Name: הקרנת מיקרו לייזר לחקר גיוס DNA במהלך שלב S (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: חקור את דינמיקת גיוס חלבוני תיקון DNA במהלך שלב S באמצעות מיקרו-לייזר ומיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר חלבוני תיקון בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למ. פגאנו על תמיכתו המתמשכת, כמו גם לד' סימונצ'י, א. מרציו וג'י טאנג על הביקורת הביקורתית שלהם על כתב היד. ב. מיוואטני-מינטר מודה לר' מיוואטני וב. מינטר על תמיכתם המתמשכת. ג. רונה מודה ל-ק. רונאן ג'ורה וג' רונה על תמיכתם המתמשכת.

<ol><li>Aleksandrov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+in+complex+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics in complex DNA lesions.</a> Molecular Cell. 69 (6), 1046-1061 (2018).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H., Podhorecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization+by+inhibitors+of+DNA+replication+induces+replication+stress+and+DNA+damage+response%3A+Analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: Analysis by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Herce, H. D., Rajan, M., Lattig-Tunnemann, G., Fillies, M., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+permeable+DNA+replication+and+repair+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">A novel cell permeable DNA replication and repair marker.</a> Nucleus. 5 (6), 590-600 (2014).</li>
<li>Keijzers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+exonuclease+1+%28EXO1%29+regulatory+functions+in+dna+replication+with+putative+roles+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in dna replication with putative roles in cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), (2018).</li>
<li>Cheruiyot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29-binding+promotes+Exo1+damage+recruitment+and+suppresses+its+nuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose)-binding promotes Exo1 damage recruitment and suppresses its nuclease activities.</a> DNA Repair (Amsterdam). 35, 106-115 (2015).</li>
<li>Zhang, F., Shi, J., Chen, S. H., Bian, C., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+domain+of+EXO1+recognizes+poly%28ADP-ribose%29+in+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PIN domain of EXO1 recognizes poly(ADP-ribose) in DNA damage response.</a> Nucleic Acids Research. 43 (22), 10782-10794 (2015).</li>
<li>Rona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+recruitment+of+the+FBXL10-RNF68-RNF2+ubiquitin+ligase+to+sites+of+DNA+damage+controls+H2A.Z+loading%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent recruitment of the FBXL10-RNF68-RNF2 ubiquitin ligase to sites of DNA damage controls H2A.Z loading.</a> elife. 7, (2018).</li>
<li>Young, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIMELESS+forms+a+complex+with+PARP1+distinct+from+its+complex+with+TIPIN+and+plays+a+role+in+the+dna+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TIMELESS forms a complex with PARP1 distinct from its complex with TIPIN and plays a role in the dna damage response.</a> Cell Reports. 13 (3), 451-459 (2015).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+to+study+in+vivo+cellular+responses+to+simple+and+complex+dna+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation to study in vivo cellular responses to simple and complex dna damage.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56213(2018).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensin+I+recruitment+to+base+damage-enriched+DNA+lesions+is+modulated+by+PARP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Condensin I recruitment to base damage-enriched DNA lesions is modulated by PARP1.</a> PLoS One. 6 (8), 23548(2011).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+site-specific+induction+of+oxidative+DNA+damage+reveals+differences+in+recruitment+of+repair+proteins+to+heterochromatin+and+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for site-specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2330-2345 (2014).</li>
<li>Zerjatke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cell+cycle+analysis+based+on+an+endogenous+all-in-one+reporter+for+cell+tracking+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative cell cycle analysis based on an endogenous all-in-one reporter for cell tracking and classification.</a> Cell Reports. 19 (9), 1953-1966 (2017).</li>
<li>Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+infection+of+cultured+cells+induces+oxidative+stress+and+attenuates+cellular+base+excision+repair+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity.</a> Mutation Research. 845, 403054(2019).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+pneumoniae+infection+induces+reactive+oxygen+species+and+DNA+damage+in+A549+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma pneumoniae infection induces reactive oxygen species and DNA damage in A549 human lung carcinoma cells.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4405-4413 (2008).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amsterdam). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Muster, B., Rapp, A., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+DNA+damage+induction+and+DNA+repair+pathway+activation+by+continuous+wave+visible+light+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of DNA damage induction and DNA repair pathway activation by continuous wave visible light laser micro-irradiation.</a> AIMS Genetics. 4 (1), 47-68 (2017).</li>
<li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+human+NTH1%2C+a+homolog+of+Escherichia+coli+endonuclease+III.+Direct+identification+of+Lys-212+as+the+active+nucleophilic+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of human NTH1, a homolog of Escherichia coli endonuclease III. Direct identification of Lys-212 as the active nucleophilic residue.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (34), 21585-21593 (1998).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 94 (14), 7429-7434 (1997).</li>
<li>Reid, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+dynamics+of+the+nonhomologous+end-joining+machinery+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (20), 2575-2584 (2015).</li>
<li>Taccioli, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku80%3A+product+of+the+XRCC5+gene+and+its+role+in+DNA+repair+and+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ku80: product of the XRCC5 gene and its role in DNA repair and V(D)J recombination.</a> Science. 265 (5177), 1442-1445 (1994).</li>
<li>Marsin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+XRCC1+in+the+coordination+and+stimulation+of+oxidative+DNA+damage+repair+initiated+by+the+DNA+glycosylase+hOGG1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of XRCC1 in the coordination and stimulation of oxidative DNA damage repair initiated by the DNA glycosylase hOGG1.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44068-44074 (2003).</li>
<li>Thompson, L. H., Brookman, K. W., Jones, N. J., Allen, S. A., Carrano, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+human+XRCC1+gene%2C+which+corrects+defective+DNA+strand+break+repair+and+sister+chromatid+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the human XRCC1 gene, which corrects defective DNA strand break repair and sister chromatid exchange.</a> Molecular and Cell Biology. 10 (12), 6160-6171 (1990).</li>
<li>Scharer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+excision+repair+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide excision repair in eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 5 (10), 012609(2013).</li>
<li>Oeck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+protein+migration+and+localization+after+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of protein migration and localization after laser micro-irradiation.</a> Science Reports. 9 (1), 3148(2019).</li>
<li>Mistrik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+and+stripes%3A+A+novel+quantitative+photo-manipulation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique.</a> Science Reports. 6, 19567(2016).</li>
<li>Durand, R. E., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity%2C+mutagenicity+and+dna+damage+by+hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity, mutagenicity and dna damage by hoechst 33342.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (2), 111-116 (1982).</li>
<li>Tobey, R. A., Oishi, N., Crissman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization%3A+reversible+induction+of+G2+synchrony+in+cultured+rodent+and+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization: reversible induction of G2 synchrony in cultured rodent and human diploid fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 87 (13), 5104-5108 (1990).</li>
<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+phosphorylation%3A+Its+role+in+DNA+damage+response+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">H2AX phosphorylation: Its role in DNA damage response and cancer therapy.</a> Journal of Nucleic Acids. 2010, (2010).</li>
</ol>

המחברים מציינים כי פרסום העבודה המוצגת היה בחסות תאגיד ניקון. המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים קיימים.

שלבים קריטיים ופתרון בעיות/שינויים פוטנציאליים בפרוטוקול כלי תרבית רקמות נכון עבור הקרנה מיקרו הוא קריטי להצלחה. רוב מערכות ההדמיה ברזולוציה גבוהה מותאמות לעובי זכוכית כיסוי של 0.17 מ"מ. שימוש בתאי הדמיה בעובי גבוה או נמוך יותר או בתאים העשויים מפולימרים מפלסטיק (שאינם מותאמים להדמיה של 405 ננומטר), יכולים להפחית באופן משמעותי את איכות התמונה. בעת שימוש במשטחי זכוכית, ודא כי הם תרבית רקמות מטופלים כדי לשפר את הידבקות התא. אם הם אינם מטופלים בתרבית הרקמות, יהיה צורך לצפות תאים אלה, למשל, בפולי-די-ליסין לפני זריעת התאים. כאשר ציפוי תאים לתוך שעון כיסוי התא, צפיפות התא האידיאלית היא בעלת חשיבות עליונה כדי למנוע אי סדרים במחזור התא ומתח נוסף לתאים. שיווי משקל תרמי נכון של רכיבי המיקרוסקופ לפני הניסויים כדי לשמור על טמפרטורה יציבה חיוני הן לשמירה על המיקוד לאורך כל הזמן הדמיה לשגות והוא גם הכרחי כדי להבטיח DDR הומוגני לאורך זמן ודגימות.
זה קריטי כי תאים נמצאים במצב בריא לפני מיקרו הקרנה כדי להפחית נתונים חפצניים. אם לתאים יש מורפולוגיה לא סדירה לאחר זיהום/בחירה, אפשר לתאים להתקדם במעברים מרובים עד שהמורפולוגיה תחזור לשגרה. ודא תמיד כי קווי התאים המשמשים נקיים מזיהום mycoplasma. בין ההשפעות השליליות הרבות של זיהום mycoplasma, זה גם גורם נזק DNA לתאים המארחים יכול להשפיע על מסלולי DDR שלהם14,15. הדרך הרגישה ביותר לזהות mycoplasma בתרבות התא היא באמצעות PCR (לעומת זיהוי עם DAPI או Hoechst).
ביטוי יתר אופטימלי של חלבון התיקון של עניין צריך להיות דומה לרמות אנדוגני, עם זאת, גבוה מספיק לגילוי. המקדם המשמש על הווקטורים הנגיפיים, טיטר ויראלי במהלך זיהום, ואת אורך זמן ההדבקה ניתן להתאים את כל לרמות הביטוי האידיאליות. לקבלת תוצאות עקביות, בודד שיבוטים של תאים בודדים כדי להבטיח רמות ביטוי הומוגניות ומורפולוגיה רגילה של תאים. מומלץ להשתמש במבנים וקטוריים שאינם מגזמים ב- PCNA מתויג ברמות אנדוגניות גבוהות יותר עבור מחזור תאים תקין ותפקוד סמן תיקון DNA. אפילו רמות נמוכות של ביטוי יתר של PCNA מספיקות כדי להפלות תאים של פאזה S. וקטורים רטרו-ויראליים pBABE שימשו בהצלחה למטרה זו (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA ניתן לתייג עם כל אדום מונומרי(למשל, mPlum, mCherry, mRuby, וכו ') או חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים מונומריים (למשל, mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, וכו ') אשר לאחר מכן ניתן לשלב עם POI מתויג לסירוגין. להבעשת יתר של POI מתויג פלואורסצנטי יש כמה מגבלות ושיקולים. תגי פלורסנט עלולים לשבש את תפקוד החלבון הרגיל ואת לוקליזציה. לכן, יש לקחת בחשבון את מיקום התג (N או C-terminal). השתמש תמיד בחלבונים פלואורסצנטיים מונומריים, כמו אוליגומריזציה של וריאנטים שאינם מונומריים יכול להשפיע על הפונקציה של POI.
יש לקבוע את הגדרות הלייזר עבור כל מערכת הדמיה, שכן רכיבים רבים של הנתיב האופטי ישפיעו על הכוח הממשי המועבר לתאים. הקרנה מיקרו-הקרנה לייזר יכול לגרום מספר סוגים של נגעים DNA בהתאם אורך גל העירור, תפוקת הכוח של לייזר FRAP ואם כל סוכנים רגישים מראש (כמו ברומודוקסיורידין או Hoechst) שימשו. לייזרים 405 ננומטר יכול לגרום נזק DNA חמצוני, שברים בודדים וכפולתקועים 16,17. באמצעות הגדרות פלט לייזר גבוהות יותר, כמות ה- DSBs גדלה. בפרוטוקול זה שיטות טרום רגישות לא נוצלו, אך טכניקות אלה מכוסות מאוד בספרות ומכוסות מחדש בדיון שלהלן. לדעתנו, הדרך הטובה ביותר לבדוק אם הנגע הרצוי נוצר היא על ידי בדיקה לגיוס של גנים ספציפיים למסלול נזקי DNA ידועים. גיוס של NTHL1 או OGG1, רכיבים של מסלול BER, מציע את האינדוקציה של בסיסי DNA מחומצן10,11,17,18,19, בעוד FBXL10 או XRCC5 מצביעים על נוכחות של DSBs8,20,21. גיוס של XRCC1 יכול להצביע הן על נוכחות של בסיסי DNA מחומצנים והן הפסקות בודדות תקועות (SSB)22,23. XPC (כלומר, RAD4) הוא אינדיקטור טוב של NER המסיר את תוספות ה- DNA המגושמים הנוצרות על ידי אור אולטרה סגול (UV)17,24. מכיוון שגיוס חלבונים אקסוגניים עלול לגרום לאי סדרים מסוימים, כתמים אימונופלואורסצנטיים של חלבונים או סמנים לתיקון דנ"א אנדוגני (כמו γH2A.X להפסקות כפולות) יכולים לאשר את נוכחותם של נגעים ספציפיים ב- DNA. לחלופין, נוגדנים שהועלו נגד סוגים מסוימים של נגעי DNA יכולים לשמש גם. כדי לכוונן את כוח הלייזר המועבר, ניתן לשנות הן את זמן ההשתהות והן את כוח הלייזר.
בעזרת מודלים מתמטיים, ניתן לבצע ניתוח קינטי מפורט שיכול לספק תובנות חשובות על תכונות הגיוס של POI (למשל, תרומה של תחומים כריכי DNA מרובים, רגישות לאירועי איתות שונים וכו '). ניתן לשלב הערכת גיוס אוטומטית ומעקב אחר תאים כדי ליצור זרימות עבודה חזקות 1,25.
יתרונות ומגבלות של רגישות מוקדמת DNA רגישות מוקדמת של DNA לפני מיקרו-הקרנה הוא כלי נפוץ לתיקון DNAגיוס חלבון 16,17. רגישות DNA לפני מיקרו הקרנה משאירה אותו רגיש יותר DSBs. שתי השיטות הנפוצות ביותר עבור DNA טרום רגישות הם טרום טיפול בתאים עם ברומודוקסיורידין (BrdU) או צבע Hoechst. עבור מערכות שאינן מסוגלות מיקרו-הקרנה בכוחות לייזר גבוהים, שיטות אלה עשויות להיות נחוצות לזירוז נגעי DNA כמו DSBs. בנוסף, בהיעדר גלאי אור מועבר או אות פלואורסצנטי המדגיש את גרעין התא (לדוגמה, כאשר לומדים את הגיוס של חלבוני תיקון DNA אנדוגני לא מתויג), Hoechst פועל הן ככלי רגיש מראש וכתם גרעיני פלואורסצנטי. עם זאת, DNA מראש רגישות יכול להציג סיבוכים משמעותיים. BrdU (בשימוש בריכוז סופי של 10 מיקרומטר) יש להוסיף לתאים 24 שעות (או זמן שווה ערך למחזור תא מלא בקו התא המשמש) כדי לשלב כראוי ב- DNA ויכול לגרום להפרעות מחזור התא26. Hoechst 33342 (בשימוש בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל) הוא ציטוטוקסי לאחר תקופות דגירה ארוכות, אך דורש מספיק זמן כדי להרוות את הגרעין עם הצבע. לכן, זה צריך להיות מיושם רק 15-20 דקות לפני מיקרו הקרנה; אחרת, נתוני הגיוס לא יהיו עקביים. התאים מוכתמים בדרך זו לא ניתן לשמור בתרבות במשך יותר מכמה שעות27,28. הקפד לא להשתמש Hoechst 33358, אשר אינו חדיר תא כמו צבע Hoechst 33342. רגישות מוקדמת יכולה גם להכניס שונות מיותרת בין ניסויים והופכת את הניסוי לרגיש עוד יותר להבדלים בצפיפות התאים (שכן זה ישפיע על כמות הצבע / התא המשולב).
יתרונות ומגבלות של מיקרוסקופיה קונפוקלית מהירות ההדמיה של מיקרוסקופיה קונפוקלית יכולה להיות מוגבלת בהשוואה למיקרוסקופיה רחבת שדה. עם זאת, מיקרוסקופ קונפוקל המצויד בסורק מהדהד יכול לשפר מאוד את מהירות ההדמיה (במחיר הרזולוציה) מתקרב למהירויות של מיקרוסקופיה של דיסק מסתובב. שלוש תכונות הופכות את מערכת הקונפוקלית A1R HD25 לבחירה מצוינת עבור הפרוטוקול המוצג כאן. ראשית, FOV 25 מ"מ של המערכת מאפשר תמונה בין 15-20 תאים בשדה סרוק יחיד (לעומת 5-10 תאים בכיוונונים רגילים), הגבלת מספר הרכישות הדרושות כדי לקבל מספיק תאים לניתוח סטטיסטי. שנית, מודול FRAP ושני ראשי סריקה מאפשרים לדמיין ולהקרין את התאים בו זמנית, לא רק ברצף. לבסוף, הגמישות שיש הן סורקי מהדהד והן סורק galvano מספק את היכולת לעבור בקלות בין הדמיה ברזולוציה גבוהה-זמנית עם מהירות יוצאת דופן אשר ממזערת מרווה של פלואורופורים, הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה המשתמשת במהירויות סריקה איטיות יותר כדי לייצר תמונות עם יחס אות לרעש גבוה יותר. בעוד שהמערכת המשומשת אפשרה את הגמישות הנ"ל, להידמות לתצורות מיקרוסקופ קונפוקליות זמינות יותר, רק סורק גלוונו שימש בניסויים שהוצגו (הן עבור מיקרו-הקרנה והן עבור הדמיה עוקבת).
יתרונות ומגבלות של הקרנה מיקרו בעוד מיקרו-הקרנה מספקת רזולוציה מרחבית וטמפורלית ללא תחרות, זה לא ללא מגבלות. נזק לדנ"א על ידי הקרנת מיקרו לייזר מקובצים מאוד לחלקים מסוימים של הגרעין בהשוואה לסוכנים מזיקים טבעיים. לכן, תגובת הכרומטין עקב הקרנה מיקרו עשוי להיות שונה לעומת נזק מופץ הומוגני. בנוסף, מיקרו-הקרנה גוזלת זמן ויכולה להתבצע רק על כמה עשרות תאים, בעוד ששיטות ביוכימיות גדולות המבוססות על אוכלוסייה (שבר כרומטין, אימונופרציפיטציה, ChIP) יכולות לספק חוסן מוגבר על ידי לימוד אלפי תאים בכל פעם. אימות תצפיות שנעשו על ידי הקרנה מיקרו עם טכניקות ביוכימיות מסורתיות היא אסטרטגיה יעילה למסקנות אמינות. למרות הקרנה מיקרו בו זמנית של תאים רבים ב- FOV מסוים אפשרי, מערכת ההדמיה תצטרך יותר זמן כדי לבצע את המשימה. לכן, מדידת הדינמיקה של חלבונים המגייסים במהירות רבה נגעי DNA מגבילה את מספר ROIs אפשרי עבור מיקרו הקרנה בשימוש בו זמנית. במערכת ההדמיה המשמשת לפרוטוקול זה, הקרנה זעירה של ROI יחיד באורך 1024 פיקסלים אורכת 1032 אלפיות שניה תוך שימוש בזמן השתהות של 1000 מיקרו ו- 3088 אלפיות שניים באמצעות זמן השתהות של 3000 מיקרו μs כדי להשלים. שימוש בקווים מרובים של ROIs יגדיל באופן משמעותי את הזמן הדרוש כדי לסיים הקרנה מיקרו (למשל, 7 x 1024 פיקסלים ארוך ROI לוקח 14402 אלפיות שני באמצעות 1000 μs זמן השתהות ו 21598 אלפיות שני באמצעות זמן השתהות 3000 מיקרו). הפעם הוא אבד מרכישת תמונה ויש לקחת בחשבון. בעת הדמיה של אירועי גיוס מהירים, השתמש בהחזר ההבשלה הקצר ביותר האפשרי ורק מיקרו-הקרנה תא אחד בכל פעם.
יתרונות ומגבלות על-פני שיטות סינכרון עבור מחקרים ספציפיים למחזור התא, השיטות הקיימות כוללות סינכרון של תאים לשלבי מחזור תאים ספציפיים או באמצעות כתבים פלואורסצנטיים כדי לזהות את שלב מחזור התא הספציפי של התא. עם זאת, כל אחת משיטות אלה מספקת אתגרים ומגבלות משלה.
מערכת FUCCI3 (הסתמכות על חלבון פלואורסצנטי מתויג צורות חתוכים של CDT1 ו Geminin) הוא כלי שימושי במיוחד עבור מחקרי מחזור התא אבל יש מגבלות כשמדובר להבדיל בין S ו- G2 שלבים של מחזור התא. רמות Geminin כבר גבוהות משלב S באמצע ולהישאר גבוה עד שלב M, מה שהופך שלבים אלה קשה להפריד. שימוש במערכת FUCCI פירושו גם כי שני ערוצים אופטיים של המיקרוסקופ לא ניתן להשתמש עבור הדמיה POI.
קווי תאים שאינם סרטניים יכולים להיות מסונכרנים לתוך G0 על ידי הסרת גורמי גדילה שנמצאו בסרום (רעב בסרום) הגורמים נזק DNA קטן או ללא נזק לתאים. עם זאת, רוב קווי התא הסרטני ימשיכו להתקדם חלקית במחזור התאים גם ללא כמויות נאותות של סרום במדיה שלהם. בנוסף, תאים מתחילים חלקית לאבד סינכרון על ידי סוף G1, שלב S מוקדם. בנוסף לרעב בסרום, ישנן שיטות כימיות רבות להשגת סנכרון מחזור התא. הידרוקסיאוריה, אפידיקולין, ותימידין בלוקים הם שיטות לעצור שכפול DNA כדי לסנכרן תאים לשלב S מוקדם. בעוד שיטות אלה הן זולות ופשוטות, הם מציגים מתח שכפול אשר גורם נזק DNA. מעכבי שכפול DNA אלה הוכחו לגרום זרחן של H2A. X, סמן ידוע של DSBs2,29. שיטת השימוש ב- PCNA מתויג כסמן לתאי S-phase מפחיתה את הפוטנציאל לחפצים הנגרמים על ידי סנכרון כימי וניתן להחיל אותה על מגוון רחב של קווי תאים בהשוואה לרעב בסרום.
מסקנה נזק לדנ"א הוא כוח מניע למחלות גנטיות שבהן נגעים מוטגניים יכולים להוביל לשינוי ממאיר של תאים. מיקוד מכונות סינתזת DNA היא אסטרטגיה טיפולית בסיסית בטיפול במחלות היפרפרוliferative כמו סרטן. על מנת לטפל במחלות אלה בצורה ממוקדת יותר, אנו זקוקים להבנה טובה יותר של החלבונים המתקנים נגעי DNA. הפרוטוקול המתואר כאן מסייע למחקרים מבוססי הקרנה זעירה בשלב S על ידי מזעור האתגרים המוצגים בשיטות סנכרון מסורתיות כדי להפחית חפצים אפשריים ולהגדיל את יכולת הרבייה של הניסויים.

מספר מסלולי תיקון DNA התפתחו כדי לטפל בסוגים שונים של נגעי DNA שיכולים להתעורר בתאים, שכולם מוסדרים מאוד הן במרחב והן בזמן. אחת התקופות הפגיעות ביותר של מחזור התא היא שלב S, כאשר מתרחשת סינתזת DNA. בעוד שהתפשטות היא בסיסית לחיים, היא גם מספקת אתגר גדול. תאים צריכים להבטיח שכפול נאמן של הגנום שלהם כדי למנוע מוטציות שיועברו לדורות הבאים. כתוצאה מכך, ההתפשטות מספקת נקודת התערבות טיפולית שהופעלה לפיתוח גישות טיפוליות בתחום האונקולוגיה.
לכל הטכניקות העיקריות המשמשות לחקר גיוס חלבונים נגעי DNA יש את נקודות החוזק והמגבלות שלהם. מיקרו-הקרנה יש רזולוציה מרחבית וטמפורלית טובה יותר1 מאשר רוב השיטות החלופיות כמו הדמיה חיסונית של מוקדים מייננת הנגרמת על ידי קרינה (IRIF), כרומטין-אימונופרציפיטציה (ChIP), או פירוק ביוכימי. עם זאת, מיקרו-הקרנה משתליבה את החוסן של הטכניקות הנ"ל שיכולות לדגום מספר גדול של תאים בו זמנית.
כדי לחקור תיקון DNA בשלב S, יש להיות מסוגל להבחין בין תאי פאזה S באוכלוסיית תרבית תאים אסינכרונית. קיימות שיטות ידועות רבות לטיפול בכך, הכוללות סינכרון תאים או הדמיה של שלבי מחזור התא השונים. עם זאת, שתי הגישות מציגות אתגרים משמעותיים וחפצים אפשריים. שיטות סנכרון כימיות בשימוש נרחב כדי להעשיר תאים בשלב S מוקדם (למשל, בלוק תימידין כפול, aphidicolin, וטיפול hydroxyurea) להשיג סנכרון באמצעות אינדוקציה של מתח שכפול ובסופו של דבר נזק DNA עצמו. זה מגביל את השימוש בשיטות אלה כדי ללמוד תהליכי תיקון DNA בשלבS 2. סנכרון באמצעות רעב בסרום ושחרור חל רק על מספר מוגבל של קווי תאים, בעיקר למעט קווי תאים סרטניים המסתמכים פחות על גורמי גדילה להתקדמות מחזור התא בהשוואה לקווי תאים שאינם שעברו שינוי. מערכת מחוון מחזור תא אוביקוויטין פלואורסצנטין (FUCCI) היא כלי שימושי במיוחד לחקר מחזור התא, אך יש לה מגבלה בסיסית בעת הבחנה בין S ו- G2 שלבים מחזור התא3.
כאן הוא מוצג כי באמצעות PCNA מתויג פלואורסצנטית כסמן לא פולשני עבור שלב S מגביל את החסרונות של שיטות סינכרון מחזור תאים כימיים, תוך מתן אפשרות יותר ספציפיות וגמישות מאשר מערכת FUCCI. כסמן יחיד, לא רק PCNA יכול להדגיש תאי S-פאזה באוכלוסייה אסינכרונית, אבל זה יכול גם להראות את ההתקדמות המדויקת של תאים בתוך שלב S (כלומר, מוקדם, באמצע, או מאוחר S-שלב)4. רמות ביטוי נמוכות של PCNA אקסוגני, מתויג מבטיח הפרעה מינימלית הן התקדמות מחזור התא ותהליכי תיקון DNA. חשוב לציין, PCNA משמש גם כבקרה פנימית עבור אינדוקציה נזק DNA תקין כפי שהוא מעורב בתיקון של כמה נגעים DNA והוא מגויס לאתרי נזק DNA המושרההמקומית 1,4.
הניסויים המוצגים כאן מדגימים כיצד למדוד את דינמיקת הגיוס של EXO1b בשלב S וכיצד זה מושפע ממעכב PARP מבוסס היטב, olaparib. פעילות נוקלאז EXO1b רלוונטית למגוון רחב של מסלולי תיקון DNA כולל תיקון אי התאמה (MMR), תיקון כריתת נוקלאוטיד (NER) ותיקון הפסקה כפולה (DSB). בשלב S, EXO1b ממלא תפקיד מרכזי רקומבינציה הומולוגית (HR) באמצעות היווצרות של 3 ' ssDNA overhangs במהלך כריתת DNA5. EXO1b כבר מעורב עוד יותר בשכפול DNA עם תפקידים בהפעלת נקודת ביקורת כדי להפעיל מחדש מזלגות DNA תקוע, כמו גם הסרת פריימר והבשלת שבר Okazaki בגדיל הפיגור במהלך עקירת גדיל בשכפול5. גיוס EXO1b לאתרי DNA פגומים מוסדר על ידי האינטראקציה הישירה עם פולי (ADP-ריבוז) (PAR)6,7. בשל ההשלכות הספציפיות הרבות של מחזור התא של EXO1b, זוהי בחירה מצוינת עבור מחקרי גיוס ספציפיים S-phase באמצעות PCNA.

<table><tbody><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9434-500G</td><td>למרווה פורמלדהיד</td></tr><tr><td>אנטי-EXO1 ארנב נוגדן פוליקלונלי</td><td>Proteintech</td><td>16253-1-AP</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-היסטון H2A. X (Ser139) נוגדן, שיבוט JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>3117332001</td><td>BSA לחסימת</td></tr><tr><td>BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine)</td><td>Merck</td><td>19-160</td><td>חומר רגיש מראש</td></tr><tr><td>Citifluor&trade; תמיסת הרכבה AFR3</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>17973-10</td><td>אנטי-דהייה המכילה תמיסת PBS להדמיה</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9542-1MG</td><td>כתם חומצת גרעין</td></tr><tr><td>DMEM מדיום</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>10569010</td><td>מדיום תרבית תאים לתאי HEK293T</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>ממס בקרת ופירוק Vehichle</td></tr><tr><td>EGFP-FBXL10</td><td>Addgene</td><td>#126542</td><td>וקטור ביטוי ויראלי עבור EGFP-FBXL10</td></tr>, <tr><td>EXO1b-AcGFP&nbsp; (ב-pRetroQ)</td><td>שיבוט מותאם אישית</td><td></td><td>ו-EXO1b cDNA שובט באתרי NheI, BamHI של וקטור pRetroQ-AcGFP1-N1.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>תוסף מדיה</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>פנול אדום מדיום חופשי למיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>עז אנטי עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>HEK293T תאים</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td>קו תאים לאריזה ויראלית</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>חומר חציצה להשלמת מדיום הדמיית תאים חיים</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>חומר רגישות מראש</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A (שונה) Medium</td><td>Life Technologies</td><td>16600-108</td><td>מדיום תרבית תאים לתאי U-2 OS</td></tr><tr><td>mCherry-PCNA</td><td>Addgene</td> <td># 55117</td><td>מבנה PCNA לא ויראלי המתאים לסמן מחזור התא</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA</td><td>Addgene</td> <td># 55994</td><td>מבנה PCNA לא ויראלי המתאים לסמן מחזור התא</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA (ב- pBABE)</td> <td>שיבוט</td><td></td> <td>מותאם אישיתmPlum-PCNA cDNA שוכפל מ- Addgene #55994 באתרי BamHI, SalI של pBABE (puro)</td></tr> <tr><td>Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller</td><td>Nikon</td><td>עם</td><td>מערכת הדמיה קונפוקלית</td></tr><tr><td>Nikon LUN4 יחידת לייזר Nikon</td><td></td> עם <td>מערכת עירור</td>Nikon <td>LUN-F</td></tr><tr><td>50 mW 405 nm יחידת לייזר FRAP</td><td>Nikon</td><td>ו</td><td>- FRAP</td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements Confocal Controller Software</td><td>Nikon</td><td></td><td>בתוכנת בקרה קונפוקלית</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td>עם</td><td>בסיס מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-LAPP מערכת תאורה מודולרית</td><td>Nikon</td><td>ומערכת</td><td>תאורה</td></tr><tr><td>NTHL1-mCherry (ב- pRetroQ)</td> <td>שיבוט מותאם אישית</td><td>ו</td><td>- NTHL1 cDNA שובטו באתרי NheI, SalI של וקטור pRetroQ-mCherry-N1.</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 בארות)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382PK</td><td>תא תרבית תאים במיקרוסקופיה של תאים חיים</td></tr><tr><td>Olaparib</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1060</td><td>מעכב PARP</td></tr><tr><td>Opti-MEM מדיה מופחתת בסרום</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>מדיום דילול להעברה חולפת</td></tr><tr><td>תמיסה מימית Paraformaldehyde (32%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-494</td><td>מקבע</td></tr><tr><td>pBABE (hygro)</td><td>Addgene</td><td>#1765</td><td>וקטור ביטוי רטרו-ויראלי (לרמות ביטוי נמוכות)</td></tr><tr><td>pBABE (ניאו)</td><td>Addgene</td><td>#1767</td><td>וקטור ביטוי רטרו-ויראלי (לרמות ביטוי נמוכות)</td></tr><tr><td>pBABE (puro)</td><td>Addgene</td><td>#1764</td><td>וקטור ביטוי רטרו-ויראלי (לרמות ביטוי נמוכות)</td></tr><tr><td>pBABE (zeo)</td><td>Addgene</td><td>#1766</td><td>וקטור ביטוי רטרו-ויראלי (לרמות ביטוי נמוכות)</td></tr><tr><td>נוגדן PCNA (PC10)</td><td>נוגדן ראשוני סנטה קרוז</td><td>sc-56</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (100x)</td><td>תוסף Gibco</td><td>10378016</td><td>Media</td></tr><tr><td>פוליברן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>TR-1003</td><td>הגברת יעילות הזיהום הנגיפי</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-C1</td><td>Takara</td><td>632506</td><td>וקטור ביטוי רטרו-ויראלי</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-N1</td><td>Takara</td><td>632505</td><td>וקטור ביטוי רטרו-ויראלי</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-C1</td><td>וקטור ביטוי רטרו-ויראלי</td><td>632567</td><td>Takara</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-N1</td><td>Takara</td><td></td><td>632568 וקטור ביטוי רטרו-ויראלי</td></tr><tr><td>pUMVC</td><td>Addgene</td><td>#8449</td><td>וקטור אריזה ויראלית</td></tr><tr><td>נתרן-פירובט</td>תוסף <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td>למדיום הדמיית תאים חיים</td></tr><tr><td>Triton X-100 תמיסה מימית (10%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>מדולל ב-PBS עבור מאגר חדירות תאים</td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין-EDTA 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>מדלל ב-PBS לתאים מפוצלים</td></tr><tr><td>תאי U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; HTB-96</td><td>קו תאים אופטימלי לניסויי מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>ערכת זיהוי מיקופלזמה אוניברסלית ATCC</td><td></td><td>30-1012K</td><td>PCR מבוססת ערכת זיהוי מיקופלזמה</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>וקטור מעטפת חלבון ויראלי</td></tr></tbody></table>

הקרנת מיקרו לייזר לחקר גיוס dna במהלך שלב s

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

תיקון נזקי DNA שומר על השלמות הגנטית של תאים בסביבה תגובתית מאוד. תאים עשויים לצבור סוגים שונים של נזק DNA בשל מקורות אנדוגניים ואקסוגניים כגון פעילויות מטבוליות או קרינת UV. ללא תיקון DNA, הקוד הגנטי של התא הופך לפגום, מערער את המבנים והפונקציות של חלבונים ועלול לגרום למחלות. 
הבנת הדינמיקה spatiotemporal של מסלולי תיקון DNA שונים בשלבי מחזור תאים שונים היא חיונית בתחום של תיקון נזק DNA. טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות נוכחיות מספקות כלים נהדרים למדידת קינטיקה של גיוס חלבונים שונים לאחר אינדוקציה נזק DNA. סינתזת DNA במהלך שלב S של מחזור התא היא נקודה מוזרה בגורל התא לגבי תיקון DNA. הוא מספק חלון ייחודי כדי לסנן את הגנום כולו לטעויות. יחד עם זאת, שגיאות סינתזת DNA גם להוות איום על שלמות ה- DNA כי הוא לא נתקל בתאים שאינם מתחלקים. לכן, תהליכי תיקון DNA שונים באופן משמעותי בשלב S בהשוואה לשלבים אחרים של מחזור התא, והבדלים אלה מובנים היטב. 
הפרוטוקול הבא מתאר את הכנת קווי התא ואת מדידת הדינמיקה של חלבוני תיקון DNA בשלב S באתרי נזק לדנ"א הנגרמים באופן מקומי, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד בקו לייזר של 405 ננומטר. PCNA מתויג (עם mPlum) משמש כסמן מחזור תא בשילוב עם חלבון תיקון תווית AcGFP של עניין (כלומר, EXO1b) כדי למדוד את גיוס נזקי ה- DNA בשלב S.

תאים מטפלים בכל סוג של נגע DNA באופן ספציפי שתלוי גם באיזה שלב מחזור התא הם נמצאים. לדוגמה, לאחר הקרנה מיקרו, הפסקות כפולות גדילים (DSB) יעובדו על ידי צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) או HR בהתאם לשלב מחזור התא. נוקלאזים הפועלים באופן הנרחב ביותר במהלך שלבי S ו- G2 של מחזור התא יוצרים overhangs DNA החיוניים למשאבי אנוש תקינים. כדי לקדם את ההערכה של תאים בשלב S, PCNA הועסק כסמן מחזור תא בצבע יחיד. איור 1A מציג את פרופיל הלוקאליזציה של mPlum-PCNA במהלך התקדמות מחזור התא. PCNA יש התפלגות הומוגנית לחלוטין בגרעין בשלב G1 ו- G2 (תוך הכללה בעיקר מן הגרעין). בשלב S, PCNA לוקליזציה לאתרים של שכפול DNA, אשר ניתן לדמיין כתמים בהירים בגרעין. בתאי שלב S המוקדמים, הכתמים קטנים יחסית ומחולקים באופן שווה לאורך גרעין התא. מתקדמים לתוך שלב S באמצע, כתמים הופכים מטושטשים לוקליזציה יותר לכיוון ההיקף של הגרעין ואת הגרעין. בשלב S המאוחר, הכתמים מצטמקים במספרים אך הופכים גדולים יותר ויותר ככל ש-PCNA מתרכז באתרי שכפול מאוחרים(איור 1B). חשוב לציין, ביטוי PCNA אקסוגני מעמוד השדרה הווקטורי pBABE היה פחות מהרמות האנדוגניות, אך הספיק לזיהוי על ידי מיקרוסקופיה אשר ממזערת חפצים פוטנציאליים בהתקדמות מחזור התא ו- DDR. איור 1C מראה את מידת ביטוי יתר של PCNA בהשוואה לרמות אנדוגניות. שים לב כי הרצועה המתאימה ל- mPlum-PCNA נודדת לאט יותר בשל גודלה הגדול יותר.
אנו שואפים להציג DSBs במהלך הקרנה מיקרו לחקור את הגיוס תלוי PARP1/2 של EXO1b נגעים אלה בשלב S. איור 2A מראה כי מינונים נמוכים של אנרגיה (1000 μs זמן להתעכב) אינם גורמים לגיוס של EGFP-FBXL10, מגיב DSB (רכיב של מתחם FRUCC 8), בעוד זה היה מספיק כדי לגרום לגיוס של NTHL1-mCherry, חלבון מסלול תיקון כריתה בסיסית (BER), גיוס לאתרים של נזק DNA חמצוני10,11,12. בזמן 6000 μs להתעכב, הן EGFP-FBXL10 והן NTHL1-mCherry לגייס, הדגמת תפוקת לייזר שמייצרת הן נגעים חמצוניים ו- DSBs. חיזוק תוצאות אלה, איור 2B מראה כתמים אימונופלואורסצנטיים נגד γH2A.X (סמן DSB), אשר ברור יותר בעת שימוש במינונים גבוהים יותר אנרגיה. PCNA משמש הן סמן מחזור התא וסמן עבור הקרנה מיקרו מוצלחת, כפי שהוא מגייס כראוי עם שתי הגדרות זמן התעכבות לייזר. חשוב לציין, PCNA פלואורסצנטי אקסוגני ו/או אנדוגני מתויג בחלבון יכול לשמש לתפקוד כתב זה כפי שהם מתנהגים באופן דומה (איור 3). אנדוגנית מתויג PCNA תוכנן על ידי החדרת mRuby במסגרת עם האקסון הראשון לתוך אלל אחד של לוקוס PCNA13 (קו התא היה מתנה סוג של יורג מנספלד).
איור 4A ואיור 4C מציג את הגיוס של EXO1b מתויג ACGFP בתאי פאזה S. EXO1b מגיע לרמה המרבית של הצטברות באתרי הקרנה זעירה סביב 1 דקה ולאחר מכן לאט לאט מתחיל להתנתק נגעי ה- DNA לאחר מכן. העשרות באתרי מיקרו-הקרנה מוזכרות על ידי יחידת פלואורסצנטיות יחסית &gt; 1 בגרף. בנוכחות olaparib, הצטברות של EXO1b בפס הלייזר בדקה אחת היא פחותה באופן משמעותי בהשוואה לשליטה ברכב. תוצאות אלה הן בהסכמה עם הספרות6,7. איור 4B מדגים אזורים מייצגים לכימות (אזורים A, B ו- C) כמתואר בנקודה 6 בפרוטוקול. איור 4D מציג את רמות הביטוי הדומות של EXO1b אנדוגני ו-EXO1b-AcGFP אקסוגני בתאים המשמשים להקרנה זעירה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig01.jpg"> איור 1: תבנית לוקליזציה של PCNA. (A)תמונות מראות דפוס לוקליזציה של PCNA משולב ביציבות אקסוגני לאורך מחזור התא בתאי מערכת ההפעלה U-2. (B)תמונות מראות דפוסי מוקדי PCNA בשלבים שונים של שלב S (מוקדם, אמצע ומאוחר) בתאי מערכת ההפעלה U-2. (C)כתם מערבי המציג רמות אנדוגניות ואקסוגניות של PCNA בתאי מערכת ההפעלה U-2 המשמשים להדמיה. סרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig02.jpg"> איור 2: אינדוקציה של DSBs באמצעות תפוקת כוח לייזר ממוטבת. (A)ניתן למטב את הגדרות הלייזר כדי לגרום לצורות שונות של נזק לדנ"א. תאי מערכת ההפעלה U-2 מבטאים ביציבות הן EGFP-FBXL10 והן NTHL1-mCherry שימשו לזיהוי DSBs ואתרים של נגעים חמצוניים, בהתאמה. הקרנה מיקרו עם קו לייזר 405 ננומטר בוצעה על תאי מערכת ההפעלה U-2 אסינכרוניים עם 1000 μs או 3000 μs זמן השתהות. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר. (B) כתמים אימונופלואורסצנטיים נגד γH2A.X נעשה על תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושית (hTERT RPE-1) לאחר PCNA אנדוגני מתויג mRuby. התאים תוקנו ועובדו 5 דקות לאחר הקרנה זעירה עם 1000 מיקרו או 3000 μs זמן השתהות. סרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig03.jpg"> איור 3: גיוס דומה של mRuby-PCNA אנדוגני ו- mPlum-PCNA אקסוגני לאתרי מיקרו-הקרנה ב 1000 μs או 3000 μs זמן התעכבות לייזר. הן אנדוגני אקסוגני מתויג PCNA טופס מוקדי שכפול במהלך שלב S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig04.jpg"> איור 4: גיוס תלוי PARP1/2 של EXO1b בשלב S. תאי מערכת ההפעלה U-2 מבטאים ביציבות EXO1b-AcGFP ו- mPlum-PCNA היו מיקרו-הקרנה עם קו לייזר FRAP 405 ננומטר באמצעות זמן השתהות 3000 μs. (A)תמונות מייצגות של תאים מיקרו-מוקרן בנקודות הזמן שצוינו לאחר טיפול מקדים עם בקרת רכב (DMSO) או olaparib (1 μM). סרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרומטר. (B) תמונות מייצגות של אזורים מוגדרים של אזורי A, B ו- C לניתוח הגיוס. סרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרומטר. (C)דינמיקת גיוס נזקי דנ"א נתפסה על ידי הדמיה של תאים חיים. ערכי פלואורסצנטיות ממוצעים יחסית ותמונות נרכשו כל 5 s במשך 12 דקות. עבור כל תנאי, ≥30 תאים הוערכו. ערכי פלואורסצנטיות יחסיים ממוצעים (קווים שחורים מלאים) ושגיאה סטנדרטית (טווח המומחז על-ידי אזור מוצלל) התווו כנגד הזמן. קו מקווקו מציג ערכי גיוס בדקה אחת לאחר הקרנה זעירה. ההבדל בין טיפול DMSO (n = 32) לבין טיפול olaparib (n = 31) חושב באמצעות מבחן מאן-ויטני. אסטריקס מציינת עמ&lt;0.0001. (D)כתם מערבי משווה את רמות הביטוי של EXO1b אנדוגני ו EXO1b-AcGFP אקסוגני בתאים המשמשים להקרנה מיקרו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית לזיהוי יעיל של תאי S-phase למחקרי מיקרוסקופיה במורד הזרם, כגון מדידת גיוס חלבונים לתיקון דנ"א באמצעות הקרנת מיקרו-קרינה בלייזר.

הקרנת מיקרו לייזר לחקר גיוס DNA במהלך שלב S

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

פרוטוקול זה מסייע להבין את הגיוס המרחבי והזמן של חלבוני תיקון נזקי DNA, תוך התחשבות בשלב מחזור התא. עבור אפליה במחזור התא, אנו משתמשים PCNA מתויג חלבון פלואורסצנטי כסמן של שלב S, אשר עוקף חפצים שהוצגו על ידי שיטות סינכרון מחזור תאים אחרות. זה בשילוב עם מיקרו-הקרנה מבוססת לייזר נותן רזולוציה ספאתיוטמפוראלית שאין שני לה לתיקון נזקי DNA קינטיקה של חלבונים.הצלחה בניצול שגרתי של הפרוטוקול שלנו בונה על ידע בסיסי של הדמיה קונפוצלית. 24 שעות לפני המיקרו-הקרנה, צלחת סך של שמונה על 10 לתאים הרביעיים ב 500 microliters למיליליטר אחד של מדיה על זכוכית כיסוי ארבעה בארות. שעה לפני המיקרו-הקרנה, החליפו את מדיום הצמיחה הרגיל במדיום הדמיה המכיל או אולפריב או בקרת רכב כגון DMSO.לפחות ארבע שעות לפני ההדמיה, הפעל את התא הסביבתי ואת רכיבי המיקרוסקופ. להפעיל את החימום, אספקת דו תחמוצת הפחמן, ואת וסת הלחות. אתחל מקורות אור יחד עם קווי הלייזר לפחות שעה אחת לפני העברת התאים למיקרוסקופ.משמנים את מטרת המיקרוסקופ ומניחים זכוכית כיסוי מקוברת מתחת למיקרוסקופ. כדי לבחור תאי פאזה S באוכלוסייה אסינכרונית, חפש דרך העין את תבנית הלוקליזציה הייחודית של ה- PCNA המתויג של mPlum בשלב S ובחר שדה תצוגה הכולל מספיק תאי פאזה S להקרנה זעירה. הגדר את אזור העניין עבור הקרנה מיקרו באמצעות התוכנה המשויכת כדי להוסיף קווים בינאריים.כדי להגדיר את מספר השורות והמרווח הרצויים, לחץ על בינארי ולאחר מכן בחר הוסף קו, עיגול ואליפסה לציור מספר השורות הרצוי ולאחר מכן המר קווים בינאריים אלה ל- ROIs לגירוי על-ידי לחיצה על ROI, העבר בינארי ל- ROI ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל אחד מההנפקים ובחר השתמש כ- ROI S1 מגירוי. מקם קווים אלה בשדה הראייה כך שהם יעברו דרך גרעין התאים. לפני הקרנה זעירה, כדי לזהות מוקדי PCNA לניתוח מאוחר יותר, קח תמונה ברזולוציה גבוהה יותר של שדה הראייה על-ידי הגדרת הפרמטרים הדרושים ב- GUI הקומפקטי A1 LFOV ובחלונות אזור הסריקה A1 LFOV ולאחר מכן לחיצה על לחצן הלכידה. כדי להגדיר את המיקרו-הקרנה, פתח את הכרטיסייה גירוי ND ולאחר מכן לגשת לחלון לוח הזמנים כדי לרכוש סדרה של תמונות טרום גירוי ולאחר מכן סדרה של תמונות לאחר גירוי באמצעות סורקי Galvano.הגדר שלושה שלבים בחלון לוח הזמנים. בעמודת הרכישה והגירוי, בחר רכישה, גירוי ורכישה עבור שלושת השלבים בהתאמה. עבור שלב הגירוי, להגדיר S1 כמו ROI.בחלון Galvano XY, להגדיר תפוקת כוח לייזר 100% עבור קו לייזר 405 ננומטר ולהגדיר את זמן ההתעכבות עבור הקרנה מיקרו. כדי להגדיר הדמיית timelapse עבור חלון הזמן והמרווחים הרצויים, השתמש בלוח הזמנים A1 LFOV compact GUI ובחלונות אזור הסריקה A1 LFOV. מטב את אחוזי צריכת הלייזר, ההטבה וההיסט של הגדרות כדי להפחית את ההלבנה של תמונות במהלך הדמיה בחלון ה- GUI הקומפקטי A1 LFOV.בהתאם לקינטיקה של החלבון, להאריך או לקצר את המרווח בין תמונות או את משך הזמן הכולל על ידי הגדרת המרווח הרצוי ומשך עבור שורת הרכישה של השלב השלישי בחלון לוח הזמנים. לחץ לרוץ עכשיו כדי לבצע את המיקרו-הקרנה ואת הדמיית timelapse הבאים. בסוף הדמיית timelapse, שמור את ROIs גירוי כתמונות נפרדות, אשר יהיה שימושי לזיהוי הקואורדינטות של מיקרו הקרנה בכל תוכנה במורד הזרם המשמש לניתוח.ל- PCNA יש הפצה הומוגנית לחלוטין בגרעין בשלבי G1 ו- G2. בשלב S, PCNA לוקליזציה לאתרים של שכפול DNA, אשר ניתן לדמיין כתמים בהירים בגרעין. בתאי שלב S המוקדמים, הכתמים קטנים יחסית ומחולקים באופן שווה לאורך גרעין התא.תוך כדי התקדמות לשלב אמצע S, הכתמים הופכים מטושטשים ומקוסגרים יותר לכיוון היקף הגרעין והגרעין. בשלב S מאוחר, הכתמים להפחית במספרים, אבל להיות גדול יותר ויותר כמו PCNA מתרכז באתרי שכפול מאוחרים. מינונים נמוכים של אנרגיה, כגון 1,000 מיקרו שניות של זמן מגורים, אינם גורמים לגיוס של EGFP-FBXL10, מגיב הפסקה נטוש כפול, אבל מספיקים כדי לגרום לגיוס של NTHL1-mCherry, חלבון מסלול כריתה בסיסית המגויס לאתרים של נזק DNA חמצוני.ב 3, 000 מיקרו שניות להתעכב זמן, הן EGFP-FBXL10 ו NTHL1-mCherry מגויסים, מדגים תפוקת לייזר המייצרת הן נגעים חמצוניים הפסקות כפולות גדילים. EXO1b מגיע לרמה מקסימלית של אתרי הצטברות ומיקרו-הקרנה סביב דקה אחת, ולאחר מכן לאט לאט מתחיל להתנתק נגעי ה- DNA. בנוכחות olaparib, הצטברות של EXO1b בפס הלייזר בדקה אחת היא פחות באופן משמעותי בהשוואה לשליטה ברכב.חשוב מאוד שלמיקרוסקופ יינתן מספיק זמן להתחמם ושהתרבות והתנאים אופטימליים עבור כל ניסוי כדי להבטיח תוצאות עקביות. בנוסף, חשוב לייעל את הגדרות הלייזר שלך עם כתבים נזק DNA שונים כדי לבדוק נגעים DNA ספציפיים. לאחר מיקרו-הקרנה, שקול לאמת תוצאות עם שיטות ביוכימיות קלאסיות, כגון שבר, immunoprecipitation, או ChIP.גישות אלה דוגמיות אוכלוסיית תאים גדולה יותר, ובכך מספקות חוזק סטטיסטי.

laser-micro-irradiation-to-study-dna-recruitment-during-s-phase

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי.

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

בדיקת רגישות חזותית לטאות באמצעות פרדיגמה התניה אופרנטית המעסיקה וידאו השמעה אקראית של נקודה kinematograms ו ממוחשבת חסרי חוליות.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

פרוטוקול מפורט מתואר הדמיה בזמן אמת היווצרות של קומפלקסים לתקן...

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

נזק כלייתי אקוטי (AKI) בבני אדם היא בעיה קלינית נפוצה נגרמת על ידי נזק לתאי האפיתל המרכיבים nephrons כליות, AKI קשור עם שיעורי תמותה גבוהים של 5-70% 1. לאחר חורבן תא אפיתל, nephrons יש יכולת מוגבלת להתחדש, אם כי המנגנונים והמגבלות המנחים את התופעה הזאת להישאר ממעטים להבין. במאמר זה וידאו, אנחנו מתארים את הטכניקה שלנו אבלציה לייזר ממוקד של תאים נפרון כליה כליות העובר דג הזברה, או כלית ראשית. השיטה החדשה שלנו יכול לשמש כדי להשלים nephrotoxicity-Induced דגמים של AKI ולהשיג הבנה ברזולוציה גבוהה של...

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

חקור את דינמיקת גיוס חלבוני תיקון DNA במהלך שלב S באמצעות מיקרו-לייזר ומיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר חלבוני תיקון בתאים חיים.

הקרנת מיקרו לייזר לחקר גיוס DNA במהלך שלב S

גלה סרטונים נוספים