בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה על ידי הדמיה מגורה של פיזור ראמאן של שילוב דאוטריום בחיידק יחיד

בדיקות רגישות אנטי מיקרוביאליות מהירות ניתן להשיג בתוך 2.5 שעות בשתן ובדם, אשר נחשב הפחתה עצומה בזמן הניתוח בהשוואה לשיטת microdilution מרק קונבנציונאלי. זה יכול לפקח על פעילות מטבולית חיידקית בסביבה מורכבת, כגון דם שלם. כדי להתחיל, בדוק את ריכוז החיידקים מהדגימות על ידי מדידת הצפיפות האופטית באמצעות פוטומטר באורך גל של 600 ננומטר.

כדי להגיע לריכוז תאים סופי של שמונה פעמים 10 ליחידות יוצרות המושבה החמישית, או CFU, למיליליטר, דילל את תמיסת החיידקים באמצעות מדיום MHB רגיל ללא דאוטריום. לאחר ערבוב תאי החיידקים על ידי מערבולת, הסר 300 מיקרוליטר אליקוטים של תמיסת החיידקים בשבעה מיקרו-צינוריות של 1.5 מיליליטר ואליקוט של 600 מיקרוליטר של תמיסת החיידקים במיקרו-צינורית אחת של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 4.8 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי האנטיביוטיקה לתוך המיקרו-צינורית המכילה 600 מיקרוליטרים של תמיסת החיידקים כדי להשיג את הריכוז האנטיביוטי הסופי של שמונה מיקרוגרם למיליליטר.

הוסף 300 מיקרוליטרים של תמיסת החיידקים עם אנטיביוטיקה לאליקוט של 300 מיקרוליטר של תמיסת החיידקים ללא אנטיביוטיקה כדי להשיג תמיסה מדוללת כפולה עם ריכוז אנטיביוטיקה סופי של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר. חזור על דילול סדרתי כפול של אנטיביוטיקה הבדיקה עד הריכוז הנמוך ביותר של 0.25 מיקרוגרם למיליליטר הוא הגיע. השליכו 300 מיקרוליטרים של התמיסה מהמיקרו-צינורית האחרונה.

להקצות צינור אחד ללא אנטיביוטיקה לבקרה החיובית עם טיפול דאוטריום, ואת השליטה השלילית ללא דאוטריום. לדגום את האליקוט החיידקי עם האנטיביוטיקה המכילה מדיום MHB למשך שעה אחת. בינתיים, הכינו דילול סדרתי של אנטיביוטיקה עם 100% דאוטריום המכיל מדיום MHB עם אותם שיפועי ריכוז כפי שתואר קודם לכן.

לאחר שעה אחת של דגירה, הוסף 700 מיקרוליטרים של אנטיביוטיקה מדוללת באופן סדרתי עם 100% דאוטריום המכיל מדיום MHB ל -300 מיקרוליטרים של חיידקים אנטיביוטיים שטופלו מראש באותו ריכוז אנטיביוטיקה. הומוגניזציה של התערובת על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים. הוסיפו 700 מיקרוליטרים של 100% דאוטריום ללא אנטיביוטיקה המכילים מדיום MHB ל-300 מיקרוליטרים של חיידקים נטולי אנטיביוטיקה כבקרה חיובית.

הוסיפו 700 מיקרוליטרים של 0%דאוטריום ללא אנטיביוטיקה המכילים מדיום MHB ל-300 מיקרוליטרים של חיידקים נטולי אנטיביוטיקה כבקרה שלילית. לדגום את כל המיקרו-צינוריות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-200 סיבובים לדקה למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה של מיליליטר אחד של אנטיביוטיקה ודאוטריום מטופלים דגימת חיידקים ב 6, 200 פעמים גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

ואז לשטוף את הכדור פעמיים עם מים מטוהרים. תקן את הדגימות בתמיסת פורמלין בנפח של 10% לפי נפח, ואחסן אותן בארבע מעלות צלזיוס. בדוק את ריכוז Escherichia coli מדגימת החיידקים שזה עתה הוכנה על ידי מדידת הצפיפות האופטית באמצעות פוטומטר באורך גל של 600 ננומטר.

כדי לחקות את דגימות הזיהום הקליניות בדרכי השתן, הגדילו את דגימת Escherichia coli ל-10 מיליליטר של דגימות שתן ללא זיהוי כדי להגיע לריכוז סופי של 10 עד 6 CFU למיליליטר. מסננים את השתן המחורץ Escherichia coli באמצעות מסנן של חמישה מיקרון, ומחלקים את תמיסת החיידקים המסוננים ב-300 מיקרוליטרים אליקוטים לשבעה מיקרו-צינוריות של 1.5 מיליליטר, ו-600 מיקרוליטר אליקוט במיקרו-צינורית אחת של 1.5 מיליליטר. לבצע טיפול משולב דאוטריום בנוכחות אנטיביוטיקה כפי שתואר קודם.

כדי לחקות את דגימות הזיהום הקליניות בזרם הדם, ספייק Pseudomonas aeruginosa במיליליטר אחד של דם אנושי לא מזוהה כדי להגיע לריכוז סופי של 10 עד CFU השישי למיליליטר. כדי ללכלך את הדם, להוסיף תשעה מיליליטר של מים מטוהרים סטריליים. סנן את הדם המסולסל של Pseudomonas aeruginosa באמצעות מסנן של חמישה מיקרון.

לאחר מכן קצור חיידקים מהדגימה המסוננת לנפח של מיליליטר אחד על ידי צנטריפוגה ב 6, 200 פעמים גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, חלקו את תמיסת הדם המדממת של Pseudomonas aeruginosa ב-300 מיקרוליטרים אליקוטים לשבעה מיקרו-צינוריות של 1.5 מיליליטר ואליקוט של 600 מיקרוליטר של תמיסת החיידקים במיקרו-צינורית אחת של 1.5 מיליליטר, ובצעו טיפול משולב דאוטריום בנוכחות אנטיביוטיקה כפי שתואר קודם לכן. להכנת הדגימה, לשטוף מיליליטר אחד של תמיסת חיידקים קבועים עם מים מטוהרים, צנטריפוגה תמיסת חיידקים שטף ב 6, 200 פעמים גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את supernatant ולהעשיר את הפתרון החיידקי כ 20 microliters עם מים מעוקרים. מניחים את תמיסת החיידקים על כיסוי מצופה פולי-L-ליזין, כורכים עם כיסוי נוספת ואוטמים את הדגימה. במיקרוסקופ SRS, לייזר פמטו-שניות הניתן לכוונון עם קצב חזרות של 80 מגה-הרץ מספק את המשאבה ואת לייזרי העירור של סטוקס.

קרן סטוקס מווסתת על ידי אפנן אקוסטו-אופטי ב-2.4 מגה-הרץ. שתי הקורות משולבות זו בזו דרך מראה דיכרואית. לאחר מכן המשאבה ואלומות סטוקס מופנות למיקרוסקופ סריקת לייזר שנבנה במעבדה עם מראה Galvo דו-ממדית לסריקת לייזר.

מטרת מים של פי 60 ממקדת את הלייזרים לדגימה ומעבה שמן אוסף את האות מהדגימה. שני מסננים משמשים לסינון קרן סטוקס, בעוד קרן המשאבה מזוהה על ידי פוטודיודה, ולאחר מכן אות הראמן המגורה מופק על ידי מגבר נעילה. באמצעות תוכנת הבקרה, הזן וכוונן את אורך הגל של המשאבה ל-852 ננומטר.

התאם את תדר הרטט C ל-D למספר גל של 2, 168 כדי לצלם חיידקים באמצעות מיקרוסקופ SRS. מדוד את עוצמת הלייזר באמצעות מד כוח. הגדר את עוצמת לייזר המשאבה בדגימה לשמונה מילי-וואט, ואת עוצמת הלייזר של סטוקס בדגימה ל-50 מילי-וואט על-ידי התאמת צלחת חצי הגל לפני פלט הלייזר.

הנח את הדגימה הסטנדרטית DMSO d6 על שלב הדגימה, והשתמש במטרת טבילה במים פי 60 כדי למקד את המשאבה ולייזרים של סטוקס על הדגימה. על ידי כוונון הברגים של מראות ההשתקפות, יישרו מרחבית את המשאבה ואת אלומות סטוקס והכוונו את שתי הקרניים למיקרוסקופ זקוף המצויד במערכת מראות Galvo דו-ממדית לסריקת לייזר. בלוח הבקרה של התוכנה, הגדר כל תמונת SRS כך שתכיל 200 על 200 פיקסלים וזמן השהייה של הפיקסלים הוא 30 מיקרו-שניות.

זמן הרכישה הכולל של תמונה אחת הוא כ-1.2 שניות. הגדר את גודל הצעד ל- 150 ננומטר, כך שגודל התמונה הוא כ- 30 על 30 מיקרומטר בריבוע. לאחר אופטימיזציה של המערכת, הוציאו את הדגימה הסטנדרטית והניחו את דגימת החיידקים על שלב הדגימה מתחת ליעד טבילה במים של 60x.

התחל את הדמיית SRS של דגימות חיידקים. תמונה של לפחות שלושה שדות ראייה עבור כל דוגמה. ההשפעה של זמן הדגירה על התאגדות דאוטריום נמדדת על ידי מיקרוספקטרוסקופיית ראמאן ספונטנית באזורי CD ו-CH.

יחס עוצמת ה-CD על פני CH מתווה על פני זמן הדגירה של דאוטריום עבור חיידקים בודדים הראה עלייה בעוצמת CD על פני CH על פני זמן הדגירה מאפס ל-180 דקות. הדמיית SRS של Pseudomonas aeruginosa נערכה עם דגירה עם גנטמיצין ו-70% דאוטריום. הניתוח הסטטיסטי הכמותי הנוסף הראה כי אותות CD של חיידקים היו נמוכים משמעותית בשני מיקרוגרם למיליליטר, או ריכוז גנטמיצין גבוה יותר מאשר ללא טיפול בגנטמיצין.

סף עוצמת הניתוק ב-0.60 הגיע למסקנה כי Pseudomonas aeruginosa עוכב מטבולית בשני מיקרוגרם למיליליטר ובריכוזים גבוהים יותר של גנטמיצין. ה-SC-MIC עבור Pseudomonas aeruginosa נגד גנטמיצין במדיום MHB רגיל נקבע כשני מיקרוגרם למיליליטר, שהיה בטווח ההפרש החד פעמי עם MIC של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר שנקבע על ידי שיטת המיקרודילוציה של המרק. בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה, או AST, של דגימות שתן מסוג Escherichia coli בוצעה על ידי הדמיית SRS.

דגימת השתן של Escherichia coli נגד אמוקסיצילין נקבעה כארבעה מיקרוגרם למיליליטר, שיש להם את אותה קריאת רגישות כמו MIC של שמונה מיקרוגרם למיליליטר בשיטת דילול המרק הקונבנציונלית עבור Escherichia coli טהור במדיום MHB רגיל. הישימות של AST מהיר של Pseudomonas aeruginosa spikeed בדם אנושי נחקרה על ידי הדמיית SRS. עוצמת התקליטור של תמונת ה-SRS ב-2, 168 אחוזים נשלטה על ידי אותות חיידקיים שמקורם בשילוב דאוטריום מטבולי של חיידקים חיים.

ה- SC-MIC עבור Pseudomonas aeruginosa בדם נקבע להיות שני מיקרוגרם למיליליטר, מה שהסכים היטב עם תוצאת ה- MIC הסטנדרטית המקובלת עבור Pseudomonas aeruginosa במדיום הגידול הרגיל. מספר תאי החיידקים המשמשים לבדיקת רגישות מיקרוביאלית נשמר בערך חמש פעמים 10 עד למושבה החמישית היוצרת יחידות למיליליטר, כפי שמומלץ על ידי מכון התקנים הקליניים והמעבדתיים. ריכוז חיידקים גבוה יותר יכול להוביל לעלייה בריכוז המעכב המינימלי.

שילוב של זיהוי פתוגנים באתרו ואבחון מהיר של בדיקות רגישות מיקרוביאלית יכול להיות בעל פוטנציאל גדול לתרגום למרפאה המאפשרת זיהוי בזמן של חומרים אנטי מיקרוביאליים מתאימים לטיפול מדויק.