לחקור ^m6A ו- ^m5C Epitranscriptomes על זיהום ויראלי: דוגמה עם HIV

היי, בסרטון הזה נראה לכם איך לחקור את האפילטרנום m6A ו- m5C על זיהום ויראלי. כדי להתחיל את הניסוי, תצטרך 50 מיליון תאים עבור הלא נגועים ו -50 מיליון למצב הנגוע. על מנת לקבל ערכת נתונים באיכות גבוהה בעת הניתוח, תצטרך להשיג זיהום אוניברסלי.

כאן אנו מדביקים תאים אלה בווקטור מבוסס HIV ומודדים את GFP המקודד באופן ויראלי על ידי FACS. במקרה זה, היו לנו 80% מהתאים הנגועים והמשכנו בזרימת העבודה החל מיצוי RNA כולל. אז חילקנו את התאים באליקוטים של 10 מיליון כל אחד וחילקו אותם ב-1 מ"ל של טריזול.

לאחר מכן הוספנו 200 מיקרוליטר של כלורופורם לתא lysate מעורב על ידי היפוך. בשלב זה, אנו נותנים ליסייט לשבת במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צנטריפוגה כל הדגימות במהירות גבוהה במשך 15 דקות בארבע מעלות. אתם תצפו לראות הפרדת פאזה בשלושה שלבים שונים, כפי שמוצג כאן.

RNA יושב בשלב העליון, אז בזהירות להעביר את השלב מימי לתוך צינור טרי על ידי תשומת לב לא להעביר את השכבה האורגנית. בשלב זה, להוסיף 0.5 מ"ל של איזופרופנול לשלב מימית ולערבב בזהירות על ידי היפוך. לאחר מכן ניתן לדגור דגימות שעה אחת ב-80 מעלות כדי להבטיח משקעים של RNA.

עם צנטריפוגה במהירות גבוהה, אתה אמור להיות מסוגל לראות כדור RNA נחמד כפי שמוצג כאן. בזהירות להשליך את supernatant או על ידי היפוך או על ידי pipetting, לשים לב לא לשבש את הכדור. ואז לשטוף את גלולה RNA עם mL אחד של 75% אתנול מולקולרי כיתה.

ומערבולת המדגם בקצרה. עם צנטריפוגה, הקפד לאחזר כדורי RNA לבן נחמד. להשליך את supernatant ולתת גלולה RNA יבש במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לשפץ כל גלולה ב 20 מיקרוליטר של מים ובריכה כל מדגם מאותו מצב יחד. סה"כ RNA מוכן כעת לבידוד mRNA על ידי בחירת poly-A. עבור כל מדגם של 75 מיקרוגרם של RNA, להכין 200 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים oligo-DT ולשטוף אותם במ"ל אחד של חיץ מחייב.

מניחים את הצינור על מעמד מגנטי ומאפשרים לחרוזים להיקשר למגנט במהלך תערובת אחת. להשליך את supernatant ולחזור על ההליך עבור שטיפה שנייה. לאחר מכן להסיר את החרוזים מן הדוכנים המגנטיים ולהחזיר אותם בזהירות 100 מיקרוליטר של חיץ מחייב.

בשלב זה, להכין את מדגם RNA על ידי חלוקתם ב 75 מיקרוגרם של RNA לכל aliquot resuspended ב 100 microliter של מים. מוסיפים 100 מיקרוליטר של חיץ כריכה ודגרה במשך שתי דקות ב 65 מעלות. ואז לסובב את הדגימות ודגרה על קרח.

הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים שטופים לכל דגימת RNA ואפשרו כריכה על גלגל מסתובב למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, מניחים את הצינור בחזרה לתוך מתלה מגנטי ולתת להם לדגור במשך דקה אחת. ואז לשחזר את supernatant לתוך צינור טרי ולשמור אותו בצד לסיבוב שני של בידוד.

לשטוף את החרוזים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה ולאחר מכן להמשיך אל ההמלטה. על מנת לברוח פולי-A נבחר RNA מן החרוזים המגנטיים, להוסיף 20 מיקרוליטר של HCl TRIS קר כקרח לכל מדגם פיפטה בזהירות. ואז לדגור הדגימות שלך ב 80 מעלות במשך שתי דקות כדי לשחרר את RNA מהחרוזים.

העבר את supernatant המכיל פולי-A נבחר RNA לצינור טרי, להיות זהיר בהימנעות חרוזים לשאת. יש לחזור על שלב ההתחמקות, כמו גם על צעד הבידוד פעמיים על מנת להגדיל את תפוקת ה-mRNA. mRNA מוכן כעת להיכנס לצינור meRIP-Seq בשלב הפיצול או לעבור ישירות להמרת ביסולפיט.

השלב הראשון לכניסה לצינור meRIP-Seq מורכב מפיצול mRNA. בשביל זה, אתה צריך חמישה מיקרוגרם של mRNA מחולק aliquots של 18 microliter בצינורות 0.2 מ"ל. על מנת להבטיח נתונים עקביים, חיוני לעבוד במהירות ועם מדגם מעט בלבד באותו זמן.

לניסוי זה, הפיצול עבר אופטימיזציה על מנת להשיג שבר בגודל שבין 115 ל-200 נוקלאוטידים. לאחר מכן להוסיף שני microliter של ריאגנט פיצול לכל צינור המכיל 18 microliter של mRNA להיות זהיר בהפקדת טיפה על קיר הצינור. ספין את כל הדגימות על מנת לאפשר מגע בין ריאגנט ו RNA באותו זמן ודגורה ב 70 מעלות במשך 15 דקות.

לאחר שהדגרה מסתיימת, הפסיקו את התגובה על ידי הוספת שני מיקרוליטר של 0.5 M EDTA. בשלב זה, אתה יכול לטהר mRNA מקוטע שלך עם שיטת הבחירה שלך ולהמשיך בקרת איכות RNA על ידי מנתח שברים. שלב זה הוא אופציונלי, אך הוא יאפשר להעריך את גודל הקטע לפני הפעלת משקעי RNA.

כפי שניתן לראות כאן בנתיב הרביעי, אנו משיגים עבור שבר הדגימה שלנו של כ -150 נוקלאוטיד כל אחד. לאחר מכן המשכנו עם meRIP-Seq. השלב הראשון מורכב מכמה חרוזים מגנטיים A/G עם נוגדנים אנטי-m6A או פקדי IgG.

עבור כל תוכנית תגובה, העבר 25 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים לצינור טרי. אנא שימו לב כי תזדקקו לפחות למצב אחד ספציפי ל-m6A ולתנאי בקרה אחד. לשטוף כל 25 microliter של חרוזים עם 250 microliter של חוצץ IP.

יש לתתכנו מחדש בעדינות את החרוזים על ידי צנרת מעלה ומטה ומניחים את הצינור על המדף המגנטי למשך דקה אחת על מנת לאפשר הפרדת חרוזים. הסר והשלך את supernatant, לשים לב לא שאיפה חרוזים מגנטיים ולחזור על שלב לשטוף פעם אחת. לאחר מכן resuspend החרוזים המגנטיים ב 100 microliter של מאגר IP לכל 25 microliter של נפח המקורי של חרוזים.

להכין ולתייג צינור אחד לכל תנאי. במקרה שלנו, יהיו לנו שני צינורות למצב הנגוע, אחד עבור m6A ואחד לשליטה IgG, ושני צינורות למצב שאינו נגוע. לאחר מכן להוסיף 100 microliter של חרוזים שטופים בכל צינור.

החרוזים מוכנים כעת להיות יחד עם נוגדנים ספציפיים או פקדי IgG. הוסף חמישה מיקרוגרם של נוגדן אנטי-m6A ספציפי או נוגדן בקרה אנטי-IgG לכל צינור המכיל 100 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים שטופים. אפשר הטיות נוגדנים-חרוזי על ידי דגירה הצינור 30 דקות על גלגל מסתובב.

בינתיים, להמשיך עם הכנת מדגם. עבור כל תנאי מתוכנן, או m6A ספציפי או בקרת IgG, החומר ההתחלתי שלך יהיה 2.5 מיקרוגרם של mRNA מקוטע resuspended 100 microliter של מים. כדי לקבל נפח תגובה סופי של 500 מיקרוליטר, הוסף 295 מיקרוליטר מים לכל דגימה.

מוסיפים אז חמישה מיקרוליטרים של מעכבי RNAase מרוכזים ב-40 יחידות למיקרוליטר לכמות כוללת של 200 יחידות לדגימה ומערבבים בעדינות. לבסוף להוסיף 100 microliter של 5X מרוכז מאגר IP לכל צינור. הדגימות מוכנות כעת לתגובת המשקעים החיסונית.

לאחזר את החרוזים המגנטיים יחד עם נוגדן מהגלגל המסתובב ולסובב אותם למטה. הוסף אז 500 מיקרוליטר של הדגימות שהוכנו בעבר לכל 100 מיקרוליטר של חרוזים יחד עם הנוגדנים הספציפיים. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים כדי resuspend החרוזים לחלוטין.

לדגור אותם או תגובת meRIP שלך על גלגל מסתובב בארבע מעלות במהלך שעתיים. לאחר הדגירה נגמרת, לסובב את כל צינור ומניחים אותם על מתלה מגנטי במשך דקה אחת כדי לאפשר הפרדת חרוזים. לאחר מכן להסיר את השבר הלא מאוגד ולהניח אותו על צינור טרי ולשמור אותו לניתוח נוסף, במידת הצורך.

הסר את המגנט מן המדף ו resuspend כל הדגימות ב 500 microliter של מאגר IP. יש לבחון מחדש כל דגימה בזהירות על ידי צנרת למעלה ולמטה. הכנס את המגנט על המדף, דגירה במשך דקה אחת ולאחר מכן להסיר בזהירות את supernatant.

חזור על הכביסה פעמיים, ולאחר מכן להמשיך עם elution. עבור כל זוג של מדגם, m6A ספציפי ושליטה, להכין 225 microliter של מאגר elution המכיל 20 מילימולר של m6A מטוהר. לאחר מכן להוסיף 100 microliter של חוצץ elution לכל מדגם.

לדגור כל מדגם שעה אחת בארבע מעלות על רוקר. לאחר מכן לאסוף את כל דגימת RNA מועשר m6A בצינור טרי ולהמשיך עם סיבוב שני של elution. לטהר את m6A מועשר RNA עם שיטת הבחירה שלך ולאחר מכן בשלב זה דגימות מוכנות להכנת הספרייה ורצף.

כדי לחקור את השינוי m5C, אנו משתמשים בהמרת ביסולפיט. התחל את הניסוי עם 500 ננוגרם של RNA פולי-אדנילאט. למרות שזה אופציונלי, הוספה לדגימה שלך 500 פיקוגרמה של RNA מדולדל פולי-A כדי להבטיח ייצוג ריבוזומלי ו- 0.5 מיקרוליטר של רצף סינטטי זמין מסחרית יאפשר לך להעריך את קצב ההמרה של ביסולפיט בעת הרצף.

כוונן את הדגימה לנפח סופי של 20 מיקרו-ליטר במים ולאחר מכן הוסף 130 מיקרוליטר של ריאגנט המרת RNA לכל דגימה. מערבבים בזהירות על ידי צנרת למעלה ולמטה ולסובב את כל המדגם כדי לוודא כי לא נותרו טיפות בצד הצינורות. לדגור את כל המדגם במכונת PCR במשך שלושה מחזורים של denaturation 70 מעלות במשך חמש דקות המרת bisulfite ב 54 מעלות במהלך 45 דקות.

בצעו דיאציה בעמודה על ידי הוספה ישירה לעמודה ריקה, 250 מיקרוליטר של מאגר איגוד RNA, 150 מיקרוליטר של המדגם המומר ביסולפיט שלך. ערבבו את המדגם על ידי צנרת למעלה ולמטה, אך שימו לב לא לגעת במסנני העמודות. הוסף 400 מיקרוליטר של 95-100% אתנול לתערובת מאגר איגוד RNA מדגם ישירות בעמודה.

סגור את המכסה ומערבב מיד על ידי היפוך. סובב את הדגימה שלך למשך 30 שניות ומחק את הזרימה. שטפו את העמוד שלכם עם מאגר כביסה ולאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטר של פתרון desulphonation למרכז כל עמודה.

דגרו את כל הדגימה שלכם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ספין את המדגם במשך 30 שניות ולאחר מכן להמשיך עם שני סיבובים של כביסה. הוסף 400 מיקרוליטר של חוצץ כביסה לכל מדגם, צנטריפוגה במשך 30 שניות במלוא המהירות ולהשליך את הזרימה דרך.

מניחים את העמוד לתוך צינור ריק חדש ולחמוק RNA bisulfite המרה לתוך 20 microliter של מים. שלוט ביעילות ההמרה של ביסולפיט על-ידי RT-qPCR ולאחר מכן המשך להכנה ולרצף של הספריה. לאחר ניתוח ביו-אינפורמטי, הנה דוגמה לתוצאות שאתה עשוי להשיג עם זרימת עבודה זו.

כאן אנו משווים את epitranscriptome של תאים נגועים ב- HIV לעומת תאים שאינם נגועים. בשעה 24 שעות לאחר ההדבקה. בחלונית A, ניתן לראות את התוצאות שאנו משיגים בחקר האפיטראניום m6A.

בגרף זה, אנו מתווים את קריאות מועשר m6A על ניתוח meRIP-Seq. אנחנו יכולים לראות יפה אצבע אבץ הוא hypermethylated 24 שעות לאחר זיהום. ביצענו את אותו סוג של ניתוח עבור חקירת epitranscriptome m5C בפאנל B.In גרף זה, כל ציטוסין ללא מתיל מוצג באדום, בעוד שיעור של ציטוסין כי כבר m5C מתילציה מוצג בכחול.

כפי שאתה יכול לראות, PHLPP1, כל שלושת ציטוצינים כי הם היפר-מתילציה 24 שעות ביממה לאחר הידבקות ב- HIV. בסך הכל, זרימת עבודה זו מאפשרת לחקור הן את ה- M6A והן את האפיטרנום m5C של תאים נגועים וניתן ליישם אותה ככזו גם על חלקיקים ויראליים. הבנה של זיהום ויראלי מסוגלים לשנות את הנוף האפיטרנכתובי המארח ייתן לנו גישה לשכבה חדשה של רגולציה.

חקירת תמלילים מתילניים דיפרנציאליים על זיהום ויראלי תספק כמובן משאב בעל ערך להתערבות טיפולית חדשה. בקישור כאן להלן תוכלו למצוא את משאב הגישה הפתוחה שלנו לחקירה של תמליל מתילן דיפרנציאלי על הידבקות ב- HIV לאורך זמן.