Name: תרבות Megakaryocyte בהידרוגל מבוסס מתילצלולוז תלת מימדי לשיפור התבגרות התאים וחקר ההשפעה של נוקשות וכליאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: חקור תרבות מגהקריוציטים בהידרוג'ל מתילצלולוז תלת מימדי לחקירת השפעת נוקשות וכליאה על התבגרות תאים. השיטה מאפשרת חיקוי סביבת מח העצם ושיפור ייצור פרופלטלטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לפביאן פרטוי ואלישיה אגילר שפיתחו לראשונה טכניקה זו במעבדה, כמו גם דומיניק קולין (מכון צ'ארלס סאדרון - שטרסבורג) שאפיינו את המאפיינים הצמיגים של הידרוג'ל מתיל צלולוז. עבודה זו נתמכה על ידי ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) ועל ידי מענק ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). ג'ולי בושר היא מקבלת פונדציה לשפוך la Recherche Médicale (מספר מענק FRM FDT202012010422).

<ol><li>Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+of+Mechanical+Confinement+by+Mesenchymal-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Stiffness+Modulates+Patient-Derived+Glioblastoma+Cell+Fates+in+Three-Dimensional+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2020).</li>
<li>Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+via+cell-matrix+adhesions+in+3D+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Choi, J. S., Harley, B. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combined+influence+of+substrate+elasticity+and+ligand+density+on+the+viability+and+biophysical+properties+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).</li>
<li>Shin, J. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+forces+sustain+and+polarize+hematopoiesis+from+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells.</a> Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).</li>
<li>Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+platelet+formation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Blood platelet formation at a glance.</a> Journal of cell science. 133 (20), (2020).</li>
<li>Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+in+a+methylcellulose-based+hydrogel+to+study+the+impact+of+stiffness+on+megakaryocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).</li>
<li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128, 2022-2032 (2016).</li>
<li>Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoietin+from+beginning+to+end%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Thrombopoietin from beginning to end.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).</li>
<li>Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+stiffness+in+megakaryocyte+and+platelet+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function.</a> American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).</li>
<li>Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+intact+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanics of intact bone marrow.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בעשור הקודם, המכנוביולוגיה עוררו יותר ויותר עניין בתחומים רבים של ביולוגיה. כיום מקובל להכיר בכך שהסביבה המכנית המקיפה את התאים ממלאת תפקיד בהתנהגותם, תוך הדגשת החשיבות ללמוד כיצד מגהקריוציטים חשים ומגיבים לרמזים מכניים חוץ-תאיים. זה מאתגר למדוד במדויק את נוקשות רקמת מח העצם במקום11, במיוחד אם ניקח בחשבוןאת מח העצם האדום hematopoietic כפי שהוא ממוקם בתוך עצמות trabecular ביונקים גדולים בעוד מח העצם נגיש יותר מן הדיאפיזה מורכב בעיקרו של אדיפוזיטים (מח צהוב)12. במקרה...

תאים בגוף חווים מיקרו-סביבה תלת-ממדית מורכבת והם נתונים ליחסי הגומלין בין רמזים כימיים ומכנופיזיים כולל נוקשות מהרקמה וכליאה עקב תאים שכנים ומטריצת 1,2,3. החשיבות של נוקשות וכליאה להתנהגות התא הוכרה רק בעשורים האחרונים. בשנת 2006, העבודה המכוננת של אנגלר ואח '4 הדגישה את החשיבות של הסביבה המכנית לבידול תאים. המחברים הדגימו כי וריאציה נוקשות מצע התא הביאה לכיוון של תאי גזע לכיוון שושלות בידול שונות. מאז, ההשפעה של רמזים מכניים על גורל התא והתנהגות הפך מוכר יותר ויותר ונלמד. למרות היותו אחד הרקמות הרכות ביותר של האורגניזם, מוח העצם יש ארגון מבני 3D כי הוא מוגבל בתוך העצם. נוקשות מח העצם, אם כי מבחינה טכנית קשה למדוד במדויק, מוערך לשקר בין 15 ל 300 Pa 5,6. בתוך הסטרומה, התאים מוגבלים זה לזה. בנוסף, רובם נודדים לכיוון כלי הסינוסואידים כדי להיכנס למחזור הדם. תנאים אלה יוצרים אילוצים מכניים נוספים על תאים סמוכים, אשר צריכים להסתגל לכוחות אלה. רמזים מכניים מייצגים פרמטר חשוב שהשלכותיו על בידול מגה-קריוציטים ויצירת פרופלטלטים נחקרו רק לאחרונה. למרות megakaryocytes יכול להבדיל במבחנה בתרבות נוזלית מסורתית, הם לא מגיעים את מידת ההתבגרות שנצפו ב vivo, בין היתר בשל היעדר רמזים מכניים מסביבה 3D 7. גידול אבות המוטמעים הידרוג'ל מביא רמזים מכניים 3D כי הם חסרים מילייה נוזלי.
הידרוג'לים היו בשימוש נרחב במשך כמה עשורים בתחום ההמטולוגי, במיוחד כדי לגדל תאים במושבה ויוצרים התקפות כדי לכמת אבות hematopoietic. עם זאת, הידרוג'לים כאלה שימשו לעתים רחוקות כדי לחקור את ההשפעה הביולוגית של הסביבה המכנית 3D על התבגרות ובידול של תאים hematopoietic. במהלך השנים האחרונות המעבדה שלנו פיתחה מודל תרבות תלת מימד באמצעות הידרוג'ל מבוסס מתיל צלולוז 8. ג'ל פיזי לא פעיל זה הוא כלי שימושי כדי לחקות את האילוצים הפיזיים של הסביבה megakaryocyte המקומית. הוא נגזר תאית על ידי החלפת שאריות הידרוקסיל (-OH) על ידי קבוצות מתאוקסיד (-OCH3). הן מידת החלפת המתיל והן ריכוז המתיל צלולוז קובעים את נוקשות ההידרוגל ברגע שהוא מתמזג. במהלך שלב הפיתוח של טכניקה זו, הוכח כי מודולוס של יאנג בטווח של 30 עד 60 Pa הוא נוקשות הג'ל האופטימלית לצמיחת megakaryocyte 9.
הפרוטוקול הבא מתאר שיטה לגדל אבות מקרוציטים עכבר בהידרוג'ל מתיל צלולוז תלת-ממדי. הוכח בעבר כי בהשוואה לתרבות נוזלית סטנדרטית, תרבות הידרוג'ל זו מגדילה את מידת הפוליטואידיזציה של מגהקריוציטים, משפרת את ההבשלה ואת הארגון התאי, ומגבירה את הקיבולת של מגהקריוציטים להרחיב את ההפצפות לאחר תפירה מחדש במדיום נוזלי 9. כתב יד זה מתאר בפירוט את הפרוטוקול לבידוד של תאי לין עצם העכבר והטבעתם בהידרוג'ל מתילצלולוז לתרבות תלת-ממדית, כמו גם לכימות יכולתם לייצר פרופלטלטים והתאוששות התאים עבור ניתוחים נוספים.

<table><tbody><tr><td>מחטים 18 מד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1001735825</td><td></td></tr><tr><td>מחטים 21 מד</td><td>BD מיקרולנס</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>23 מחטים מד</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td></td></tr><tr><td>25 מד נילדס</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>4 בארות תרמו</td><td>מדעי</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרקים</td><td>Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>Cytoclips</td><td>Microm Microtech</td><td>F / CLIPSH</td><td></td></tr><tr><td>Cytofunnels מצוידים בכרטיסי סינון</td><td>Microm Microtech</td><td>F / JC304</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה Cytospin</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Cytospin 4</td></tr><tr><td>Dakopen</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>41 966-029</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>דולבקו סטרילי s מגנטים מגנטים EasySep עם חוצץ פוספט</td></tr><tr><td></td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד תאי אב Hematopoietic Mouse EasySep</td> טכנולוגיות <td>תאי גזע</td><td>19856A</td><td>נוגדנים ביוטיניים (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7&ndash; 4) וחרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי בריאות</td><td>מדעי החיים</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>מזרקי Luer lock 1 מ"ל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>או מזרקי 309628 מ-BD MEDICAL</td></tr><tr><td>Luer מחברי מזרקים מנעול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11891120</td><td></td></tr><tr><td>MC 3%</td> <td>R& המגבר; D systems</td><td>HSC001</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מצופות פוליליזין</td><td>Thermo Scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10,000 יחידות/מ"ל פניצילין, 10,000 &mu; גרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-29.2 מ"ג/מ"ל גלוטמין</td></tr><tr><td>סרום עכברוש</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>הירודין רקומביננטי</td><td>טרנסג&egrave; ne</td><td>rHV2-Lys47</td><td></td></tr><tr><td>טרומבופויאטין אנושי רקומביננטי (rhTPO)</td> <td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>2822</td><td>10,000 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>צינורות פלסטיק עגולים עם תחתית 10 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td></td><td></td><td></td> פוליסטירן עגולים עם תחתית 5 מ"ל</tr></tbody></table>

תרבות megakaryocyte בהידרוג'ל מבוסס מתילצלולוז תלת מימדי לשיפור התבגרות התאים וחקר ההשפעה של נוקשות וכליאה

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

הסביבה 3D המוביל הן כליאה ואילוצים מכניים מזוהה יותר ויותר כגורם מכריע חשוב של התנהגות התא. לפיכך, פותחה תרבות תלת-ממד כדי לגשת טוב יותר למצב ה-in vivo. Megakaryocytes להבדיל גזע hematopoietic ותאי אבות (HSPCs) במח העצם (BM). BM היא אחת הרקמות הרכות ביותר של הגוף, מרותק בתוך העצם. העצם להיות מתרחב בצורה גרועה בסולם התא, megakaryocytes כפופים במקביל נוקשות חלשה וכליאה גבוהה. פרוטוקול זה מציג שיטה לשחזור של שושלת העכבר שלילית (Lin-) HSPCs על ידי מיון אימונו-מגנטי ואת הבידול שלהם לתוך megakaryocytes בוגר במדיום 3D המורכב methylcellulose. Methylcellulose אינו מגיב כלפי megakaryocytes ואת נוקשותו ניתן להתאים לזה של מח עצם נורמלי או מוגבר כדי לחקות מח פירוטי פתולוגי. התהליך לשחזור megakaryocytes עבור ניתוחי תאים נוספים מפורט גם בפרוטוקול. למרות הרחבת proplatelet נמנע בתוך המילייה 3D, הוא מתואר להלן כיצד resuspend megakaryocytes במדיום נוזלי לכמת את יכולתם להרחיב את הנפצים. Megakaryocytes גדל הידרוג'ל 3D יש יכולת גבוהה יותר ליצור מפיץ לעומת אלה גדלו milieu נוזלי. תרבות תלת-ממדית זו מאפשרת i) להבדיל בין אבות לכיוון megakaryocytes להגיע למצב התבגרות גבוה יותר, ii) כדי לשחזר פנוטיפים שניתן לראות ב vivo אבל ללכת מעיניו בתרבויות נוזליות קלאסיות, ו - iii) כדי ללמוד מסלולי טרנסאדוקציה המושרה על ידי רמזים מכניים המסופקים על ידי סביבה 3D.

נתונים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה פורסמו במקור בדם בשנת 20169.
על פי הפרוטוקול, התאים נזרעו במדיום הידרוג'ל נוזלי או מתיל צלולוז. תאים במדיום נוזלי יש כל משקעים בתחתית הבאר, במגע עם משטח פלסטיק נוקשה מתישהו עם תאים אחרים. לעומת זאת, תאים המוטמעים בהידרוג'ל מתילסלולוז מופצים באופן הומוגני בג'ל ומבודדים מתאים סמוכים(איור 3A). ג'ל Methylcellulose בריכוז סופי של 2% מגדיל מעט מאוד את קוטר המגקריוציטים הממוצע בהשוואה לתרבות הנוזלית (<strong class...

כיום ידוע כי הסביבה התלת ממדית של התאים יכולה למלא תפקיד חשוב בהתנהגותם, בהבשלתם ו/או בבידולם. פרוטוקול זה מתאר מודל תרבית תאים תלת מימדי שנועד לחקור את ההשפעה של בלימה פיזית ואילוצים מכניים על megakaryocytes.

תרבות Megakaryocyte בהידרוג'ל מבוסס מתילצלולוז תלת מימדי לשיפור התבגרות התאים וחקר ההשפעה של נוקשות וכליאה

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

פרוטוקול זה מאפשר הערכה במבחנה של ההשפעה של כליאה ונוקשות בינונית שאליה נחשפים מגהקריוציטים מקומיים במח העצם על התנהגותם והבשלתם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מודל פשוט אשר מבטל אינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים ומתמקד בהיבטים המכניים. יש להקפיד על תרגול מעבדה טוב ותנאי עבודה סטריליים.ואכן, אפילו זיהום קל של הידרוג'ל יכול להיות השפעה דרמטית על בידול megakaryocyte. כדי להשיג באר אחת של תרבית תאי הידרוג'ל, להתחיל על ידי הפשרת שני aliquots מיליליטר אחד של 3%methylcellulose בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לצפות מזרק מנעול לולר מיליליטר אחד עם methylcellulose על ידי משיכה תחילה מיליליטר אחד ולאחר מכן גירוש כל זה. לאחר מכן, באמצעות אותו מזרק ומחט, לצייר 333 microliters של methylcellulose מן aliquot טרי.לאחר הסרת המחט בזהירות, השתמש במלקחיים מעוקרים כדי לדפוק מחבר מנעול Luer על קצה המזרק, ולאחר מכן חבר מזרק מנעול לולר אחד לא מצופה שני למחבר. מחלקים באותה מידה את המתילסלוז בין שני המזרקים ומניחים אותם בצד. לאחר מכן, יש לתכנת מחדש את שושלת העכברים המבודדת בעבר גזע המטופויאטי שלילי ותאי אבות במדיום התרבות המרוכז בצפיפות של פעם אחת כפול 10 עד 6 תאים לכל 167 מיקרוליטרים.נתק את אחד המזרקים מהמחבר ואת פיפטה 167 מיקרוליטרים של מתלה התא ישירות לתוך המחבר ובו זמנית ציור בוכנה מזרק לאט כדי לפנות מקום מתלה התא. לאחר הוספת כל ההשעיה של התא לתוך המחבר, למשוך את הבוכנה עוד יותר כדי למשוך את המתלה מן המחבר בזהירות להתחבר מחדש את המזרק השני, תוך הקפדה לא לאבד כל השעיה בחוט הבורג. כדי להומוגניזציה של המדיום המתילצלולוז עם ההשעיה של התא, הזז לאט לאט את הבוכנה הלוך ושוב בין שני המזרקים 10 פעמים, ואז משוך את הנפח הכולל למזרק אחד וניתק את שני המזרקים, והותיר את המחבר על המזרק הריק.רוקנו את תכולת המזרק לבאר אחת של צלחת ארבע בארות ודגרו את הצלחת ב-37 מעלות מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני. כדי לנתח פרופלטלטים, ביום השלישי של התרבות, בזהירות להעביר את כל התאים מבאר אחת לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של DMEM עם 1%PSG. Resuspend התאים על ידי צנרת בעדינות כדי לדלל לחלוטין את methylcellulose, ולאחר מכן צנטריפוגה הצינור במשך חמש דקות ב 300 פעמים G בטמפרטורת החדר.לאחר השלכת supernatant, resuspend את גלולה התא במיליליטר אחד של מדיום תרבות מלאה ולזרוע מחדש את התאים ב 500 microliters לכל באר של צלחת ארבע באר. לדגור על הלוח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. למחרת, באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד עם מטרה של 20X, לרכוש באופן אקראי 10 תמונות לבאר, הקפדה לא להיות יותר מדי תאים בשדה הראייה ולוכד לפחות חמישה megakaryocytes לכל שדה.באמצעות ImageJ, לספור את המספר הכולל של megakaryocytes ואלה הרחבת proplatelets בכל תמונה כדי לחשב את החלק היחסי של מגהקריוציטים הרחבת פרופלטלטים. כדי לתקן את התאים עבור ניתוחים עתידיים, להוסיף את הפתרון הקיבוקטיבי על גבי methylcellulose מבלי לשבש את הג'ל. לאחר המתנה לזמן מתאים בהתאם לקיבוע המשמש, השתמש פיפטה P1000 כדי pipette בעדינות את הקיבוע ואת הג'ל עד methylcellulose כבר מדולל הומוגני.ובאמצעות אותו קצה פיפטה, העבירו את כל תכולת הבאר לצינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של DPBS והומוגניזציה על ידי ערבוב. צנטריפוגות התערובת. להשליך את supernatant ו resuspend גלולה megakaryocyte במדיום המתאים לניתוח הרצוי.ביום השלישי של התרבות, megakaryocytes במדיום הנוזלי יש משקעים בתחתית הבאר והם במגע עם משטח פלסטיק נוקשה, כמו גם תאים אחרים. לעומת זאת, תאים המוטמעים בהידרולג'ל מתילצלולוז מופצים באופן הומוגני ומבודדים מתאים סמוכים. ניתוח של הקוטר הממוצע של megakaryocytes בתנאי תרבות שונים מראה כי 2%methylcellulose מעט מגביר את קוטר megakaryocyte הממוצע לעומת התרבות הנוזלית.עם זאת, הגדלת ריכוז methylcellulose על ידי 0.5% פוגע בידול megakaryocyte כפי שצוין על ידי קוטר ממוצע קטן יותר. בתמונות מיקרוסקופיות אלקטרוניות שידור מייצגות, הממברנות intracytoplasmic במגקריוציטים המובחנים ב vivo בתוך מח העצם נראה מתנגדים באופן הדוק עם שטחים ציטופלסמיים מתווים. בתרבות נוזלית, הממברנות יש בעיקר מראה אליפסה עגול קטן או שלפוחיות מוארכות ללא תיחום של שטחים ציטופלסמיים.לעומת זאת, לתרבות המתיל צלולוז 2% יש ממברנות מנוגדות באופן הדוק עם טריטוריות ציטופלסמיות מופרדות הדומה למבנה in inu. ביום הרביעי של התרבות, megakaryocytes בעבר תרבית בהידרוגל להראות היווצרות proplatelet מוגברת לעומת אלה מתורבתים במדיום נוזלי. השיעור הממוצע של מקרוציטים הרחבת פרופלטלטים הוא בדרך כלל סביב 15 עד 20% עם טרום תרבות נוזלית לעומת 35 עד 40% עם מתילצלולוז הידרוג'ל טרום תרבות.בעת ניסיון הליך זה, חשוב pipette את הנפחים המתאימים בדיוק רב כמו שינוי מינורי בריכוז methylcellulose הסופי יכול לשנות באופן משמעותי את נוקשות התקשורת. לאחר התבגרות התא בהידרוג'ל, ניתן לשחזר מגהקריוציטים לניתוח סמן פלואידי ותא על ידי ציטומטריית זרימה או קבוע למיקרוסקופיית אלקטרונים או חיסונים של חלבון בעל עניין.

megakaryocyte-culture-3d-methylcellulose-based-hydrogel-to-improve

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים פרוטוקול להשיג מטריצות תאים שמקורם עשירות בחלבונים תאים מטריקס, באמצעות crowders macromolecular (MMC). בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול אשר משלב MMC בדור העור 3D organotypic שיתוף התרבות, אשר מקטין את זמן תרבות תוך שמירה לפדיון של מבנה.

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

זוהי שיטה ליצור פיגום תרבית תאים 3-ממדי תאי מטריקס ריאתי. ריאות שלמים מעובדות לתוך הידרוג שיכול לתמוך בצמיחה של תאים בשלושה ממדים.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של microcryogels אלסטית macroporous תלת-ממד על-ידי שילוב מיקרו-מלאכותית עם טכנולוגיית cryogelation. בעת טעינת עם תאים, נוצרים 3D microtissues, אשר יכול להיות מוזרק בקלות בתוך vivo כדי להקל על הטיפול משובי או לצרפן מערכים להקרנה תפוקה גבוהה סמים ' במבחנה .

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

במסמך זה, אנו מציגים עבור התרבות תלת-ממד של עכברוש פרוטוקול תאי המוח-derived עכשיו, דונלד, לרבות האסטרוציטים, מיקרוגלייה oligodendrocytes להפוך. נדגים התרבות התא הראשי, סינתזה הידרוג חומצה היאלורונית methacrylated (חמה), HAMAphoto-הפילמור ותא כימוס, דוגמת עיבוד עבור הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים קונאפוקלית של סריקה.

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מערכות 3D-תרבות בהרכבת פיגומים פפטיד כדי לקדם את הבידול של dedifferentiated chondrocytes במפרק האנושי לתוך רקמות הסחוס דמוי עצמי.

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

פרוטוקול מוצג להכין hydrogels אסיד פוליוויניל אלכוהול-co-itaconic עם נוקשות בדרגות שונות, אשר היו הושתל עם ובלי oligopeptides, לחקור את השפעת הנוקשות של biomaterials על בידול והתפשטות תאי גזע. הנוקשות של hydrogels היה בשליטת הזמן crosslinking.

התרבות תאי גזע Pluripotent אנושי על פוליויניל אלכוהול-Co-Itaconic Hydrogels חומצה עם קשיות שונות בתנאים קסנו-חופשית

Hydrogels מהונדסים חלבון רקומביננטי הן ממינוי תרבית תאים 3D הם מאפשרים tunability מלאה של עמוד השדרה פולימר ולכן, microenvironment את התא. כאן, אנו מתארים התהליך של היטהרות חלבון רקומביננטי כמו אלסטין ויישומו בחיי הידרוג 3D תא אנקפסולציה.

הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

במאמר זה, עלון מודפס תלת-ממדי שעוצב לאחרונה מוצג כמודל של תרבית משותפת ומאומת באמצעות המחקר של התקשורת הבין-תאית הפרקרינית בין תאי אנדותל וקרטינוציטים.

עלון חדשני המודפס בתלת-ממד ונועד לאפשר תרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות פשוטות

מודל במבחנה של נישה וסקולרית של מח העצם נקבע על ידי זריעת תאים מזנכימליים ואנדותל על הידרוג'ל PEG תלת-ממדי יצוק מראש. רשתות האנדותל, רכיבי ECM ופעילות ALP של הנישות משתנים בהתאם לגורם הגדילה בו נעשה שימוש. הפלטפורמה יכולה לשמש למודלים מתקדמים של סרטן.

הקמה פשוטה של נישת מח עצם אוסטאוגנית וסקולרית באמצעות הידרוג'לים פוליאתילן גליקול (PEG) יצוקים מראש במיקרו-צלחת הדמיה

פרוטוקול זה מתאר את ייצור מבני העצם התלת-ממדיים באמצעות אוסטאוציטים אנושיים המוטמעים בהידרוג'לים של ג'לטין מתקרילט (GelMA) בתוספת מטריצה חוץ-תאית מפורקת תאים. השיטה זולה, ניתנת להרחבה ותואמת לציוד מעבדה בסיסי, ומספקת פלטפורמה תרגומית לחקר תהליכי מחלות שריר-שלד.

פלטפורמת תרביות עצם תלת-ממדית המשתמשת באוסטאוציטים אנושיים ובמטריצה חוץ-תאית מנותקת למידול מחלות שריר-שלד

חקור תרבות מגהקריוציטים בהידרוג'ל מתילצלולוז תלת מימדי לחקירת השפעת נוקשות וכליאה על התבגרות תאים. השיטה מאפשרת חיקוי סביבת מח העצם ושיפור ייצור פרופלטלטים.

תרבות Megakaryocyte בהידרוג'ל מבוסס מתילצלולוז תלת מימדי לשיפור התבגרות התאים וחקר ההשפעה של נוקשות וכליאה

גלה סרטונים נוספים