Name: זיהוי וניתוח אוטומטיים של אקסוציאטוזיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: חקור זיהוי וניתוח אוטומטיים של אקסוציאטוזיס באמצעות מיקרוסקופיית TIRF ותוכנת MATLAB. השיטה מאפשרת סיווג ארבעה מצבי היתוך וניתוח מרחבי-זמני של אירועים בתאי עצב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לדסטין רבל ורג'ינלד אדוארדס על בדיקת הקוד וה-GUI. המימון ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות נתמך מחקר זה: כולל R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) ו F31NS103586 (שפעת).

1. בחירת ערכות נתונים וספריות
<ol><li>כדי לבחור ערכות נתונים לניתוח, לחץ על לחצן חפש ערכות נתונים (איור 2A, תיבה אדומה 1) כדי לנווט לתיקיה שבה נתונים מופקדים (לדוגמה, התיקיה RawData). קבצי נתונים יאוכלסו באופן אוטומטי את קבצי הנתונים כרשימה. יכולה להיות יותר מעריפת נתונים אחת בתיקיה.</li>
	<li>לחץ על לחצן בחר ספריה ובחר את הספריה (למשל, בדיקה) שבה יופקדו קבצים שנותחו (איור 2A, תיבה אדומה 2). קבוצה של תיקיות וקבצי ניתוח מוגמרים וכן תמונות זמניות ביניים ייווצרו בספריה זו בעת לחיצה על לחצן ניתוח. שגיאות יופקו אם לא נבחרה ספריה.</li>
</ol>2. הגדר את גודל הפיקסלים ואת קצב המסגרות
<ol><li>מלאו את קצב הפריימים והפיקסל המתאימים של התמונות בתיבה המתאימה "Framerate" או "גודל פיקסל"(איור 2A, תיבה ירוקה). אם לא סופקו ערכים (הם מוגדרים לברירת המחדל "0"), התוכנית תחפש במטה-נתונים המשויכים לקובץ אחר קצב המסגרות וגודל הפיקסלים. אם לא ניתן למצוא ערכים אלה, התוכנית תהיה ברירת המחדל לפיקסל למדידה ולמסגרת עבור נקודות זמן. הערה: בדוגמה שסופקה, קצב המסגרות הוא 100 וגודל הפיקסלים הוא 0.08.</li>
</ol>3. לבחור או להכין מסכות
<ol><li>השתמש בלחצן יוצר מסיכות כדי ליצור באופן אוטומטי מסיכות תאים עבור הנתונים ברשימת ערכות הנתונים של הקבצים(איור 2A, תיבה כחולה). בעת השימוש בלחצן יוצר מסיכות, תיקיה חדשה בספריה שנבחרה תיווצר בשם MaskFiles. "מחוון ההפעלה" יהפוך לצהוב בעת ריצה ויחזור לירוק עם השלמתו. הערה: מסיכה עבור כל קובץ ברשימה קבצי נתונים תיווצר מתוך 10 המסגרות הראשונות של קובץ התמונה (או מכל המסגרות אם פחות מ- 10 נמצאות בקובץ התמונה) ותופקד בתיקיה MaskFiles באמצעות ערכת מתן השמות המתאימה (המתוארת להלן).</li>
	<li>ודא שקבצי המסיכה מאכלסים באופן אוטומטי את הרשימה 'קבצי מסיכה'. המשתמש רשאי להמשיך ישירות לניתוח. הערה: בדוק תמיד באופן חזותי קבצי מסיכה ואשר שהם לוכדים את כל אזור העניין. המסגרת הראשונה של קובץ הנתונים וקובץ המסיכה מוצגים בממשק המשתמש כאשר אפשרות זו נבחרת. (איור 2B). יוצר המסכות עשוי ליצור שגיאות במקרה של אות לרעש נמוך, כך שאימות שקבצי מסיכה מתאימים הוא קריטי לבקרת איכות.</li>
	<li>כחלופה לשימוש ב-Mask Maker, אם האות לרעש של תמונות אינו מספיק, צור מסיכות באופן ידני ב-ImageJ.<ol>
<li>תחילה, פתחו את קובץ התמונה הגולמי ב- ImageJ (איור 3A).</li>
		<li>לחץ על לחצן בחירת מצולע ולחץ כדי לצייר מסיכה סביב התא. לאחר סיום, לחץ פעמיים על הנקודה האחרונה כדי להשלים את המצולע.</li>
		<li>לאחר סיום, נווט אל ערוך | בחירת | צור מסיכה (איור 3B). מסיכה הפוכה חדשה תיווצר בהתבסס על ציור המצולע. שמור מסיכות בתיקיה ייעודית של קבצי מסיכה בספריה שנבחרה. ערכת מתן השמות של קובץ המסיכה חייבת להתאים לקבצי הנתונים הבודדים המתאימים ואחריה "_mask_file". לדוגמה, אם קובץ נתונים נקרא "VAMP2_488_WT_1.tif", יש להיקרא קובץ המסיכה המתאים "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".</li>
		<li>השתמש בלחצן חפש קבצי מסיכה כדי לנווט לתיקיה שנבחרה של קבצי מסיכה מותאמים אישית שהופקדו. המסכות יאכלסו את קבצי המסכה כרשימה. הערה: חשוב שתהיה מסיכה עבור כל קובץ נתונים לפני הפעלת הניתוח.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניתוח ומיצוי תכונות
<ol><li>לאחר בחירת הספריה והרשימה קבצי נתונים וקבצי מסיכה יאוכלסו, לחץ על לחצן ניתוח (איור 4A). אם נדרש סיווג של אירועים אקסוציאטיים, עבור לשלב 5. הערה: לחיצת לחצן ניתוח תבצע סדרה של משימות אוטומטיות כדי לנתח את הנתונים. הוא ייצור תיקיות בודדות בספריה שנבחרה להפקדת נתונים מנותחים. במהלך הריצה, "מחוון הריצה" ישתנה מירוק לצהוב(איור 4A,תיבה אדומה). לאחר סיום הניתוח, זה ישתנה בחזרה לירוק.</li>
	<li>מצא תיקיית DataFiles(איור 4B) עם ערכה מלאה של קבצי ניתוח (כמו גם קבצי חילוץ תכונות, שישמשו בסיווג מאוחר יותר) הנקראים על פי כל קובץ נתונים (איור 4C). הערה: תיאור של קבצי ניתוח אלה נכלל להלן בסעיף תוצאות מייצגות.</li>
</ol>5. סיווג אירועים אקסוציאטיים
<ol><li>כדי לבצע סיווג סימולטני של אירועים אקסוציאטיים עם זיהוי אוטומטי, סמן את תיבת הסימון סיווג לפני לחיצה על לחצן ניתוח. עבור כל אירוע אקסוציאטי, הקצה ציון הסתברות בין 0-1 עבור כל מחלקה. אירוע אקסוציאטי נחשב מסווג כאחת מארבע הכיתות אם ציון ההסתברות עבור כיתה זו הוא > 0.5. הערה: לאחר השלמת הניתוח, תופיע תיקיית קובץ נתונים חדשה בתוך הספריה שנבחרה. התיקיה תכיל קבצי ניתוח המתאימים לכל קובץ תמונה.</li>
</ol>6. ניתוח Spatiotemporal של אקסוציטוזיס באמצעות ערכי K של ריפלי
<ol><li>צור קובץ מסיכה נפרד "נויריט" ו"סומה". ראשית, קטע את הסומה מהנויריט. אין שיטה משוחדת לפולח הסומה מהנוריטים, ולכן המשתמש צריך להיות עיוור לניסוי ההתניה ולהשתמש בשיקול הדעת הטוב ביותר; אליפסואיד ללא הרחבות נויריט ברורות מוצע.</li>
	<li>פתח את ImageJ/פיג'י.</li>
	<li>גרור ושחרר את קובץ המסיכה או השתמש | קובץ פתח ולאחר מכן בחר את קובץ המסיכה.</li>
	<li>השתמשו בכלי דוקרן הצבעים ולחצו על כל אחד מהפיקסלים השחורים ברקע המסיכה כדי להגדיר את הצבע לשחור.</li>
	<li>השתמש בכלי בחירת המצולעים או ביד חופשית כדי לצייר קו מתאר סביב הסומה, להפריד אותו מהנוריטים. זה דורש קבלת החלטות ידנית.</li>
	<li>לחץ על ערוך | בחירת | הפוך מסכה. תמונה חדשה תיפתח כאשר הסומה המקיפה מפולחת משאר התמונה. פעולה זו תיצור קובץ מסיכת סומה.</li>
	<li>מבלי להזיז את האזור המצויר, לחץ על הכותרת של קובץ המסיכה המקורי.</li>
	<li>לחץ על ערוך | מלאו כדי למלא את הסומה המקיפה כך שרק הנוריטים יישארו המסכה.</li>
	<li>לאחר קבלת קבצי נוריט ומסיכות נפרדים, שמור את שני קבצי המסיכה.</li>
	<li>פתח את "neurite_2D_network" במטלב.</li>
	<li>ב- MATLAB, נווט לספריה עם כל נתוני הניתוח.</li>
	<li>שנה את הנתיב "שם מסיכה" לשם מסיכת הנויריט, כלומר , "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"</li>
	<li>שנה את ה"csv_file_name" למקום שבו נמצא קובץ fluorescent_traces.csv, כלומר "קבצי מסיכה/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".</li>
	<li>לחץ על הפעל כדי לשלד את קובץ מסיכת הנוריט. פעולה זו יוצרת גרסה שלד של קובץ מסיכת הנויריט ומפקידה אותו כקובץ CSV מתחת לתיקיה maskes.</li>
	<li>לאחר מכן, צור קובץ CSV עבור הסומה. פתח את "CSV_mask_creator.m" במטלב.</li>
	<li>שים את הנתיב עבור "שם המסכה" לשם מסכת סומה, כלומר, "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif</li>
	<li>שינוי "writematrix" לשם הקובץ csv שיש ליצור, כלומר, "קבצי מסיכה/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"</li>
	<li>לחץ על הפעל. פעולה זו יוצרת את קובץ VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv החדש.</li>
	<li>חזור על 6.14 עבור כל קובץ מסכה.</li>
</ol>7. הגדרת RStudio
<ol><li>פתח את Rstudio ופתח ripleys_k_analysis. קובץ R.</li>
	<li>התקן את החבילה "spatstat" ב- RStudio על-ידי כך שהיכנס אל כלים | התקן חבילות והקלדה ב- "spatstat" ולאחר מכן לחיצה על התקן. הערה: יש לבצע זאת רק פעם אחת לכל התקנת Rstudio.</li>
	<li>הפעל את יריית הספריה בתחילת כל הפעלה.</li>
	<li>שים לב לשני משתנים עיקריים במקרה זה: "neuron_mask" ו "neuron_datapoints". מסיכת נוירון מצביעה על ערכת קבצי המסכה להפעלה, כלומר קבצי מסכת סומה." הערה: הפעל את כל קבצי מסכת סומה יחד, בנפרד מקבצי מסיכת Neurite, ולהיפך.</li>
	<li>קרא .csv של קבצי המסכה עבור כל אחד הנוירונים להיות מנותח.</li>
	<li>הפעל קבצים מרובים בו-זמנית על-ידי העתקת neuron_mask_n+1 נוספים. זה יאפשר לצבור את הניתוח של ריפלי יחד, באמצעות התסריט המתואר בסעיף 8.</li>
	<li>עכשיו לבדוק את המשתנה השני, "neuron_datapoints".</li>
	<li>קרא ב." קובץ X_fluorescent_traces.csv" שנוצר על ידי תוכנית הניתוח (על ידי תכונות כל extracted_R קובץ) עם x, y,t מיקומים של האירועים האקסוציאטיים, כמו גם את הקובץ הספציפי neurite של מיקומי x,y עבור רשת 2D. זה הולך בתנוחת "neuron_datapoints".</li>
	<li>ב- RStudio בחר | קוד הפעל | אזור הפעל את כל. זה יוצר מספר חלקות, כולל ערכי K המקובצים של ריפלי, כמו גם חלקות צפיפות.</li>
	<li>שמור חלקות על-ידי כך שתלך אל ייצוא | שמירת תמונה | בחר תבנית תמונה לספריה מתאימה וקלט את שם הקובץ המתאים ולאחר מכן לחץ על שמור. הערה: פונקציית התוויית התוויות עבור מפת החום נקראת בתסריט באמצעות "התוויה(צפיפות(soma_data,0.4)". המספר "0.4" כאן מייצג עד כמה פונקציית הצפיפות צריכה להיות חלקה. ניתן לשנות אותו כך שיתאים לנתוני משתמשים בצורה משמעותית, אך אם יש לבצע השוואות בין מפת חום שונות, המספר חייב להיות זהה ביניהן.</li>
	<li>
יצא או שמור תמונה מ- Rstudio. אם מפת חום דורשת עריכה נוספת, בחרו סוג קובץ מתאים (SVG או EPS).</li>
</ol>8. הניתוח של ריפלי
הערה: Ripleys_k_analysis. קובץ R גם יצר באופן אוטומטי את התוויות ערך k של ריפלי. הפעלת קובץ ה- Script כולו תריץ באופן אוטומטי את הפונקציות המוזכרות להלן, אך הוא ייכלל בפירוט אם ברצונך להפעיל כל חלק של קובץ ה- Script בנפרד או לבצע שינויים בניתוח.
<ol><li>ראשית, הפעל את פונקציית המעטפה עבור כל תא. פונקציה זו דימתה אקראיות מרחבית מלאה (CSR) כדי לבדוק את ערך ה- K של ריפלי של תבנית נקודת האירוע האקסוציאטית נגד. Data_envelope_1 = מעטפות(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) Data_envelope_2 = מעטפות(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)</li>
	<li>לאחר מכן, איחד מעטפות אלה וצור הערכה אחת של CSR עבור הקבוצה: Pool_csr = בריכה (Data_envelope_1, Data_envelop_2,...) לאחר מכן, הפעל את הפונקציה K של ריפלי עבור כל נקודות הנתונים. Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, יחס = TRUE) Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, יחס = TRUE)</li>
	<li>לאחר השלמת הפעולה, חברו יחד את ערכי ה-K של ריפלי ואפטרו את מרווחי הביטחון שלהם באמצעות הפקודה הבאה: מאגר נתונים = מאגר (Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)</li>
	<li>אתחול באמצעות הפקודה הבאה: Final_Ripleys_K = varblock(כיף = Kest, Data_pool)</li>
	<li>התווה את הנתונים.</li>
	<li>אם נדרש הבדל סטטיסטי קשיח, מבחן התמורות לתלמידים נכלל בחבילת spatstat כדי לבדוק הבדל בין קבוצות של דפוסי נקודות: Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ קבוצה, nperm = np).</li>
</ol>

<ol><li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).</li>
<li>Urbina, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM67+regulates+exocytic+mode+and+neuronal+morphogenesis+via+SNAP47%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47.</a> Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).</li>
<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+kiss-and-run%3A+Role+in+exocytosis%2C+endocytosis%2C+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission.</a> Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+debate+on+the+kiss-and-run+fusion+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The debate on the kiss-and-run fusion at synapses.</a> Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).</li>
<li>Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+patch+clamp+reveals+that+transient+fusion+%28kiss-and-run%29+is+a+major+mechanism+of+secretion+in+calf+adrenal+chromaffin+cells%3A+high+calcium+shifts+the+mechanism+from+kiss-and-run+to+complete+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion.</a> Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+single-vesicle+astrocyte+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).</li>
<li>Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+direct%2C+dynamin-dependent+recapture+of+fusing+secretory+granules+on+plasma+membrane+lawns+from+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).</li>
<li>Wang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+domains+of+synaptotagmin+control+the+choice+between+kiss-and-run+and+full+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion.</a> Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).</li>
<li>Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+combined+methodologies+to+define+the+role+of+plasma+membrane+delivery+during+axon+branching+and+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Plooster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM9-dependent+ubiquitination+of+DCC+constrains+kinase+signaling%2C+exocytosis%2C+and+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).</li>
<li>Urbina, F. L., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-mediated+exocytosis+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SNARE-mediated exocytosis in neuronal development.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).</li>
<li>Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second-order+analysis+of+stationary+point+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Probability%22%5BJournal%5D)">The second-order analysis of stationary point processes.</a> Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHmScarlet+is+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+to+monitor+exocytosis+docking+and+fusion+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps.</a> Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין מה לחשוף.

בעת שימוש בתוכנת הזיהוי והניתוח האקסוציאטית, שקול שהתוכנית מקבלת דחיסה ללא אובדן נתונים בלבד .tif קבצים כקלט. קבצי התמונה .tif עשויים להיות תמונות בגווני אפור של 8 סיביות, 16 סיביות או 32 סיביות (ערוץ יחיד). יש להמיר תבניות תמונה אחרות לאחד מסוגים אלה לפני הקלט. לעיון, דוגמאות המשמשות כאן הן תמונות בגווני אפור של 16 סיביות.
טבוע בתהליך הזיהוי האוטומטי, ערכות התמונה timelapse מעובדות עבור חיסור הרקע האוטומטי ותיקון ההלבנה. עבור חיסור רקע, הפיקסלים מחוץ לאזור המסיכה של קובץ המסיכה משויכים בממוצע...

מבנים VAMP-pHluorin או קולטן העברה (TfR)-pHuji מבנים הם סמנים מצוינים של אירועים אקסוציאטיים, כמו אלה פלואורופורים רגישים pH מרווים בתוך לומן ארסית חומצה פלואורסצ'ה מיד עם פתיחת נקבובית היתוך בין קרום הלסת ופלזמה1. לאחר פתיחת נקבוביות היתוך, פלואורסצנטיות מתפורר באופן אקספוננציאלי, עם קצת הטרוגניות החושפת מידע על אירוע ההיתוך. כאן, מתואר יישום ממשק משתמש גרפי (GUI) המזהה ומנתח באופן אוטומטי אירועים אקסוציאטיים. יישום זה מאפשר למשתמש לזהות באופן אוטומטי אירועים אקסוציאטיים שנחשפו על ידי סמנים רגישים ל- pH2 וליצור תכונות מכל אירוע שניתן להשתמש בה למטרות סיווג3 (איור 1A). בנוסף, מתואר ניתוח של קיבוץ אירועים אקסוציאטיים באמצעות הפונקציה K של ריפלי.
הסיווג האוטומטי של אירועים אקסוציאטיים למצבים אקסוציאטיים שונים דווח לאחרונה3. שני מצבים של אקסוציאטוזיס, היתוך ארסיה מלאה (FVF) ואקוציאציה של נשיקה וריצה (KNR) תוארו בעבר4,5,6,7. במהלך FVF, נקבובית ההיתוך מתרחבת, ואת ההדבקה משולבת לתוך קרום הפלזמה. במהלך KNR, נקבובית ההיתוך נפתחת באופן ארעי ולאחר מכן חותם מחדש4,5,8,9,10. ארבעה מצבים של אקסוציאטוזיס זוהו בפיתוח נוירונים, שניים הקשורים FVF ושניים הקשורים KNR. עבודה זו מדגימה כי הן FVF והן KNR ניתן לחלק עוד לאירועי היתוך הממשיכים מיד לריקבון פלואורסצנטיות (FVFi ו- KNRi) לאחר פתיחת נקבוביות היתוך או אירועים אקסוציטיים המציגים עיכוב לאחר פתיחת נקבובית היתוך לפני תחילת דעיכה פלואורסצנטית (FVFd ו- KNRd) (איור 1B). המסווג מזהה את מצב האקסוציאטוזיס עבור כל אירוע היתוך. כאן ניתוח זה שולב ב- GUI שניתן להתקין ב- MATLAB במערכות הפעלה מבוססות Windows ו- Mac. ניתן למצוא את כל קבצי הניתוח https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing או https://github.com/GuptonLab.

<table><tbody><tr><td></td><td>צוות</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>הליבה של MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr> R https://www.r-project.org/ <tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio, PBC</td><td></td><td>https://rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

זיהוי וניתוח אוטומטיים של אקסוציאטוזיס

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

מיקרוסקופיית Timelapse TIRF של GFP רגיש ל-pH (pHluorin) המצורפת לחלבוני SNARE ארסיים היא שיטה יעילה לדמיין אירועים אקסוציאטיים ארסיים בודדים בתרבית התאים. כדי לבצע זיהוי וניתוח יעילים ובלתי משוחדים של אירועים כאלה, פותחה ויושמה גישה מבוססת ראייה ממוחשבת ב- MATLAB. צינור הניתוח מורכב מפילוח תאים ומאלגוריתם זיהוי אירועים אקסוציאטיים. גישת הראייה הממוחשבת כוללת כלים לחקירת פרמטרים מרובים של אירועים בודדים, כולל מחצית החיים של דעיכה פלואורסצנטית ושיא ΔF/F, כמו גם ניתוח תאים שלמים של תדירות האקסוציאטוזיס. פרמטרים אלה ואחרים של היתוך משמשים בגישה סיווג להבחין מצבי היתוך נפרדים. כאן GUI שנבנה לאחרונה מבצע את צינור הניתוח מתחילתו ועד סופו. עיבוד נוסף של פונקציית K של ריפלי ב- R Studio משמש להבחנה בין מופע מקובץ באשכולות, מפוזרים או אקראיים של אירועי היתוך הן במרחב והן בזמן.

כאן נעשה שימוש ב- GUI(איור 2A)כדי לנתח אירועים אקסוציאטיים משלושה VAMP2-pHluorin המביעים נוירונים ב- 3 DIV באמצעות TIRF (פלואורסצנטיות השתקפות פנימית כוללת). E15.5 נוירונים קליפת המוח היו מבודדים, ואחריו transfection עם VAMP2-pHluorin ו ציפוי באמצעות הפרוטוקולים כפי שמתואר Winkle ואח ', 2016 ו Viesselmann ואח ', 201111,12. המתודולוגיה של פרמטרי ההדמיה היא כפי שמתואר באורבינה ואח ', 20182. בקצרה, מיקרוסקופיה TI...

פיתחנו תוכנת ראייה ממוחשבת אוטומטית לזיהוי אירועים אקסוציאטיים המסומנים על ידי בדיקות פלואורסצנטיות רגישות ל- pH. כאן, אנו מדגימים את השימוש בממשק משתמש גרפי ו- RStudio כדי לזהות אירועי היתוך, לנתח ולהציג פרמטרים spatiotemporal של היתוך, ולסווג אירועים למצבי היתוך נפרדים.

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

זיהוי וניתוח אוטומטיים של תוכנת Exocytosis יאפשרו למשתמש לזהות באופן אוטומטי אירועים אקסוציאטיים ורצפי תמונות TIRF של פלואורופורים רגישים ל- pH. זה גם באופן אוטומטי פלט תכונות של exocytosis כגון הפצה מרחבית או התדירות, כמו גם תכונות בודדות של אירועים אקסוציאטיים, כגון מחצית החיים או שינוי פלואורסצנטיות על הרקע. בנוסף, נכללת אפשרות לסווג אירועים אקסוציאטיים לארבעה מצבים של אקסוציטוזיס, שתוארו בעבר בספרות.כדי להשתמש בתוכנת זיהוי וניתוח אוטומטיים של Exocytosis, תחילה תלחץ על לחצן חפש ערכת נתונים, ותנווט למקום שבו הנתונים שלך מופקדים, וברצונך להכניס לתיקיה הנקראת נתונים גולמיים. קבצי הנתונים שלך יאכלסו את הרשימה באופן אוטומטי כאן, ותוכל לתכלית מספר כלשהו של קבצי נתונים בתיקיה זו. לאחר מכן, תרצה לבחור ספריה שעבורה קבצי הניתוח שלך יופקדו.הנה, בחרתי ספריה שנקראת מבחן. מומלץ גם למלא את קצב הפריימים של התמונות שלך, כמו גם את גודל הפיקסלים. כאן קצבי הפריימים שלי הם מאה אלפיות השנייה למסגרת, גודל הפיקסלים שלי הוא שמונה ננומטרים.לבסוף, תצטרך קבצי מסכה על מנת להפעיל את זיהוי אוטומטי וניתוח של תוכנת Exocytosis. באפשרותך להשתמש בלחצן יוצר המסכות הכלול כדי ליצור באופן אוטומטי קבצי מסיכה מקבצי הנתונים שלך. מחוון הריצה יהפוך לצהוב ולאחר מכן יחזור לירוק כאשר יוצר המסכות יסיים לפעול.המסיכה שלך תופקד בתיקיה חדשה הנקראת קבצי מסיכה בספריה שבחרת. ושימו לב, קבצי מסיכה יאכלסו את הרשימה באופן אוטומטי כאן. ברצונך לבדוק שקבצי המסכה שלך מיוצרים כראוי עבור קבצי הנתונים שלך, ובאפשרותך לעשות זאת על-ידי הדגשת כל אחד מקבצי הנתונים ברשימה, כמו גם את קובץ המסכה המתאים.המסגרת הראשונה של קובץ הנתונים תופיע וקובץ המסיכה שנבחר יופיע גם כן. הנה. אנו יכולים לראות כי קבצי המסכה שלנו מתאימים לניתוח בהישג יד. ייתכן שהמשתמש יסופק גם קבצי מסיכה בנפרד.כאשר ברצונך ליצור קובץ מסיכה מקובץ נתונים נוכחי אנו ממליצים להשתמש בתמונה J.In כדי לעשות זאת, פתח תחילה את התמונה בתמונה J שממנה ברצונך ליצור קובץ מסיכה. לאחר מכן ניתן להשתמש בכלי בחירת המצולעים כדי להתחיל ליצור קובץ מסיכה על-ידי לחיצה על קצה התא. לאחר השלמת המסיכה, לחץ פעמיים כדי להתחבר למצולע כולו.לאחר השלמת פעולה זו, תערוך, תבחר ותיצור מסיכה. תיווצר מסיכה הפוכה. ברצונך לשמור קובץ מסיכה זה בשם זהה לשם קובץ הנתונים ואחריו _mask_file.כעת, אם אתה מספק קבצי מסכה מותאמים אישית משלך, חשוב ליידע את תוכנת הזיהוי האוטומטית היכן ממוקמים קבצי המסכה הללו. כדי לעשות זאת, תלחץ על לחצן חפש קבצי מסיכה ותנווט לספריה עם קבצי המסיכה בתוכו. קבצי המסכות החדשים יאכלסו את הרשימה כאן.חשוב שתהיה לך מסיכה עבור כל קובץ נתונים לפני שניתן יהיה להפעיל את הניתוח. עכשיו, ברגע שיש לך ערכת הנתונים שלך טעון, קבצי המסכה שלך, קצב הפריימים שלך ואת גודל הפיקסלים מותאם כראוי, ו בספריה שנבחרה, אתה יכול סוף סוף להחליט אם אתה רוצה לכלול סיווג כחלק מהניתוח שלך. אם תחליף את לחצן הסיווג, בנוסף לזיהוי אירועים אקסוציאטיים, כל אירוע אקסוציאטי יסווג לאחת מארבע מחלקות.לאחר שהחלטת על אופן הפעלת הניתוח שלך, תוכל להתחיל בניתוח על-ידי לחיצה על לחצן הניתוח. מחוון הריצה יהפוך לצהוב כדי לציין שהניתוח מתבצע ויחזור לירוק עם סיום הניתוח. לאחר השלמת הניתוח, כפי שצוין על-ידי מחוון ההפעלה המשתנה מצהוב לירוק, תבחין שתיקיית קבצי נתונים חדשה הופיעה בספריה שבחרת.בתוך תיקיית קבצי הנתונים, תמצא קבצי ניתוח המתאימים לכל ערכת תמונה בניתוח שלך. בנוסף, קובץ סטטיסטיקת תאים המכיל מידע סיכום כגון תדירות האקסוציאטוזיס עבור כל אחת מערכות התמונה נמצא כאן. עבור כל ערכת תמונות, יש לך קובץ מעקב פלואורסצנטי, המכיל מידע על מיקום X, מיקום Y ומספר מסגרת עבור המקום שבו הם מתרחשים אירועים אקסוציאטיים.בנוסף, הפלואורסצנטיות הממוצעת באזור מעניין סביב כל אירוע אקסוציאטי מוצגת הן לפני, במהלך ואחרי אקסוציאטוזיס. בנוסף, יש גם קובץ מעקב, המכיל מידע דומה של מיקומי X, Y וטמפורלי. עם זאת, אם תיבת הסימון של הסיווג מסומנת, בנוסף, יהיו ארבע עמודות נוספות, המציינות את ההסתברות לאירוע האקסוציאטי השייך לאחת מארבע מחלקות.היתוך ארסיה מלא מיידי, היתוך ארסיה מלא מתעכב, נשיקה והפעלה מיידית, או נשיקה וריצה מתעכב. אירוע אקסוציאטי שייך לאחת מארבע הכיתות אם הוא גדול מ- 0.5 והוא ההסתברות הגבוהה ביותר בארבע הכיתות הנשלטות. במקרה זה, האירוע האקסוציאטי הראשון כאן שייך למעמד היתוך ארסיה מלא מיידי, שכן הוא המספר הגבוה ביותר מעל ארבע הכיתות והוא גדול מ - 0.5.בנוסף, ישנם מספר קבצי תכונה אחרים עבור כל ערכת תמונה, אשר משמשים במהלך הסיווג של exocytosis ועשויים לעניין לניתוח נוסף. לבסוף, אם אנחנו רוצים להשתמש בניתוח K של ריפלי על מנת לזהות את הארגון המרחבי-זמני של אקסוציאטוזיס, נתחיל תחילה על ידי פיצול קובץ המסכה שלנו לקובץ מסכת נויריט וקובץ מסכת סומה. נעשה זאת על ידי פתיחת המסכה שלנו ב- Image J.We נרצה להשתמש בדוגם הצבע כדי לבחור פיקסל רקע.וכך, כאשר אנו ממלאים את קובץ המסכה, זה הערך הנכון. לאחר מכן נשתמש בכלי בחירת המצולעים וחלוק לרמות את האזור הסומטי. עכשיו זה דורש קצת קבלת החלטות סובייקטיבית, ידנית.אנחנו מציעים אליפסואיד מחוספס. לאחר שתסיים, לאחר מכן תלך לעריכה, בחירה ויצירה של מסיכה. לבסוף, אתה תחזור לקובץ המסכה המקורי שלנו ותשתמש בעריכה ומלא כדי למלא את הסומה, ועכשיו יש לנו קובץ מסכת נויריט וסומה נפרד, אותו תשמרו לאחר מכן.לאחר ששמרתם את קובץ מסכת הנויריט והסומה הנפרד שלכם, כאן, יש לי את זה כקובץ מסכה להדגיש נויריט ומדגיש סומה, נבוא ל- MATLAB ונפתח את קובץ רשת הנויריט 2D MATLAB. כאן, אנו ננווט את התיקייה הנוכחית לספריה שלנו שבה הפקדנו את כל נתוני הניתוח שלנו. לאחר שנעשה זאת, נשנה את נתיב שם המסכה לקובץ המסכה החדש שלנו שהוא הנויריט.אז במקרה הזה, יש לי את קובץ מסכת הנויריט שלי מתחת לתיקיית קבצי המסכה. לאחר מכן נשנה את שם קובץ CSV למקום שבו ממוקם קובץ המעקבים הפלואורסצנטיים שלנו. במקרה זה, הוא עדיין נמצא בתיקיה קבצי נתונים, ולכן קבצי הנתונים חותכים ואת השם של פלואורסצנטי עוקב אחר קובץ CSV.לאחר השלמת זה, אתה יכול להתחיל לרוץ. לאחר מכן זה ייצור גרסה שלד של קובץ מסכת neurite ולהפקיד אותו כקובץ CSV תחת תיקיית קבצי המסכה, אשר אנו יכולים לראות כאן. הבא ניצור קובץ CSV עבור סומה גם כן.כדי לעשות זאת, פתח את קובץ יוצר מסיכות CSV. תרצו לשים בנתיב את מסיכת הסומה ושם ליצירת קובץ ה- CSV. כאן אני פשוט הלכתי קדימה והשתמשתי באותו שם קובץ בדיוק, רק עם CSV נקודה מצורף.הפעל הפעל, ותראה שקובץ CSV סומה חדש נוצר לצד הנויריט. ברגע שיצרנו את קבצי CSV הן עבור מסכת הנויריט והן עבור מסכת סומה, נוכל להריץ את ניתוח K של ריפלי. כדי לעשות זאת, נווט אל R Studio ונפתח את קובץ R ניתוח K של ריפלי.ישנם שני משתנים עיקריים כאן לשים לב, מסכת נוירון ונקודות נתונים נוירון. מסיכת נוירון תצביע על קבצי המסכה שברצונך להפעיל. במקרה זה, אני מפעיל לראשונה את קבצי מסכת סומה.תרצו להפעיל את כל קבצי מסכת הסומה שלכם בנפרד מכל קבצי מסכת הנוריט שלכם. כאן, יש לי שני נוירונים, אשר אני אשתמש לניתוח זה. עם זאת, אתה יכול להשתמש כמה שאתה רוצה עבור ניתוח K של ריפלי, אתה רק רוצה להעתיק ולהדביק קוד זה עבור מסכת נוירון ולשנות את המשתנה לשלוש, ואילך.המשתנה השני הוא נקודות נתוני נוירונים. כאן ברצונך להצביע עליו לקובץ שנוצר על-ידי כל התכונות שלך, כל קובץ R שחולץ. עכשיו שלי נקרא סטטיסטיקות היתוך, וכך זה מה שהוא קורא כאן.כאמור, יש לי קובץ מסכת סומה שני ונוירונים, אשר מנותח לצד כדי שנוכל לצבור את K של ריפלי יחד. לאחר ששינית נתיבים אלה לנתיב הנכון, תשתמש בקוד, תריץ אזור ותפעיל את הכל. לאחר השלמת הריצה, ייווצרו מספר חלקות, כולל ערכי K המקובצים של ריפלי, כמו גם את חלקות הצפיפות.ניתן לשמור אותם על-ידי ייצוא, שמירת תמונה בשם ובחירת תבנית התמונה המתאימה, הספריה, שם הקובץ ולבסוף הקשה על שמור. כאן אנו רואים תוצאות מייצגות מ -12 נוירונים קליפת המוח מורין מבטאים פורקן פלואור בתמונה של יומיים במבחנה באמצעות מיקרוסקופיה TIRF. ב- A, אנו רואים את התדירות של אקסוציטוזיס מחולקת לפי מעמד.כאן אנו יכולים לראות כי היתוך טוסיק מלא מיידי מתרחש בתדירות גבוהה יותר מאשר הכיתות האחרות. ב- B, אנו יכולים לראות את התפלגות המצב, המאשרת כי היתוך טוסקל מלא מיידי מהווה יותר ממחצית מכל האירועים. ב- C אנו קובעים את ההתפלגות המרחבית של אקסוציאטוזיס כמפת חום.אנו יכולים לראות כי רוב האירועים האקסוציאטיים מקובצים בנקודה חמה ליד הסומה, כמו גם בקצוות הדיסטליים של הנוריטים. ב- D אנו יכולים לקבוע כי אירועים אקסוציאטיים מקובצים באופן סטטיסטי באופן משמעותי, וכי גודלם של אשכולות אלה נע בין חצי מיקרון למיקרון אחד בגודלו. השימוש בתוכנית ניתוח אוטומטית לזיהוי וניתוח נכון של אירועים אקסוציאטיים באופן לא משוחד מגביר את יעילות הניתוח ומשפר את יכולת הרבייה והקפדה.כדי להבטיח דיוק בזיהוי, חשוב לשמור על אות גבוה לרעש במהלך ההדמיה. לכידת אירועים אקסוציאטיים או אירועים ארעיים אחרים הרגישים ל- pH דורשת תדירות הדמיה מהירה מספיק כדי ללכוד את כל האירועים ולשפר הערכות כגון מחצית החיים או שינוי שיא בפלואורסצנטיות. הוכחנו כי לא רק תוכנית זו פועלת ללכידת פלואורסצנטיות רגישה ל- pH בפיתוח נוירונים, אלא גם סוגי תאים אחרים.עם זאת, אם אתה משתמש בסוג תא אחר, חשוב לבדוק אם קיימים הבדלים בדיוק, בשל אופני הפעולה הייחודיים של אירועים ארעיים בסוגי תאים אחרים. סיווג זה שימש רק בפיתוח נוירונים עד כה. ואכן איננו יודעים שתהליכים אלה קיימים בסוגי תאים אחרים או בנקודות זמן התפתחותיות מאוחרות יותר בתאי עצב.

automated-detection-and-analysis-of-exocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים טכניקה לדמיין אקסוציטוזה בתאי פיטום. התאים מודגרים עם FITC-dextran - כתב פלואורסצנטי - אשר נקלט על ידי תאים בתוך גרגירים מפרישים (SGs), שם ה- pH החומצי מרווה את הפלואורסצנטיות שלו. עם גירוי של אקסוציטוזה גרגירית, ה- pH הגבוה יותר של המדיום משרה פלואורסצנטיות כתב בתוך SGs מאוחים, אשר מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

טכניקת מבחנה לדמיין אקסוציטוזה של גרגרי הפרשה בתאי פיטום

אנדוציטוזיס בתיווך קלת'רין, תהליך מהיר ודינמי ביותר שמפנים חלבונים רבים, כולל קולטני איתות. הפרוטוקול המתואר כאן מדמיין ישירות את הקינטיקה של אירועים אנדוציטיים בודדים. זה חיוני להבנת האופן שבו חברי הליבה של המנגנון האנדוציטי מתאמים זה עם זה, וכיצד מטען החלבון משפיע על תהליך זה.

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

שיטות שונות רבות קיימות למדידה של שלפוחית ​​תאית (EVS) באמצעות cytometry זרימה (FCM). כמה היבטים יש לשקול בעת קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. שני פרוטוקולים לכלי רכב חשמליים מדידה מוצגים, או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז.

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

המטרה של הפרוטוקול הנוכחי הייתה לפתח שיטה שתאפשר ניתוח הגנומי תפקודי של הפרשת תא פיטום. הפרוטוקול מבוסס על הערכה כמותית של שחרורו של גן כתב ניאון cotrasfected עם הגן של עניין וזמן אמת ניתוחים של המורפולוגיה של גרגר ההפרשה.

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis

שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

מתח osmotic משפיע אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שפורסמו במהלך תהליך זה. נדגים כיצד שילוב שיטות אלקטרוכימיות יחד עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על פעילות אקסוציטוזה, שלפוחית quantal בגודל כמות הנוירוטרנסמיטר משוחרר במהלך אקסוציטוזה.

ניטור השפעת Osmotic הלחץ על שלפוחית הפרשה, אקסוציטוזה

כאן אנחנו פירוט שיטת הדמיה תא בשידור חי של אקסוציטוזה מוסדר. שיטה זו משתמשת FITC-לתוספי, אשר צוברת ב הקשורות ליזוזום organelles, בתור כתב. שיטה פשוטה זו מאפשרת גם הבחנה בין מצבים שונים של אקסוציטוזה מווסתת בתאים קשה לתמרן גנטית.

הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

הדמיה חיה של אקסוציטוזיס ליזומלי על תאים מיקרו-פטרניים מאפשרת כימות מרחבית של תהליך זה. נורמליזציה מורפולוגית באמצעות מיקרו-פטרנים היא כלי יוצא מן הכלל לחשיפת כללים כלליים לגבי ההפצה המרחבית של תהליכים סלולריים.

כימות פרמטרים Spatiotemporal של אקסוציטוזיס תאי בתאים Micropatterned

פרוטוקול זה מתאר גישות לזיהוי וכמות של הבלטות גדולות של צבירה ו/או אורגנל (~4 μm) המיוצרות על ידי תאי C. elegans בצורה של exophers המאוגדים קרום. אנו מתארים זנים, תנאי גדילה, קריטריונים ניקוד, תזמון, ושיקולי מיקרוסקופ הדרושים כדי להקל על ניתוח של מנגנון גירוש פסולת זה.

גישות כמותיות לניקוד ב-vivo Neuronal Aggregate ו-Organelle הבלטה בוויקות Exopher גדולות ב C. elegans

חקור זיהוי וניתוח אוטומטיים של אקסוציאטוזיס באמצעות מיקרוסקופיית TIRF ותוכנת MATLAB. השיטה מאפשרת סיווג ארבעה מצבי היתוך וניתוח מרחבי-זמני של אירועים בתאי עצב.

זיהוי וניתוח אוטומטיים של אקסוציאטוזיס

גלה סרטונים נוספים