב מוצרים, כלומר., auto-בכל מוצרי ההנעה בכל טוב נותחו על ידי סופג מערבי. פרשנות הנתונים מבוססת על השוואת הגודל של רצועות החלבון המתקבלות עם סמני משקל מולקולריים. כל מקום חלבון מוביל להיווצרות של דפוסי פס ספציפיים המאופיינים בהופעת רצועות כפולות או להקות איטרטיביות מרובות עם הפרש גודל בהתאמה של 8.6 kDa (גודל של מולקולת Ub אחת).
...

המחקר הנוכחי מספק פרוטוקולים מפורטים במבחנה בכל מקום לבדיקת אנליזה לניתוח של E3 אוביקוויטין פעילות קטליטית ligase. חלבונים רקומביננטיים באו לידי ביטוי במערכות פרוקריוטיות כגון תרבות קולי Escherichia.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לנתח היבטים מרכזיים חשובים של פונקציית ligase E3, כולל ספציפיות אנזימים E2, בחירת מצע והעברת ubiquitin. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הישימות הרחבה שלה, כמו חלבונים מכל המקורות האוקריוטיים ניתן לבטא מחדש ולמד במבחנה ללא צורך בציוד מיוחד. בעת שימוש בטכניקת פריקה ליזין בפעם הראשונה, חשוב לייעל פרמטרים של בדיקת אנזים, כגון ריכוזי אנזימים, כדי לזהות את תנאי הפריקה האידיאליים עבור ligase E3 של בחירה.כדי לבצע בדיקה במבחנה אוטומטית בכל מקום, להגדיר ערכת pipetting כדי לבדוק את היכולת התפקודית של אנזימי E2 שונים ולהכין תערובת מאסטר על קרח עבור כל התגובות בכל מקום בתוספת תגובה אחת נוספת. לאחר מכן, להוסיף micromolar אחד של אנזימי E2 צינורות המתאימים, ודגור את הדגימות רוכב אופניים תרמי PCR במשך שעתיים בתנאים שצוינו. לאחר הדגירה, הוסף מאגר מדגם SDS לכל תגובה ומערבב על ידי צנרת מספר פעמים.ואז מיד להרתיח את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאחסן את החלבונים denatured ב 20 מעלות צלזיוס. כדי לבצע בדיקה מצע במבחנה בכל זמן, להכין את ערכת pipetting עבור כל התגובות. לאחר חישוב כמות תערובת האב הנדרשת לתגובה אחת, הכינו את תערובת המאסטר לכל התגובות על הקרח והוסיפו את תערובת המאסטר לכל צינור.הוסף את רצועות E3 המתאימות בנפרד. ואז לדגור על הדגימות ב- PCR אופנוע תרמי במשך שעתיים כפי שהוכח. בסוף הדגירה, להוסיף פעמיים SDS חוצץ מדגם לכל תגובה, לערבב מספר פעמים על ידי pipetting, ולהרתיח את הדגימות במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס.כדי לבצע בדיקת פריקה ליצין, להגדיר את ערכת pipetting עבור תגובת הטעינה ולדגירה את תגובות הטעינה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לעצור את תגובת הטעינה, להוסיף apyrase לריכוז הסופי של 1.8 יחידות למיליליטר ודגורה התגובה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, להוסיף EDTA לריכוז הסופי של 30 מילימולר ולהשתמש במים מזוקקים כפולים כדי להתאים את נפח התגובה ל 30 microliters.כדי לפרוק E2 בכל עת על ידי E3, להגדיר חמישה צינורות המתאימים לנקודות הזמן עבור הניסוי, להוסיף 6.7 microliters של חיץ מדגם שאינו מצמצם לכל צינור, להסיר שישה microliters של תגובת הטעינה הפסיק מנקודת הזמן אפס צינור, ולהתאים את הנפח הכולל ל 26.7 microliters. כדי להגדיר את תגובות הפריקה, להוסיף מים מזוקקים כפולים, מאגר בכל זמן, BSA, ליסין, E3 ligase ואת E2 טעון לכל תגובה. לאחר פרקי הזמן שנבחרו, העבר דגימות של 20 מיקרוליטר מכל תגובת פריקה לצינור המדגם המתאים.ואז מיד מערבולת את הדגימות, ומניחים אותם ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בניתוח כתם מערבי מייצג זה, שבב לא פעיל לא היה אוטומטי בכל זמן. עם זאת, מוצרי ubiquitin עצמאי E3 נוצרו בנוכחות שבב לא פעיל ובהיעדר שבב.שבב מסוג בר היה אוטומטי בכל מקום בשילוב עם החלבונים של UBE2D ומשפחות UBE2E, ואילו שרשראות פוליוביקוויטין חינם יוצרו בשיתוף עם החלבונים של משפחת UBE2D אבל לא עם החלבונים של משפחת UBE2E. כריכת היוביקוויטין על ידי UBE2N / V1 כיוונה את היווצרותן של שרשראות יוביקוויטין בחינם. ה- auto-ubiquitylation וכל מקום של UNC-45B נצפתה עם שבב מסוג פראי אך לא עם המוטציה הלא פעילה של CHIP, מה שמצביע על כך UNC-45B פועל כמצע שמור עבור CHIP.כאשר הפעילות הקטליטית של CHIP נותחה באמצעות מטען פריקה ליזין, האנזים UBE2D2 לא טעון היה משקל מולקולרי של 17 קילודלטון ואת UBE2D2 טעון עם מולקולת יוביקוויטין אחת היה משקל מולקולרי של כ 26 קילודלטון. בזמן 0, כל תשואת E2 הטעון נצפתה. בנוכחות שבב לא פעיל, פריקה E3 קלושה עצמאית ligase של UBE2D2 אבל לא אוטומטי בכל מקום של CHIP זוהה.בנוכחות שבב מסוג פראי, הפריקה של UBE2D2 הייתה מהירה והושלמה תוך 60 דקות, וההנחיה האוטומטית של CHIP הצביעה על העברה של אוביקוויטין לשאריות ליצין משלו. בשל היכולת המוגבלת E2, לעבוד מהר ככל האפשר ומיד להמשיך עם תגובת הפריקה ואחריו SDS-PAGE ו- Western blotting. בעקבות פרוטוקולי ההזנה במבחנה, ניתן לזהות את סוגי ההצמדה הספציפיים בכל העולם על ידי חקר הכתמים המערביים בנוגדנים ספציפיים להצמדה.

in-vitro-analysis-of-e3-ubiquitin-ligase-function

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בניגוד ligases אוביקוויטין, זוהו מספר ligases סומו E3. ששונה זה במבחנה SUMOylation פרוטוקול הוא מסוגל לזהות ligases סומו E3 הרומן מאת assay שיחזור במבחנה .

במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות

אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי המשחק תפקידים חשובים בתהליכים סלולריים והוא מתואם באופן הדוק על ידי דאובינציה. פגמים בשתי התופעות מתחת לפתווגיות אנושיות. אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע התגובה אוביקווינציה ותגובת דאוביטיות באמצעות רכיבים מטוהרים.

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

פרוטוקול זה מטרתו להקים אוביקוויב (וכדומה) ו אוביקוויב-אוהב (Ubls) הפרוטאמים ספציפיים כדי לזהות שינויים של סוג זה של שינויים לאחר העברה (לאחר ההעברה), הקשורים במצב ספציפי כגון טיפול או פנוטיפים.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

מטרת כתב היד היא להציג מיתאר למחקרים הביוכימיים והפונקציונליים המקיפים את הליסים של הטבעת. צינור מרובה-צעדים זה, עם פרוטוקולים מפורטים, מאמת פעילות אנזימטית של החלבון שנבדק ומדגים כיצד לקשר את הפעילות לפעולה.

אפיון פונקציונלי של מסוג הטבעת E3 ליגטיות בתוך מבחנה ובפלאנטה

שיטה זו מתארת הערכה של שינויים גלובליים בטופולוגיית שרשרת ubiquitin. ההערכה מבוצעת על ידי יישום של גישה פרוטאומית ממוקדת ספקטרומטריית מסה.

ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

בכל מקום הוא שינוי חלבון קריטי לאחר התרגום, dysregulation אשר היה מעורב במחלות אנושיות רבות. פרוטוקול זה מפרט כיצד ניתן להשתמש בתצוגת פאג ' כדי לבודד וריאנטים חדשניים בכל מקום שיכולים לאגד ולווסת את הפעילות של רצועות E3 השולטות על הספציפיות, היעילות והדפוסים של כל מקום.

שימוש בתצוגת Phage לפיתוח אפננים משתנים של אוביקוויטין עבור ליגות E3

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבדיקת יוביקוויטילציה של מצע מסוים ויוביקוויטין-ליגאז E3 בתאי יונקים. קווי תאים HEK293T שימשו לביטוי יתר של חלבונים, המצע הפוליוביקוויטילטיבי טוהר מליאסטים של תאים על ידי מיצוי חיסוני, ונפתר ב- SDS-PAGE. אימונובלוטינג שימש כדי לדמיין את השינוי הפוסט-תרגומי הזה.

הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים

שיטה פשוטה ומדרגית פותחה כדי להעריך את המשמעות התפקודית של גרסאות missense ב- Ube3a, גן שאובדן ורווח תפקודו קשורים הן לתסמונת אנג'למן והן להפרעת ספקטרום האוטיזם.

שיטה מדרגית ומבוססת תאים להערכה פונקציונלית של גרסאות Ube3a

פרוטוקול זה מסביר כיצד למדוד את ההשפעה של שונות גנטית הקשורה להפרעות נוירו-התפתחותיות על פעילות האנזים דאוביקוויטילציה על ידי שילוב טיהור חלבונים רקומביננטיים עם מבחני מחשוף שרשרת יוביקוויטין.

מדידת הפעילות האנזימטית של אנזימים דאוביקוויטילציה הקשורים להפרעה נוירו-התפתחותית באמצעות בדיקת מחשוף שרשרת יוביקוויטין במבחנה

יוביקוויטינציה היא רגולטור קריטי של תפקודי החלבון התוך-תאי. כאן, אנו מתארים שתי שיטות ניתוק תאים לזיהוי רמות יוביקוויטינציה של חלבוני סובסטרט בתאי יונקים ומשווים את יעילותן בניתוח רמות יוביקוויטינציה. ביטוי יתר של חלבונים בתאים HEK293T הושר על ידי טרנספקציה חולפת, וחלבונים מאוביקוויטיניים זוהו בניתוח Western Blot.

אסטרטגיות השוואתיות לזיהוי יוביקוויטינציה בליזטים של תאי יונקים באמצעות SMAD2/SMURF2 כמודל

פרוטוקול זה מתאר שיטה לאוביקוויטין של Streptococcus pneumoniae באמצעות ליזאט תאי יונקים או קומפלקס אנזימי יוביקוויטין טהור, ולאחר מכן טיפול בקומפלקס חלבון VCP/p97-UFD1-NPLOC4 מטוהר להערכת פעילותו הבקטריוליטית, ומאפשר חקר אפקטורים חיסוניים התלויים ביוביקוויטין.

In-vitro שיקום של יוביקוויטינציה חיידקית וחיסול בתיווך VCP/p97

למדו פרוטוקולים מבוססי מבחנה לניתוח פעילות ליגאז E3 אוביקוויטין, שיתוף פעולה E2-E3 ובחירת סובסטרטים. השיטות מאפשרות הערכת פונקציית ליגאז ומיון זוגות אנזימים ללא ציוד מיוחד.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

גלה סרטונים נוספים