פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר

פרוטוקול זה שימושי עבור קמפיינים לגילוי הפניות מפוצלות ככלי נוסף לבחירת קטעים מבטיחים כמועמדים לחום. Nano DSO להקרנת שברים משתמש בכמות מוגבלת של דגימת חלבון ללא תווית וניתן להשתמש בו באופן שגרתי כמעט לכל מטרות החלבון. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לסנן אוספים של ליגנדים.

או כדי לאמת חום מהשיטות האחרות. מוציאים צלחת שבר ממינוס 20 או מינוס 80 מעלות צלזיוס ומניחים לה להפשיר בטמפרטורת החדר עם רעד עדין על שייקר עליון ספסל. צנטריפוגות את הצלחת ב 500 פעמים G במשך 30 שניות כדי לאסוף את כל טיפות דבק בצד של בארות.

קח צלחת התגבשות MRC 2-היטב ופיפטה 15 מיקרוליטרים של תמיסה מלאי חלבון לתוך כל תת באר באמצעות pipette רב ערוצי. כדי לבדוק הגדרות שבר וצלחת חלבון על היתוש, להפעיל את מתקן ננו ולוודא כי אין מכשולים סביב הרכיבים הנעים. פתח את ממשק המשתמש הגרפי, לחץ על הכרטיסיה התקנה ותחת תצורת סיפון בדוק אם סוג הצלחת שבה מסופקות התרכובות והצלחת שבה מועבר החלבון כבר נמצאים ברשימת הצלחות הזמינות.

אם לא, לחץ על אפשרויות ולאחר מכן על לוחות וצור הגדרת לוח חדשה על-ידי מילוי הערכים הנכונים עבור סוג המאפיין. תחת הכרטיסיה התקנה, ציין את מיקומי הלוח תחת תצורת הסיפון. באמצעות התפריט הנפתח, בחר צלחת תחתונה Grainier U למיקום אחד ו- MRC צלחת 2-well למיקום שני ולשמור את הפרוטוקול.

מניחים את צלחת השברים בעמדה אחת ואת צלחת החלבון בעמדה 2 של הסיפון. בכרטיסיית הפרוטוקול, לחץ על קובץ ובחר את הפרוטוקול שנשמר בשלב הקודם לחלוקת הקטעים. הגדר את עוצמת הקול של השברים שיש לחלק כ- 0.3 מיקרוליטרים.

עבור לוח טיפוסי שבו עמודות 1 ו- 12, אינן מכילות קטעים, הגדר את מיקום ההתחלה לעמודה 2 ואת מיקום הסיום לעמודה 11. בלוחות מסוימים, אם עמודות 2 או 11 ריקות, השתמש בעמודות שלוש ו- 10 כערכי התחלה וסיום. לחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית.

לאחר חלוקה, אשר לוקח בערך שתי דקות הושלמה, להסיר את החלבון ואת לוחות שבר מהרובוט ולאטום אותם עם סרט איטום דבק. צנטריפוגות בקצרה צלחת החלבון ב 500 פעמים G במשך 30 שניות כדי לאסוף כל טיפה דבק בצדדים הבארות לפני שתמשיך לשלב הבא. בדוק חזותית את בארות צלחת החלבון למשפכים שאולי התרחשו עקב הוספת השברים.

אם משקעים נצפים בארות רבות, להפחית את הריכוז של שברים ולחזור על הניסוי. תדליק את מכשיר הפרומתאוס. במסך המגע, הקש פתח מגירה כדי לגשת למודול הטעינה הנימי של המכשיר.

הסר את הפס המגנטי ממודול הטעינה ונקה את המראה עם אתנול כדי להסיר את כל חלקיקי אבק. כדי להעביר פתרון מצלחת שברי החלבון לנומים, הנח את צלחת החלבון ואת הנימים ליד המכשיר לגישה נוחה למודול הטעינה הנימי. קח נימי אחד מחזיק אותו בקצה אחד ולגעת בתמיסה בצלחת החלבון עם הקצה השני של הנימי כדי להעביר את המדגם.

תמיד ללבוש כפפות ולהקפיד לא לגעת נימי באמצע כמו זיהומים מן הכפפות ישפיעו על המדידה. מקם את נימי בעמדה המיועדת של המחזיק, לוודא שהוא מיושר כראוי ומרוכז, חזור על שלבים אלה כדי למלא את כל המיקומים במודול הטעינה. בסוף, מניחים את הפס המגנטי על גבי הנימים כדי להחזיק אותם במקום ולחץ על סגור מגירה כדי להתחיל את הניסוי Nano-DSF.

פתח את יחסי הציבור של יישום פרומתאוס. ThermControl וליצור פרויקט חדש על ידי לחיצה על התחל הפעלה חדשה. ראשית, בצע סריקת גילוי כדי לזהות את הפלואורסצנטיות של הדגימות. לשנות את האות הפלואורסצנטי של הדגימות על ידי התאמת כוח העירור של הלייזר.

לקבלת denaturation תרמית, לחץ על הכרטיסייה סריקת התכה, להגדיר את טמפרטורת ההתחלה ל 20 מעלות צלזיוס, טמפרטורת הקצה ל 95 מעלות צלזיוס ואת שיפוע הטמפרטורה למעלה אחת צלזיוס לדקה. לאחר מכן לחץ על התחל מדידה. התפלגות תדרים של שינוי וטמפרטורת ההיתוך עבור החיצוני, קינטי, או בא לידי ביטוי גבוה בסרטן חלבון אחד, רגולציה tetratricopeptide לחזור תחום של ציר מונופולרי קינאז 1, ו SARS-CoV-2 3c דמוי פרוטאז מוצגים כאן.

ערכים שליליים מצביעים על ירידה בטמפרטורת ההיתוך בנוכחות קטע, בעוד ערך חיובי מצביע על עלייה בטמפרטורת ההיתוך. עבור Nsp5, לכל השברים יש השפעה דה-ייצוב, ואילו עבור Hec1 ו- Mps1, הן פגיעות ייצוב והן דה-ייצוב נצפים. זוהי שיטה זולה ומהירה לסנן ספריות קטעים.

שיטות אחרות כגון NMR או קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן יכולות להראות את הכריכה המדויקת של שברים והן זמינות גם באמצעות גילוי INX. התוצאות עם פרוטאז קורונה עזרו להציע תרכובות חדשות שניתן לפתח לתרופות נגד COVID-19.