Name: בסיטו חקר מורין Megakaryopoiesis באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: חקור את המבנה האולטרה-מבני של מגהקריוציטים במח עצם עכברים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח שלבים שונים של הבשלה בתוך הסביבה הטבעית של התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לפביאן פרומר, ז'אן איב רינקל, דיוויד הופמן, מוניק פרוינד על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), האיחוד האירופי באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי (ERDF) ועל ידי גרנט ANR-17-CE14-0001-01 ל- H.d.S.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים האירופיים 2010/63/EU וועדת CREMEAS לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שטרסבורג (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). הפרוטוקול מוצג באופן סכמטי באיור 1.
1. איסוף מח עצם קיבעון ( איור 1A)
זהירות: הליך זה כולל חומרים מסרטנים, מוטגניים ו/או רעילים ומבוצע תחת מכסה מנוע כימי. ללבוש ציוד מגן מתאים כגון כפפות ומשקפי הגנות.
<ol><li>הכן את הפתרון הקיבוטורי המורכב 2.5% glutaraldehyde במאגר קקודילאט (ראה קובץ משלים).</li>
	<li>אוסף מח עצם<ol>
<li>השתמש עכברי C57BL/6 בוגרים של כל מין 12-18 שבועות של גיל. להרדים את העכברים על ידי חנק CO2 ונקע צוואר הרחם.</li>
		<li>עם זוג מספריים דקים, לחתוך את העור סביב הירך ולהשתמש פינצטה כדי לקלף את העור. הסר את הגפיים של כף היד ולאחר מכן לחתוך בין הירך לירך. לנתק את השוקה מ עצם הירך על ידי חיתוך בניסוח הברך ולהסיר רקמה דבקה על השוקה ועל עצם הירך באמצעות אזמל.</li>
		<li>הסר את האפיפיזות עם סכין גילוח חד. בעת החזקת עצם הירך עם פינצטה, השתמש מזרק 5 מ"ל מלא חוצץ קקודילאט עם מחט 21 G כדי לשטוף את מוח העצם לתוך צינור 15 מ"ל מלא חוצץ קקודילאט 2 מ"ל. כדי לעשות זאת, להכניס את שיפוע המחט לתוך פתח מח העצם ולאט לאט לחץ על הבוכנה עד מוח הוא גורש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>קיבוע מח עצם על ידי טבילה מהירה לתוך קיבוע.<ol>
<li>מיד לאחר שטיפה, להשתמש pipette פלסטיק להעביר את גליל מח העצם לתוך 1 מ"ל של פתרון קיבוע glutaraldehyde טרי (שהוכן בעבר 1.1) במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: כדי לשמר את הרקמה, ודא כי התהליך כולו, מ ניתוח עצם לשלב הקיבעון, הושלם בתוך פחות מ -10 דקות. עבור הקיבעון, ודא כי הפתרון הקיבוינטיבי הוא בטמפרטורת החדר כדי למנוע הלם חום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הטמעת מח עצם באגרוז
הערה: רקמת מח עצם אינה מגובשת מספיק כדי לשמור על שלמותה במהלך שלבי הכביסה השונים והחומר יכול ללכת לאיבוד בקלות. כדי להתגבר על בעיה זו, מח העצם מכוסה בג'ל אגר לפני התייבשות.
<ol><li>הכן את פתרון אגרוז כמתואר בקובץ המשלים.</li>
	<li>לשטוף את מח העצם הקבוע מסעיף 1.3 במאגר קקודילט ולהעביר אותו בזהירות למגלשת זכוכית באמצעות pipette פלסטיק. באמצעות פיפטה חמה, להחיל במהירות טיפה של 2% אגר נוזלי על גליל מח העצם. הערה: אגר מתמצק במהירות בעת קירור. כדי להבטיח כיסוי הומוגני של מח העצם, יש לשמור על פתרון אגר חם עד שהוא מופקד על המגלשה.</li>
	<li>מניחים במהירות את המגלשה במהירות על הקרח עד שהאגר מתמצק (1-2 דקות).</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ, השתמש בסכין גילוח חדה כדי לחתוך ולהשליך את הגפיים של גליל מח העצם בגלל דחיסת רקמות אפשרית באזורים אלה. העבר את בלוקי מח העצם בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכילים 1 מ"ל של חוצץ קקודילאט.</li>
</ol>3. הטמעת מח עצם בשרף
זהירות: רכיבי שרף רעילים; חלקם מסרטנים ויש לטפל בהם בזהירות תחת מכסה מנוע מיצוי כימי. יש להשתמש בציוד מגן מתאים כגון כפפות ומשקפי הגנה. אוסמיום tetroxide הוא נדיף מאוד בטמפרטורת החדר והאדים שלה מזיקים מאוד לעיניים, לאף ולגרון. לפני שהושלך, 2% osmium tetroxide חייב להיות מנוטרל על ידי הוספת כפול נפח שמן צמחי שלה.
<ol><li>הכן את שרף אפוקסי כמתואר בקובץ המשלים.</li>
	<li>הטבעת שרף הערה: שמור את הדגימות באותם צינורות microcentrifuge במהלך דגירה באמבטיות רצופות של אוסמיום, אצטט אורניל ואתנול. שאפו את אנטנטי העל עם פיפטת פסטר. נפח הפתרון המשמש עבור כל אמבטיה חייב להיות שווה לפחות פי 10 מנפח המדגם.<ol>
<li>לאחר לתקן את הבלוקים עם 1% אוסמיום במאגר קקודילאט עבור 1 שעות ב 4 °C (70 °F), לשטוף פעם אחת במאגר קקודילציה ולאחר מכן פעם במים מזוקקים.</li>
		<li>כתם עם 4% אורניל אצטט במים מזוקקים במשך שעה אחד, לשטוף פעמיים במים מזוקקים.</li>
		<li>להתייבש דרך סדרה מדורגת של אתנול במים מזוקקים: 4 פעמים ב 75% אתנול במשך 5 דקות, ואחריו 3 פעמים ב 95% אתנול במשך 20 דקות ולאחר מכן 3 פעמים ב 100% אתנול במשך 20 דקות. בשלב זה, להוציא מזרק אחד של שרף אפוקסי מהמקפיא. הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה ב 100% אתנול במשך 1 שעה.</li>
		<li>כדי להשיג חדירה אחידה פילמור של שרף אפוקסי בתוך מח העצם, דגירה תחילה בלוקים ב 2 אמבטיות רצופות של תחמוצת פרופילן במשך 15 דקות.</li>
		<li>מוסיפים תערובת 1:1 של תחמוצת פרופילן 100% ושרף אפוקסי ודגרה במשך שעה אחת. מניחים את הדגימות על שייקר סיבובי איטי בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מוסיפים 100% שרף אפוקסי להשאיר את המדגם עבור דגירה לילה תחת תסיסה.</li>
		<li>מוסיפים 100% שרף אפוקסי לדגירה של 2 שעות, עדיין תחת עצבנות.</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ, מניחים את גושי מח העצם לתוך תבניות סיליקון שטוחות. כוון דגימות כדי לאפשר חתך רוחבי עוקב של מח העצם כולו. ממלאים את התבניות בשרף אפוקסי ומניחים אותן ב-60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. הערה: כל הפתרונות (למעט אתנול ותחמוצת פרופילן) מסוננים באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר כדי למנוע זיהום דגימות. כדי להבטיח פילמור נאות של שרף, להימנע בועות בעת מילוי התבניות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. חתך אולטרה-דק (איור 1B)
הערה: שידור EM דורש מקטעי רקמות דקות שדרכם אלקטרונים יכולים לעבור יצירת תמונת הקרנה של פנים התאים, המבנה, וארגון של אברונים פנימיים (גרגירים, רטיקולום אנדופלסמי, Golgi) ואת הסידור של קרום התא התא התאי.
<ol><li>הר את בלוק המדגם בתמיכה אולטרה-מיקרוטומית. שים את זה על מחזיק הדגימה. חותכים את הדגימות ב 45° על מנת להסיר את עודף השרף סביב הרקמה עם יהלום מסתובב או חותך טונגסטן כרסום.</li>
	<li>הר את הדגימות על ultramicrotome עם להב סכין יהלום מצויד במיכל מים. חתוך מקטעים רוחביים של 500 ננומטר ועובי של 100 ננומטר עבור ניתוחים היסתולוגיים ו- TEM, בהתאמה. לאסוף קטעים צפים על פני המים עם לולאה.</li>
	<li>הפקד את החלק בעובי 500 ננומטר על מגלשת זכוכית וחלקים בעובי 100 ננומטר על רשתות נחושת 200 רשת דק-בר עם מסנן נייר מתחת. הכן חמש רשתות לתנאי אחד: הכתים שתי רשתות תחילה ושמור על שלוש הרשתות הנותרות כגיבוי במידת הצורך.</li>
</ol>5. תכתם כחול טולואידין להיסתולוגיה
הערה: מקטעי הכתמה עבור היסתולוגיה חשוב משלוש סיבות: 1) כדי לוודא כי הרקמה נחתכת למעשה ולא את השרף, 2) כדי לבדוק את איכות ההכללה, ו 3) כדי להעריך במהירות את דגימת מח העצם. אם זה לא נכון, לחתוך עמוק יותר בבלוק.
<ol><li>יבש את החלקים הדקים למחצה להחליק על צלחת חום (60 °C (60 °C ).</li>
	<li>הוסף מסנן 1% טולואידין כחול / 1 % נתרן בוראט במים מזוקקים על המגלשות וחום על צלחת חמה (60 °C )C) במשך 1-2 דקות. לשטוף את המגלשות עם מים מזוקקים ולתת לו להתייבש על צלחת החום.</li>
	<li>הרכבה של מקטעים על כיסויים עם טיפה של פולי (בוטיל מתקליט-שותף-מתיל מת'קרילט) הרכבה בינונית ובוחנת תחת מיקרוסקופ אור.</li>
</ol>6. כתמי מתכת כבדה לתצפית TEM (איור 1C)
הערה: עבור הניגודיות, הצד העליון של הרשתות הפוכים על 100 טיפות μL של כל אמבטיה רצופה עם לולאה. לפני השימוש, כל פתרון מסונן ב- 0.22 מיקרומטר. הסר את עודף הנוזל בין כל אמבטיה על ידי מגע עדין בצד הרשת על נייר מסנן.
<ol><li>כתם עם 4% אורניל אצטט במים מזוקקים במשך 5 דקות.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים במים מזוקקים במשך 5 דקות.</li>
	<li>כתם עם ציטוט עופרת במשך 3 דקות.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים במים מזוקקים במשך 5 דקות.</li>
	<li>הפקד את הרשתות בצד התחתון במגע עם נייר המסנן כדי לאפשר להם להתייבש. הערה: מתכות כבדות מגיבות בנוכחות פחמן דו חמצני. כדי למזער את המשקעים, הימנעו מהתזוזת אוויר במהלך הניגודיות, אל תדברו, שמרו על הסביבה רגועה וכבה את המזגן.</li>
</ol>7. טמ (איור 1E)
הערה: המקטעים מוצגים במיקרוסקופ TEM ונבדקים ב- 120 kV.
<ol><li>ראשית לבחון את הסעיפים בהגדלה נמוכה (< 500x) כדי להעריך את ההיבט הכללי של ההכנה (היעדר חור בשרף, קפלים / דחיסה בקטעים, משקעים עקב כתמים).</li>
	<li>לאחר מכן לבחון את הסעיפים בהגדלה גבוהה יותר (~ 2000x המאפשר להבחין בין שלב ההתבגרות). ספירה ידנית של המגקריוציטים מכל שלב של התבגרות על-פני מקטעים רוחביים שלמים (ראה תוצאות מייצגות כיצד לזהות חזותית כל שלב). הערה: כל ריבוע של הרשתות מוגדר כאזור לבדיקה (השווה ל- 16000 מיקרומטר2 עבור 200 רשתות נחושת רשת).</li>
	<li>כדי להעריך את מספר המגקריוציטים, לכמת רק את הריבועים המכוסים במלואם במקטע. כדי לעשות זאת, השתמש במודל המבוסס על הקרנת טווחים. צפה בטווח הראשון של ריבועים מקיצוניות של המקטע למשנהו, ואז טווח אחר באותו אופן, וכו '. באמצעות הליך זה, לסנן באופן מלא ושיטתי את כל מח העצם רוחבי קטע מרובע אחר ריבוע.</li>
	<li>עבור כל ריבוע, הבקיעו את מספר המגקריוציטים שלב I, II או III. הערה: הגדלות גבוהות יותר נדרשות כדי לנתח את הגרגרים, ארגון DMS, את גודל השטחים הציטופלסמיים ואת הגרעין polylobulated.</li>
</ol>

<ol><li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incredible+journey%3A+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li>
<li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+%28HIV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9(1989).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+%28DMS%29+in+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li>
<li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+megakaryocytes+to+platelets%3A+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets+and+Megakaryocytes%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061(2018).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024(2020).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+%CE%B1-Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li>
<li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emperipolesis%2C+entosis+and+cell+cannibalism%3A+Demystifying+the+cloud%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92(2017).</li>
<li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

בדיקה ישירה של megakaryocytes בסביבתם הטבעית חיונית כדי להבין megakaryopoiesis היווצרות טסיות דם. בכתב יד זה, אנו מספקים שיטת מיקרוסקופיה אלקטרונית שידור המשלבת שטיפה של מח עצם קיבעון על ידי טבילה, ומאפשר לנתח במקום את המאפיינים המורפולוגיים של כל התהליך של מורפוגנזה מגהקריוציט המתרחש במח העצם.
שטיפה של מח העצם היא צעד קריטי של שיטה זו, כמו ההצלחה של שטיפה באיכות גבוהה תלוי בפועל והכשרה של המפעיל. למרות עדין, שטיפה של מח העצם היא הדרך הטובה ביותר להימנע מהסרת העצם מינרלית, אשר בדרך כל...

Megakaryocytes הם תאים פוליפלואידים גדולים מיוחדים, מקומי במח העצם, אחראי על ייצור טסיות דם1. מקורם בתאי גזע hematopoietic באמצעות תהליך התבגרות מורכב, שבמהלכו מבשרי megakaryocyte גדלים בהדרגה, תוך כדי שינויים מורפולוגיים בו זמנית נרחבים בציטופלסמה ובגרעין2. במהלך ההבשלה, megakaryocytes לפתח מספר אלמנטים מבניים בולטים כולל: גרעין polylobulated, פולשים של קרום פני השטח היוצרים את מערכת קרום התיחום (DMS), אזור היקפי נטול אברונים מוקף רשת cytos שלד מבוסס actin, אברונים רבים כולל α-גרגירים, גרגירים צפופים, ליזוזומים, ומתחמי Golgi מרובים. ברמה האולטרה-מבנית, שינוי משמעותי שנצפה הוא המידור הציטופלסמי לאזורים נפרדים המופרדים על ידי DMS3. אספקה נרחבת זו של ממברנות תדלק את הרחבת התהליכים הציטופלסמיים הארוכים בשלב הראשוני של ייצור טסיות הדם, אשר לאחר מכן לשפץ לתוך טסיות בתוך מחזור הדם. כל פגם במהלך בידול megakaryocyte והתבגרות יכול להשפיע על ייצור טסיות דם במונחים של ספירת טסיות דם ו /או פונקציית טסיות דם. 
מיקרוסקופיית אלקטרונים העברת שכבה דקה (TEM) הייתה גישת ההדמיה של בחירה במשך עשרות שנים ומספקת אולטרה-מבנה באיכות גבוהה של מגהקריוציטים שעיצבו את הבנתנו את הפיזיולוגיה של תרומבוזיס4,5. מאמר זה מתמקד בשיטת TEM מתוקננת המאפשרת ללכוד את תהליך ביוגנזה טסיות הדם המתרחשות במקום בתוך microenvironment מח העצם המקומי, אשר יכול לשמש גם כבסיס לנתח כל סוג תא מח עצם. אנו מספקים דוגמאות אולטרה-מבניות להתפתחות של מגהקריוציטים ממבוגרים עד בוגרים לחלוטין, המרחיבים תהליכים ציטופלסמיים לתוך מיקרו-סירקולציה שלסינוסים 6. אנו מתארים גם הליך קל לכימות שלבי ההתבגרות השונים של המגקריוציט, המלמדים על התחדשות ויכולת ייצור טסיות הדם של מח העצם.

<table><tbody><tr><td>2,4,6-Tri (dimethylaminomethyl) phenol (DMP-30)</td> <td>Ladd Research Industries, ארה"ב</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>Agarose type LM-3 נקודת התכה נמוכה Agar</td><td>Electron Microscopy Sciences, ארה"ב</td><td>1670-B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 סידן כלוריד הקסהידראט</td><td>Merck, גרמניה</td><td>2083</td><td></td></tr><tr><td>רשתות נחושת 200 רשת Oxford Instrument</td><td>, Agar Scientifics, אנגליה</td><td>T200-CU</td><td></td></tr><tr><td>חומצה Dimethylarsinic מלח נתרן טריהידראט</td><td>Merck, גרמניה</td><td>8.20670.0250</td><td></td></tr><tr><td>Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)</td> <td>Ladd Research Industries, ארה"ב</td><td>21340</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח אל חלד כפול קצה</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences-EMS, ארה"ב</td><td>EM-72000</td><td></td></tr><tr><td>אתנול אבסולוט</td><td>VWR International, צרפת</td><td>20821296</td><td></td></tr><tr><td>מסנן נייר, קוטר 90 מ"מ</td><td>Whatman, אנגליה</td><td>512-0326</td><td></td></tr><tr><td>תבנית סיליקון שטוחה הטבעה</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientific, אנגליה</td><td>G3533</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25%</td> <td>Electron Microscopy Sciences-EMS, ארה"ב</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>פלטת חום Leica EMMP</td><td>Leica Microsystems GmbH, אוסטריה</td><td>705402</td><td></td></tr><tr><td>סכין יהלום Histo 45&deg;</td><td>Diatome, שוויץ</td><td>1044797</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ JEOL 2100 Plus TEM</td><td>JEOL, יפן</td><td>EM-21001BU</td><td></td></tr><tr><td>ציטראט עופרת - Ultrostain 2</td><td>Leica Microsystems GmbH, אוסטריה</td><td>70 55 30 22</td><td></td></tr><tr><td>LX-112 שרף</td><td>Ladd Research Industries, ארה"ב</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>סיגמא, צרפת</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה - פולי (בוטיל מתקרילט-קו-מתיל מתקרילט)</td> <td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית-EMS, ארה"ב</td><td>15320</td><td></td></tr><tr><td>Nadic Methyl Anhydride (NMA)</td> <td>Ladd Research Industries, ארה"ב</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד 2%</td> <td>Merck, גרמניה</td><td>19172</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת פרופילן (1.2-אפוקסיפרופאן)</td> <td>סיגמא, צרפת</td><td>82320-250ML</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח להזרקה 0.9% NaCl</td><td>C.D.M Lavoisier, צרפת</td><td>MA 575 420 6</td><td></td></tr><tr><td>להב פלדה כירורגי אזמל</td><td>סוואן-מורטון, אנגליה.0508</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>נתרן טטרבוראט - בורקס</td><td>סיגמה, צרפת</td><td>B-9876</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>מרק, גרמניה</td><td>84100-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק 0.2& מיקרו; m</td><td>Pall Corporation, ארה"ב</td><td>514-4126</td><td></td></tr><tr><td>טולואידין כחול</td><td>Ladd Research Industries, ארה"ב</td><td>N10-70975</td><td></td></tr><tr><td>גוזם EM TRIM2</td><td>Leica Microsystems GmbH, אוסטריה</td><td>702801</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td><td>Leica Microsystems GmbH, אוסטריה</td><td>656201</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>Ladd Research Industries, ארה"ב</td><td>23620</td><td></td></tr></tbody></table>

בסיטו חקר מורין megakaryopoiesis באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

בידול והתבגרות של megakaryocytes להתרחש בשיתוף הדוק עם הרכיבים התאיים והחוץ תאיים של מח העצם. תהליכים אלה מאופיינים בהופעה הדרגתית של מבנים חיוניים בציטופלסמה של מגהקריוציטים כגון גרעין פוליפלואידי ופוליבולוס, רשת ממברנות פנימית הנקראת מערכת קרום תיחום (DMS) וגרגרי אלפא צפופים ואלפא שיימצאו בטסיות דם במחזור. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול סטנדרטי למחקר אולטרה-מבני של מקרונים מורין באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), המאפשר זיהוי של מאפיינים מרכזיים המגדירים את שלב ההתבגרות שלהם ואת הצפיפות התאית במח העצם. מח העצם הוא סמוק, קבוע, מיובש באתנול, מוטבע שרף פלסטיק, ומותקן ליצירת חתך. חלקים דקים ודקים למחצה מוכנים לתצפיות היסתולוגיות ו- TEM, בהתאמה. שיטה זו יכולה לשמש עבור כל תא מח עצם, בכל מתקן EM ויש לו את היתרון של שימוש בגדלים מדגם קטן המאפשר שילוב של מספר גישות הדמיה על אותו עכבר.

היסתולוגיה של מח עצם התבוננות בהיסתולוגיה הכחולה של מח העצם תחת מיקרוסקופ אור היא המפתח לנתח במהירות את ארכיטקטורת הרקמות הכוללת במונחים של למשל, דחיסות רקמות, המשכיות מיקרו-בסל, וגודלם וצורה של מגה-קריוציטים (איור 1D). זה מבוצע לפני קטעים ultrathin כדי לקבוע את הצורך של חיתוך עמוק יותר בבלוק מח העצם. בשל גודלם הענק ו lobulation הגרעיני שלהם, megakaryocytes בוגר יותר ניתן לדמיין בקלות עם מטרה 40x. זה נותן סקירה מצוינת ומהירה של הצפיפות של megakaryocytes ב...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח אולטרה מבנה של megakaryocytes במקום באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM). מח עצם מורין נאספים, קבועים, מוטבעים בשרף אפוקסי וחתוכים בחלקים אולטרה-דקים. לאחר כתמי ניגודיות, מוח העצם נצפה תחת מיקרוסקופ TEM ב 120 kV.

בסיטו חקר מורין Megakaryopoiesis באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן במבנה האולטרה של מגהקריוציטים הממוקמים בתוך מח העצם של העכבר, ולכומת את שלבי ההתבגרות השונים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור ברזולוציה גבוהה. היתרון העיקרי הוא בחינה ישירה של megakaryocytes בסביבה המקומית, אשר שונה מ מותחקריוציטים מתורבתים במבחנה כי כפי שאנו יודעים לא להגיע לרמה המלאה של ההתבגרות. לאחר קצירת השוקה ועצם הירך מ 12 עד 18 שבועות C57BL/ 6 עכברים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, להשתמש בסכין גילוח חד כדי להסיר את epiphyses מכל עצם.מחזיקים כל עצם עם פינצטה, מכניסים מחט 21 מד מחובר מזרק חמישה מיליליטר מלא חוצץ קקודילאט לקצה אחד של העצם לשטוף את מח העצם לתוך צינור אוסף 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של חוצץ קקודילאט טרי. מיד לאחר השטיפה, השתמש פיפטה פלסטיק להעביר את גלילי מח העצם לתוך מיליליטר אחד של פתרון קיבוע גלוטרלדהיד טרי עבור דגירה של 60 דקות בטמפרטורת החדר. להטמעת מח העצם באגרוז, יש לשטוף את הדגימות הקבועות במאגר קקודילט טרי ולהשתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר בזהירות את מח העצם למגלשת זכוכית.באמצעות פיפטה חמה, להחיל במהירות טיפה של 2% אגר נוזלי על גלילי מח העצם, ומיד למקם את השקופית על קרח במשך 1 עד 2 דקות. כאשר האגר התגבש, השתמש במיקרוסקופ סטריאו ובסכין גילוח חד כדי להשליך את הגפיים של כל גליל מח עצם ולהעביר את גושי מח העצם הקצוצים

in-situ-exploration-murine-megakaryopoiesis-using-transmission

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חדשה לזיהוי אוכלוסייה של enucleating erythroblasts אורתוכרומטי ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry, מתן להדמיה של תהליך אנוקלאציה erythroblast.

זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

מונוציטים הם מווסתים מרכזיים של חסינות מולדת וממלאים תפקיד קריטי בחידוש המערכת הפגוציטית החד-גרעינית ההיקפית ובמקרה של דלקת. כתב יד זה מתאר את הליך ההדמיה בזמן אמת של מח העצם של קלווריה של העכבר כדי לחקור את מנגנון הגיוס של המונוציטים.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

אנו מפרטים פרוטוקול לניטור התנהגותם של נויטרופילים ומונוציטים בוורידים מזנטריים במצב יציב ובתנאים דלקתיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-חיונית בעכברים מורדמים.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

ומונוציטים הם מתווכים חשובים של arteriogenesis בהקשר של מחלת עורקים היקפית. פרוטוקול זה באמצעות מטריקס קרום המרתף דמוי מיקרוסקופ intravital, חוקר אנגיוגנזה ביות ו הקשורות הגידול מונוציט לאחר ההזרקה מונוציט במודל מאתר מצדו בעורק הירך.

מיקרוסקופ intravital של יונת מונוציט, הקשורות הגידול אנגיוגנזה במודל מאתר של מחלת עורקים היקפית

אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

שיטה זו מתארת את הטיהור על ידי ציטומטריית זרימה של MEP ו- MKP מעצמות הירך של העכברים, השוקה ועצמות האגן.

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

אנו מתארים כאן את השיטה להדמיית מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם הגולגולתית של עכברים חיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.

ב-Vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר

כאן, אנו מציגים אסטרטגיית אימונופנוטיפינג לאפיון של בידול מגה-קריוציטים, ומראים כיצד אסטרטגיה זו מאפשרת מיון של מגה-קריוציטים בשלבים שונים באמצעות סדרן תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות. המתודולוגיה יכולה להיות מיושמת על רקמות ראשוניות אנושיות, אלא גם על מגה-קריוציטים הנוצרים בתרבות במבחנה.

אימונופנוטיפינג ומיון תאים של חברי כנסת אנושיים ממקורות ראשוניים אנושיים או מובחנים במבחנה מאבות ההמטופיאטיים

הליך פצע ניקוב להיווצרות פקקת המוסטטית מוצג כאן. הטרומבי שנוצר גדול וקוטרו מאות מיקרונים. לפיכך, גישות הדמיית נפח מתאימות. אנו מציעים מונטאז' מיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח שידור כגישה ברזולוציה גבוהה הזמינה לרבים ומפרטים פרוטוקול הכנה.

מוסטזיס פצע ניקוב והכנת דגימות לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח מונטאז'

חקור את המבנה האולטרה-מבני של מגהקריוציטים במח עצם עכברים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח שלבים שונים של הבשלה בתוך הסביבה הטבעית של התאים.

בסיטו חקר מורין Megakaryopoiesis באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

גלה סרטונים נוספים