Name: ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: למדו פרוטוקול סטנדרטי לניתוח מעקב חלקיקים לכימות וסיווג גודל של שלל חוץ-תאי מרקמות עכבר ופלזמה אנושית. השיטה מגבירה את הריגור והשחזוריות במחקר שלל חוץ-תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). אנו מכירים את ג'פרי בודיקומב, Ph.D. של HORIBA מכשירים בע"מ על עזרתו בכיול המכשיר.

<ol><li>Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li>
<li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+%28exosomes%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li>
<li>Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages%3A+for+good+or+for+bad%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li>
<li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2, 1800021(2018).</li>
<li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methods+of+choice+for+extracellular+vesicles+%28EVs%29+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li>
<li>Erdbrügger, U., Lannigan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+challenges+of+extracellular+vesicle+detection%3A+A+comparison+of+different+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Extracellular+Vesicles%3A+General+Methodologies+and+Latest+Trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, San Diego, California. 3-10 (2015).</li>
<li>Desdín-Micó, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion & Migration. 11, 127-134 (2017).</li>
<li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology & Medicine. 108, 334-344 (2017).</li>
<li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569(2017).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li>
<li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421(2012).</li>
<li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+Research%22%5BJournal%5D)">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li>
<li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li>
<li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li>
<li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li>
<li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li>
<li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li>
<li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 525-534 (2012).</li>
<li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+%28NTA%29+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li>
<li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016(2019).</li>
<li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li>
<li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li>
<li>Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li>
<li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohren%2C+CF+%22Absorption+and+Scattering+of+Light+by+Small+Particles%22">Absorption and Scattering of Light by Small Particles</a>. , John Wiley & Sons. (1983).</li>
</ol>

כל המחברים הצהירו כי אין ניגודי עניינים.

כאן, אנו מדגימים פרוטוקול עבור NTA של EVs כדי למדוד את התפלגות הגודל של מגוון רחב של גדלי חלקיקים בו זמנית ולמדוד את הריכוז הכולל של EV במדגם polydisperse. במחקר זה, רקמת השומן perigonadal עכבר ופלזמה אנושית שימשו כמקור של כלי עבודה אלקטרוניים. עם זאת, EVs מבודד מרקמות אחרות או נוזלים ביולוגיים כגון סרום, שתן, רוק, חלב אם, מי השפיר, תרבית תאים supernatant עשוי לשמש גם עבור NTA. מדידות של תקני חרוזים פוליסטירן הבטיחו כי המכשיר היה מכויל כראוי והוכיח כי מכשיר NTA זה יכול למדוד כראוי את הגודל של חלקיקים ≤400 ננומטר. דילולים...

שלשלות חוץ-תאיות (EVs) הן שלשלות קטנות (0.03-2 מיקרומטר) הקשורות לקרום המופרשות על ידי כמעט כל סוגי התאים1. הם מכונים לעתים קרובות "exosomes", "microvesicles", או "גופים אפופוטוטיים" בהתאם למנגנון השחרור שלהם וגודל2. אמנם בתחילה חשבו כי EVs היו פשוט אמצעי לחיסול פסולת מהתא כדי לשמור על הומאוסטזיס3, עכשיו אנחנו יודעים שהם יכולים גם להשתתף בתקשורת בין תאית באמצעות העברת חומר מולקולרי - כולל DNA, RNA (mRNA, microRNA), שומנים, וחלבונים4,5 - וכי הם רגולטורים חשובים של פיזיולוגיה נורמלית, כמו גם תהליכים פתולוגיים1, 5,6,7,8.
ישנן שיטות רבות ושונות כדי לבודד ולכומת EVs, אשר תוארו במקומות אחרים9,10,11,12. פרוטוקול הבידוד המשמש, כמו גם את המקור של EVs יכול להשפיע מאוד על תשואה EV וטוהר. אפילו צנטריפוגה דיפרנציאלית, שנחשבה זה מכבר לגישת "תקן הזהב" לבידוד אקסוזום, יכולה להיות כפופה לשינויים משמעותיים המשפיעים לאחר מכן על אוכלוסיית EV שהושגה ובניתוחים במורד הזרם13. לכן, המתודולוגיות השונות לבידוד וכימות EV מקשות על השוואה, שחזור ופרשנות של תוצאות ניסויים שדווחו בספרות14. יתר על כן, שחרור EV יכול להיות מוסדר על ידי תנאים הסלולר או גורמים חיצוניים שונים. הוצע כי EVs לשחק תפקיד בשמירה על הומאוסטזיס הסלולר על ידי הגנה על תאים מפני מתח תאי15, כמו מספר מחקרים הראו כי מתח תאי מגרה הפרשת EV. לדוגמה, שחרור EV מוגבר דווח לאחר חשיפה תאית היפוקסיה, לחץ רשתית אנדופלסמי, עקה חמצונית, מתח מכני, תמצית עשן סיגריות, זיהום אוויר חומר חלקיקי16,17,18,19,20,21,22. גם שחרור EV הוכח להיות שונה ב vivo; עכברים נתונים לתזונה עתירת שומן או צום במשך 16 שעות שחררו יותר adipocyte EVs23. כדי לחקור אם טיפול או מצב ספציפיים משנים את שחרור EV, יש לקבוע במדויק את מספר ה- EVs. הערכת התפלגות גודל הרכב הרך EV עשויה גם להצביע על המקור התת-תאי השולט של רכבים לוויוניים (למשל, היתוך של אנדוזומים מאוחרים/גופים רב-תאיים עם קרום הפלזמה לעומת ניצנים של קרום הפלזמה)24. לכן, יש צורך בשיטות חזקות כדי למדוד במדויק את הריכוז הכולל ואת התפלגות הגודל של הכנת EV הנלמדת.
שיטה מהירה ורגישה מאוד להדמיה ואפיון של EVs בפתרון היא ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA). הסבר מפורט על עקרונות שיטה זו והשוואה עם שיטות חלופיות להערכת גודל EV וריכוז תוארו בעבר25,26,27,28. בקצרה, במהלך מדידת NTA, EVs דמיינו על ידי האור הפזור כאשר הם מוקרן עם קרן לייזר. האור המפוזר מתמקד במיקרוסקופ למצלמה המתעד את תנועת החלקיקים. תוכנת NTA עוקבת אחר התנועה התרמית האקראית של כל חלקיק, המכונה תנועה בראונית, כדי לקבוע את מקדם הדיפוזיה המשמש לחישוב הגודל של כל חלקיק באמצעות משוואת סטוקס-איינשטיין. NTA הוחל לראשונה על מדידת EVs במדגם ביולוגי בשנת 201125. עד לאחרונה, היו רק שתי חברות מיינסטרים המציעות מכשירים מסחריים של NTA29 עד כניסתו של ViewSizer 3000 (להלן מכשיר מעקב חלקיקים) המשתמש בשילוב של פתרונות חומרה ותוכנה חדשניים כדי להתגבר על מגבלות משמעותיות של טכניקות NTA אחרות.
מכשיר המעקב אחר חלקיקים מאפיין חלקיקים בדגימות נוזליות על ידי ניתוח התנועה הבראונית שלהם ומאפיין חלקיקים גדולים יותר בגודל מיקרון על ידי ניתוח התיישבות כבידה. המערכת האופטית הייחודית של מכשיר זה, הכוללת תאורה רב-ספקטרלית עם שלושה מקורות אור לייזר (ב-450 ננומטר, 520 ננומטר ו-635 ננומטר), מאפשרת לחוקרים לנתח מגוון רחב של גדלי חלקיקים (למשל אקסוזומים, מיקרו-vesicles) בו זמנית. תרשים של הגדרת המכשיר מוצג באיור 1.
כאן, אנו מדגימים כיצד לבצע התפלגות גודל חלקיקים ומדידות ריכוז של עכבר מבודד ו- EVs אנושי באמצעות מכשיר NTA חדשני.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> איור 1: מערכת אופטית של מכשיר מעקב חלקיקים. מכשיר NTA מאיר חלקיקים באמצעות שלושה לייזרים עם אורכי הגל הבאים: 450 ננומטר, 520 ננומטר, 635 ננומטר. הקלטת וידאו של האור המפוזר מחלקיקים בודדים מזוהה ומעקב על ידי מצלמת וידאו דיגיטלית מכוונת 90 ° מן cuvette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>1X dPBS</td><td>VWR</td><td>02-0119-1000</td><td>לדילול דגימות</td></tr><tr><td>100 ננומטר חרוז סטנדרטי</td><td>Thermo Scientific</td><td>3100A</td><td>לבדיקת ViewSizer 3000 כיול</td></tr><tr><td>400 ננומטר תקן חרוז</td><td>Thermo Scientific</td><td>3400A</td><td>לבדיקת ViewSizer 3000 כיול</td></tr><tr><td>יחידת מסנן צנטריפוגלי</td><td>Amicon</td><td>UFC901024</td><td>לסינון צינורות איסוף מדלל PBS</td></tr><tr><td>, 2 מ"ל</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td>לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות פלזמה אנושית</td></tr><tr><td>אבק אוויר דחוס</td><td>DustOff</td><td>DPSJB-12</td><td>לניקוי קובטות</td></tr><tr><td>הכנסת קובטה</td><td>HORIBA</td> <td>מדעית-מסופק</td> <td>עם רכישת ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>ג'יג קובטה</td><td></td> <td>HORIBA מדעי-ליישור</td> <td>מוט ערבוב מגנטי תוך הנחת תוספות בתוך קובטה; מסופק עם רכישת ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>מים דה-יוניזציה</td><td>VWR</td><td>02-0201-1000</td><td>לניקוי קובטות</td></tr><tr><td>מחשב שולחני עם צג, מקלדת, עכבר וכל הכבלים הדרושים</td><td></td> <td>Dell-מסופק</td> <td>עם רכישת ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>אתנול (70-100%)</td><td>Millipore Sigma-לניקוי</td><td></td> <td>קובטות</td></tr><tr><td>ExoQuick ULTRA</td><td>System Biosciences</td><td>EQULTRA-20A-1</td><td>לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות פלזמה אנושית</td></tr><tr><td>בקבוקוני נצנוץ מזכוכית עם מכסים</td><td>Thermo Scientific</td><td>B780020</td><td>לניקוי קובטות</td></tr> <tr><td>כלי "הוק"</td><td>Excelta-מסופק</td><td></td> עם רכישת בד מיקרופייבר נטול <td>מוך ViewSizer 3000</td></tr><tr><td></td><td>Texwipe</td><td>TX629</td><td>לניקוי קובטות וכיסוי משטח עבודה</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה, 2 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td>לבידוד שלפוחיות פלזמה חוץ-תאיות אנושיות</td></tr><tr><td>מוט ערבוב</td><td>Sp Scienceware</td><td>F37119-0005</td><td></td></tr><tr><td>קובטה סופראסיל קוורץ עם כובע</td><td>Agilent Technologies</td><td>AG1000-0544</td><td>מסופק בתחילה עם רכישת ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>ViewSizer 3000</td><td>HORIBA</td> <td>מכשיר מעקב מדעי-ננו-חלקיקים</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

התפקידים הפיזיולוגיים והפתופיזיולוגיים של שלשלות חוץ תאיות (EVs) הפכו מוכרים יותר ויותר, מה שהופך את שדה הרכב התגנבות לתחום מחקר המתפתח במהירות. ישנן שיטות רבות ושונות לבידוד EV, כל אחת עם יתרונות וחסרונות ברורים המשפיעים על התשואה במורד הזרם וטוהר של EVs. לכן, אפיון הכנת EV מבודד ממקור נתון על ידי שיטה שנבחרה חשוב לפרשנות של תוצאות במורד הזרם והשוואת תוצאות על פני מעבדות. קיימות שיטות שונות לקביעת הגודל והכמות של כלי עבודה אלקטרוניים, אשר ניתן לשנות על ידי מצבי מחלה או בתגובה לתנאים חיצוניים. ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) היא אחת הטכנולוגיות הבולטות המשמשות לניתוח תפוקה גבוהה של EVs בודדים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לכימות וקביעת גודל של כלי עבודה אלקטרוניים מבודדים מרקמת שומן perigonadal עכבר ופלזמה אנושית באמצעות טכנולוגיה פורצת דרך עבור NTA המייצגת התקדמות משמעותית בתחום. התוצאות מראות כי שיטה זו יכולה לספק נתוני ריכוז חלקיקים כוללים וחלוקת חלקיקים חוקיים לשחזור עבור EVs המבודדים ממקורות שונים בשיטות שונות, כפי שאושר על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור. ההתאמה של מכשיר זה עבור נת"ע תתייחס לצורך בתקינה בשיטות נת"ע להגברת ההקפדה והשחזור במחקרי EV.

לפני הדגמה זו, הכיול של המכשיר נבדק לראשונה כדי להבטיח את תוקפם של הנתונים שנרכשו על ידי מדידת התפלגות הגודל של תקני חרוזים פוליסטירן. בדקנו את התפלגות הגודל של חרוזים של 100 ננומטר ו- 400 ננומטר באמצעות פרמטרי ההקלטה המוגדרים כברירת מחדל והגדרות העיבוד המומלצות בפרוטוקול זה (איור 8).
עבור תקן חרוז פוליסטירן 100 ננומטר, נמדד ריכוז של 4.205 x 107 חלקיקים/מ"ל. הגודל הממוצע (סטיית תקן, SD) היה 102 (±17) ננומטר עם מקדם של וריאציה (CV) של 0.16. ערכי D10/D50/...

אנו מדגימים כיצד להשתמש במכשיר ניתוח ננו-חלקיקים חדשני כדי להעריך את התפלגות הגודל ואת ריכוז החלקיקים הכולל של שלל חוץ תאי מבודד רקמת שומן perigonadal עכבר ופלזמה אנושית.

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

תוצאות NTA נוטות מאוד להטות מפעיל. פרוטוקול זה מדגים את ההשפעות של פרמטרי NTA שהשתנו על תוצאות שהושגו. שיטה מתוקננת תסייע להגביר את ההקפדה והשחזור בניתוח NTA.ניתוח המדגם בקובט מאפשר ללכוד דגימה אקראית סטטיסטית בכל סרטון. התוצאה היא נתונים ניתנים לשחזור יותר והדמיה של חלקיקים על פני מגוון רחב של גדלים. כמו מקבל מדגם בטווח ריכוז החלקיקים המומלץ יכול להיות קשה, הקפד לבצע דילול סדרתי כדי לזהות את גורם הדילול האידיאלי.מדגים את ההליך יהיה קונגהנג קאי, דוקטורנט מהמעבדה של אנתוני פרנטה. כדי להכין cuvette לניתוח מעקב ננו-חלקיקים, לכסות את סביבת העבודה עם חומר ללא מוך כדי למנוע סיבים מלהיכנס cuvettes. לובשים כפפות, מניחים cuvette המכיל מוט ערבוב על ג'יג cuvette מגנטי.השתמש בכלי וו כדי למקם את ההוספה לתוך cuvette עם חריץ של התוסף גלוי בחלק הקדמי של cuvette. השתמש פיפטה להוסיף לאט 400 עד 500 microliters של שלפוחיות חוץ תאיות מטוהרות על cuvette דרך החור בהכנס ומערבבים את המדגם על ידי pipetting בעדינות מבלי להציג בועות אוויר, ולאחר מכן לכסות את cuvette, הקשה על בועות לפי הצורך ולהשתמש בד ללא מוך כדי לנגב את המשטח החיצוני של cuvette. כדי לנתח את ריכוז החלקיקים של הדילול או המדגם, הפעל את תחנת העבודה והמכשיר של המחשב והפעל את תוכנית ניתוח מעקב החלקיקים.כאשר תתבקש, לחץ על NTA ופתח את כרטיסיית ההקלטה. בצע את ההוראות המופיעות על המסך כדי למלא את כל המידע לדוגמה הדרוש. לניתוח מעקב אחר EV, הגדר את הדילול ל- PBS.המליחות תאכלס אוטומטית ל -9%כדי להשיג את ריכוז החלקיקים המדולל או המדגם, פתח את מכסה המכשיר והסר את מכסה המגן המכסה שבו יוצב הקובט. טען את cuvette לתוך המכשיר בכיוון הנכון עם החרץ של להוסיף מול המצלמה ולהחליף את המכסה ואת מכסה המכשיר. לחץ על חץ ההזרמה כדי להפעיל את המצלמה ולחץ על חץ הסוגריים הזוויתיים כדי להרחיב את הגדרות הרשומה.התאם את המוקד עד שהחלקיקים הקטנים יחסית וגלים בבירור. כדי להגדיר את הניתוח לכימות EV קטן, הגדר את קצב הפריימים ל- 30 פריימים לשנייה, את החשיפה ל- 15 אלפיות השנייה, את זמן ההמתנה לחמש שניות, את זמן ההמתנה לשלוש שניות, את כוחות הלייזר הכחול, הירוק והאדום ל- 210, 12 ו- 8 מילי וואט בהתאמה, את המסגרות לסרטון ל - 300 ואת הרווח ל - 30 דציבלים. התאם את המוקד עד שהחלקיקים הקטנים יחסית וגלים בבירור.הגדלת הזום ו/או הרווח יכולה לעזור עם התמקדות החלקיקים. אבל אם תגדיל את הרווח, זכור להגדיר אותו ל 30 דציבלים לפני ההקלטה. לאחר שחלקיקים נמצאים במוקד, הגדר את הגדרת גודל התצוגה לפי 0.5 כדי לחסוך רוחב פס ולמנוע מסגרות אובדן ולחץ על הקלטה כדי להתחיל להקליט את הווידאו.כאשר מופיעה בקשה המציינת שהסרטונים הוקלטו, לחץ על אישור כדי להשלים את ההקלטה ובחר בכרטיסיית התהליך. אם חלקיקים גדולים מאוד נראו בכל סרטון בזמן ההקלטה, נווטו לספריה של סרטונים מוקלטים והסירו כל סרטון בעייתי לפני העיבוד. סמן את התיבה בטל עקיפה של זיהוי שמע והגדר את קוטר התכונה ל- 30.לחץ על תהליך כדי ליזום עיבוד וידאו ולהציג גרף הפצה חי. לאחר השלמת העיבוד, לחץ על אישור ובחר בכרטיסיית התוויית התוויה. עבור כלי רטטוי, הצג את התרשים הראשי כסיליקה של יומן רישום.ניתן להתאים אישית תכונות אחרות של הגרף, כגון שינוי ציר ה- x כדי להגדיר את האזור לשילוב הדמות המיוצרת. ליצירת דוח PDF של התוצאות, לחצו על לחצן 'דוח'. הממוצע, החציון, גודל המצב והריכוז המותאמים לגורם הדילול ורוחב ההפצה יוצגו.NTA של דילול צריך להתבצע לפני כל מדגם, כך הריכוז של ריק זה ניתן להפחית את ריכוז חלקיקי מדגם EV. כדי לנקות את cuvettes לאחר הניתוח, לרוקן את cuvette ולמלא לחלוטין את cuvettes 10 עד 15 פעמים עם מים deionized ואת שלוש פעמים עם 70 עד 100%אתנול כדי להסיר כל דגימה שיורית. יבשו את החלק החיצוני של הקובטים עם בד מיקרופייבר נטול מוך וייבשו את החלק הפנימי עם מטלית אוויר דחוסה.כדי לנקות את התוספות ומערבבים את הסורגים, מניחים את החומרים ב בקבוקון נוצץ מזכוכית המכיל 70 עד 100% אתנול ומנערים את הנקניקיה במרץ. לאחר מכן לשטוף את תוספות ומערבבים ברים במים deionized עם רועד כפי שהוכח ולייבש אותם באמצעות מטליות ללא מוך. לאחר הייבוש, יש להניח מיד את כל הרכיבים הנקיים באחסון עד לניתוח הבא.לפני ביצוע ניתוח, כיול המכשיר נבדק באמצעות חרוזי פוליסטירן כדי להבטיח את תוקפם של הנתונים שנרכשו. כפי שנצפה, מכשיר מעקב החלקיקים דיווח במדויק על גודלם של חרוזי המנודיספרס 100 ננומטר, אך דיווח רק מקרוב על גודלם של חרוזי 400 ננומטר. לכן, הגדרות המכשיר עבור פרוטוקול זה היו מדויקות יותר עבור חלקיקים קטנים יותר, קרוב יותר 100 ננומטר בגודל.באמצעות הגדרות אלה, דיווח על ריכוז חלקיקים בהתאם עם גורם דילול המוכיח כי המכשיר יכול לזהות במדויק את ריכוז החלקיקים בדילולים שונים עם שונות קטנה בין replicants טכניים. דילול אופטימלי עבור 4.41 פעמים 10 עד 10 חלקיקים 10 לכל 10 מיליליטר רקמת עכבר נגזר מדגם EV נגזר נקבע להיות בין 1, 000 ו 3, 000. בניתוח זה, הגדלת הרווח הגדילה את רגישות המצלמה, ומאפשרת עלייה בהדמיה של מספר גבוה יותר של חלקיקים קטנים יותר.הגדלת כוח הלייזר הכחול מ-70 ל-210 מילי-וואט תוך שמירה על כוחות הלייזר הירוקים והאדומים הקבועים, העבירה את גודל החלקיקים הממוצע המדווח מ-122 ל-105 ננומטר והגדילה את ריכוז החלקיקים הכולל שדווח מ-1.1 כפול 10 לשמינית ל-1.7 כפול 10 לשמינית. הגדלת כוחו של הלייזר האדום הגדילה את גודל החלקיקים הממוצע שדווח מ-175 ל-246 ננומטר והפחיתה את ריכוז החלקיקים הכולל שדווח. הגדלת כוח הלייזר הירוק הביאה לירידה בגודל החלקיקים הממוצע שדווח ולעלייה בריכוז החלקיקים הכולל שדווח.מציאת הדילול הנכון כדי למקם דגימה בטווח הזיהוי האופטימלי יכולה לקחת כמה ניסיונות עבור כל דגימה. ניקוי cuvette דורש גם טיפול זהיר נוסף. אנו ממליצים ליישם יותר משיטת אורתוגונל אחת עבור מידות גודל חלקיקי EV וריכוז.ניתן לבצע פיזור אור דינמי, חישת פעימה התנגדותית, מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור וחישת הדמיית רפלורנס אינטרפרומטרית של חלקיק יחיד כדי לאפיין רכבים חשמליים.

nanoparticle-tracking-analysis-for-quantification-size-determination

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה לבידוד אקסוזומים מדם מלא וניתוח נוסף על ידי מעקב אחר ננו-חלקיקים באמצעות מכשיר חצי אוטומטי מוצגת במאמר זה. הטכנולוגיה המוצגת מספקת שיטה רגישה ביותר להדמיה וניתוח חלקיקים בתרחיף נוזלי.

שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

שלפוחית ​​תאית לשחק תפקידים חשובים בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים, כוללים קרישה, תגובות חיסוניות, וסרטן או סוכנים טיפוליים פוטנציאליים כמו במשלוח סמים או רפואת רגנרטיבית. פרוטוקול זה מציג שיטות לאפיון כימות וגודל של שלפוחית ​​תאית מבודדת ולא מבודדת בנוזלים שונים תוך שימוש בחישת דופק resistive מתכונן.

כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית ​​באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את זרימת העבודה מלאה עבור בידוד מהיר של שלפוחית חוץ-תאי של דם אנושי ואפיון של סמני ספציפיים על-ידי ניתוח מעקב nanoparticle מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית. התוצאות שהוצגו להציג רמה גבוהה של הפארמצבטית, ניתן לכוונן תא תרבות supernatants.

אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

הפרוטוקול מתאר שיטה ישימה מיועד לשימוש עם תא תרבות supernatants לאתר epitopes משטח על שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EV). הוא מנצל immunoprecipitation EV ספציפי באמצעות חרוזים בשילוב עם נוגדנים מזהה אנטיגן פני שטח CD9, CD63, CD81. השיטה ממוטבים לניתוח cytometry במורד הזרם.

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) היא שיטה נפוצה לאפיון שלפוחיות חוץ-תאיות. מאמר זה מדגיש פרמטרים ובקרות ניסיוניים של NTA בתוספת שיטה אחידה של ניתוח ואפיון של דגימות ודילולים הדרושים כדי להשלים את ההנחיות המוצעות על ידי MISEV2018 ו- EV-TRACK לשחזור בין מעבדות.

שיפור רבייה כדי לענות על מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 הנחיות בניתוח מעקב חלקיקים

הדור האחרון של כלי אפיון EV מסוגלים לנתח EV יחיד על פני מספר פרמטרים בו זמנית. ציטומטריה של זרימה ננו מודדת את כל החלקיקים הביולוגיים הגדולים מ-45 ננומטר ללא התוויה ומזהה מאפיינים ספציפיים של תת-אוכלוסיות על ידי מגוון טכניקות תיוג פלואורסצנטיות.

אפיון חלבון טרנס-ממברנה חוץ-תאי יחיד על-ידי ציטומטריה של זרימה ננו

מאמר זה מציע דור חדש של פלטפורמות אנליטיות רב-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאיות. השיטה מבוססת על שילוב של שיטות חישה ביולוגית מרובות עם אנליזות מטרולוגיות ומורפומכניות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי, יחד עם ספקטרוסקופיית ראמאן, כדי להכשיר מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך.

פלטפורמה אנליטית רב-מודאלית על שבב דימות תהודה פלסמון מרובה פני שטח לניתוח תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאית

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד מהירה וספציפית לגודל עבור בועיות חוץ-תאיות קטנות על ידי מיטוב גודל פיית ריסוס האוויר, לחץ נוזל הנדן, לחץ זרימת הדגימה, מתח, רווח ופרמטרי סף הפעלה.

אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לבידוד, אפיון וכימות של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה אנושית (EV) ומציג זרימת עבודה לניתוח נטול-תוויות של פרוטאום EV באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS).

בידוד, אפיון וניתוח פרוטאומי של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה לגילוי סמנים ביולוגיים קרדיווסקולריים

פרוטוקול זה מתאר את בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות משרירי השלד של העכברים וממח עצם באמצעות עיכול אנזימטי וכרומטוגרפיה של הרחקת גודל, ומאפשר שחזור שניתן לשחזור של שברים מועשרים בוסיקולות מרקמות מורכבות מבנית ובעלות תפוקה נמוכה לניתוח מולקולרי במורד הזרם.

בידוד וזיקולות חוץ-תאיות קטנות משריר השלד של עכברו וממח עצם באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל

למדו פרוטוקול סטנדרטי לניתוח מעקב חלקיקים לכימות וסיווג גודל של שלל חוץ-תאי מרקמות עכבר ופלזמה אנושית. השיטה מגבירה את הריגור והשחזוריות במחקר שלל חוץ-תאי.

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

גלה סרטונים נוספים