ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

תוצאות NTA נוטות מאוד להטות מפעיל. פרוטוקול זה מדגים את ההשפעות של פרמטרי NTA שהשתנו על תוצאות שהושגו. שיטה מתוקננת תסייע להגביר את ההקפדה והשחזור בניתוח NTA.

ניתוח המדגם בקובט מאפשר ללכוד דגימה אקראית סטטיסטית בכל סרטון. התוצאה היא נתונים ניתנים לשחזור יותר והדמיה של חלקיקים על פני מגוון רחב של גדלים. כמו מקבל מדגם בטווח ריכוז החלקיקים המומלץ יכול להיות קשה, הקפד לבצע דילול סדרתי כדי לזהות את גורם הדילול האידיאלי.

מדגים את ההליך יהיה קונגהנג קאי, דוקטורנט מהמעבדה של אנתוני פרנטה. כדי להכין cuvette לניתוח מעקב ננו-חלקיקים, לכסות את סביבת העבודה עם חומר ללא מוך כדי למנוע סיבים מלהיכנס cuvettes. לובשים כפפות, מניחים cuvette המכיל מוט ערבוב על ג'יג cuvette מגנטי.

השתמש בכלי וו כדי למקם את ההוספה לתוך cuvette עם חריץ של התוסף גלוי בחלק הקדמי של cuvette. השתמש פיפטה להוסיף לאט 400 עד 500 microliters של שלפוחיות חוץ תאיות מטוהרות על cuvette דרך החור בהכנס ומערבבים את המדגם על ידי pipetting בעדינות מבלי להציג בועות אוויר, ולאחר מכן לכסות את cuvette, הקשה על בועות לפי הצורך ולהשתמש בד ללא מוך כדי לנגב את המשטח החיצוני של cuvette. כדי לנתח את ריכוז החלקיקים של הדילול או המדגם, הפעל את תחנת העבודה והמכשיר של המחשב והפעל את תוכנית ניתוח מעקב החלקיקים.

כאשר תתבקש, לחץ על NTA ופתח את כרטיסיית ההקלטה. בצע את ההוראות המופיעות על המסך כדי למלא את כל המידע לדוגמה הדרוש. לניתוח מעקב אחר EV, הגדר את הדילול ל- PBS.

המליחות תאכלס אוטומטית ל -9%כדי להשיג את ריכוז החלקיקים המדולל או המדגם, פתח את מכסה המכשיר והסר את מכסה המגן המכסה שבו יוצב הקובט. טען את cuvette לתוך המכשיר בכיוון הנכון עם החרץ של להוסיף מול המצלמה ולהחליף את המכסה ואת מכסה המכשיר. לחץ על חץ ההזרמה כדי להפעיל את המצלמה ולחץ על חץ הסוגריים הזוויתיים כדי להרחיב את הגדרות הרשומה.

התאם את המוקד עד שהחלקיקים הקטנים יחסית וגלים בבירור. כדי להגדיר את הניתוח לכימות EV קטן, הגדר את קצב הפריימים ל- 30 פריימים לשנייה, את החשיפה ל- 15 אלפיות השנייה, את זמן ההמתנה לחמש שניות, את זמן ההמתנה לשלוש שניות, את כוחות הלייזר הכחול, הירוק והאדום ל- 210, 12 ו- 8 מילי וואט בהתאמה, את המסגרות לסרטון ל - 300 ואת הרווח ל - 30 דציבלים. התאם את המוקד עד שהחלקיקים הקטנים יחסית וגלים בבירור.

הגדלת הזום ו/או הרווח יכולה לעזור עם התמקדות החלקיקים. אבל אם תגדיל את הרווח, זכור להגדיר אותו ל 30 דציבלים לפני ההקלטה. לאחר שחלקיקים נמצאים במוקד, הגדר את הגדרת גודל התצוגה לפי 0.5 כדי לחסוך רוחב פס ולמנוע מסגרות אובדן ולחץ על הקלטה כדי להתחיל להקליט את הווידאו.

כאשר מופיעה בקשה המציינת שהסרטונים הוקלטו, לחץ על אישור כדי להשלים את ההקלטה ובחר בכרטיסיית התהליך. אם חלקיקים גדולים מאוד נראו בכל סרטון בזמן ההקלטה, נווטו לספריה של סרטונים מוקלטים והסירו כל סרטון בעייתי לפני העיבוד. סמן את התיבה בטל עקיפה של זיהוי שמע והגדר את קוטר התכונה ל- 30.

לחץ על תהליך כדי ליזום עיבוד וידאו ולהציג גרף הפצה חי. לאחר השלמת העיבוד, לחץ על אישור ובחר בכרטיסיית התוויית התוויה. עבור כלי רטטוי, הצג את התרשים הראשי כסיליקה של יומן רישום.

ניתן להתאים אישית תכונות אחרות של הגרף, כגון שינוי ציר ה- x כדי להגדיר את האזור לשילוב הדמות המיוצרת. ליצירת דוח PDF של התוצאות, לחצו על לחצן 'דוח'. הממוצע, החציון, גודל המצב והריכוז המותאמים לגורם הדילול ורוחב ההפצה יוצגו.

NTA של דילול צריך להתבצע לפני כל מדגם, כך הריכוז של ריק זה ניתן להפחית את ריכוז חלקיקי מדגם EV. כדי לנקות את cuvettes לאחר הניתוח, לרוקן את cuvette ולמלא לחלוטין את cuvettes 10 עד 15 פעמים עם מים deionized ואת שלוש פעמים עם 70 עד 100%אתנול כדי להסיר כל דגימה שיורית. יבשו את החלק החיצוני של הקובטים עם בד מיקרופייבר נטול מוך וייבשו את החלק הפנימי עם מטלית אוויר דחוסה.

כדי לנקות את התוספות ומערבבים את הסורגים, מניחים את החומרים ב בקבוקון נוצץ מזכוכית המכיל 70 עד 100% אתנול ומנערים את הנקניקיה במרץ. לאחר מכן לשטוף את תוספות ומערבבים ברים במים deionized עם רועד כפי שהוכח ולייבש אותם באמצעות מטליות ללא מוך. לאחר הייבוש, יש להניח מיד את כל הרכיבים הנקיים באחסון עד לניתוח הבא.

לפני ביצוע ניתוח, כיול המכשיר נבדק באמצעות חרוזי פוליסטירן כדי להבטיח את תוקפם של הנתונים שנרכשו. כפי שנצפה, מכשיר מעקב החלקיקים דיווח במדויק על גודלם של חרוזי המנודיספרס 100 ננומטר, אך דיווח רק מקרוב על גודלם של חרוזי 400 ננומטר. לכן, הגדרות המכשיר עבור פרוטוקול זה היו מדויקות יותר עבור חלקיקים קטנים יותר, קרוב יותר 100 ננומטר בגודל.

באמצעות הגדרות אלה, דיווח על ריכוז חלקיקים בהתאם עם גורם דילול המוכיח כי המכשיר יכול לזהות במדויק את ריכוז החלקיקים בדילולים שונים עם שונות קטנה בין replicants טכניים. דילול אופטימלי עבור 4.41 פעמים 10 עד 10 חלקיקים 10 לכל 10 מיליליטר רקמת עכבר נגזר מדגם EV נגזר נקבע להיות בין 1, 000 ו 3, 000. בניתוח זה, הגדלת הרווח הגדילה את רגישות המצלמה, ומאפשרת עלייה בהדמיה של מספר גבוה יותר של חלקיקים קטנים יותר.

הגדלת כוח הלייזר הכחול מ-70 ל-210 מילי-וואט תוך שמירה על כוחות הלייזר הירוקים והאדומים הקבועים, העבירה את גודל החלקיקים הממוצע המדווח מ-122 ל-105 ננומטר והגדילה את ריכוז החלקיקים הכולל שדווח מ-1.1 כפול 10 לשמינית ל-1.7 כפול 10 לשמינית. הגדלת כוחו של הלייזר האדום הגדילה את גודל החלקיקים הממוצע שדווח מ-175 ל-246 ננומטר והפחיתה את ריכוז החלקיקים הכולל שדווח. הגדלת כוח הלייזר הירוק הביאה לירידה בגודל החלקיקים הממוצע שדווח ולעלייה בריכוז החלקיקים הכולל שדווח.

מציאת הדילול הנכון כדי למקם דגימה בטווח הזיהוי האופטימלי יכולה לקחת כמה ניסיונות עבור כל דגימה. ניקוי cuvette דורש גם טיפול זהיר נוסף. אנו ממליצים ליישם יותר משיטת אורתוגונל אחת עבור מידות גודל חלקיקי EV וריכוז.

ניתן לבצע פיזור אור דינמי, חישת פעימה התנגדותית, מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור וחישת הדמיית רפלורנס אינטרפרומטרית של חלקיק יחיד כדי לאפיין רכבים חשמליים.