Name: ב-Vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: למד הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר. שיטה זו מאפשרת מחקר בזמן אמת של ייצור טסיות דם ודינמיקת זרימת הדם בקרבת תנאים פיזיולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לפלוריאן גרטנר (המכון למדע וטכנולוגיה אוסטריה, קלוסטרניובורג, אוסטריה) על עצתו המומחית לניסויי מיקרוסקופיה דו-פוטונית בזמן שהקמנו את הטכניקה במעבדה, ולאיב לוץ במרכז ההדמיה IGBMC / CBI (אילקירך, צרפת) על מומחיותו ועזרתו במיקרוסקופ הדו-פוטון. אנו מודים גם לז'אן-איב רינקל על עזרתו הטכנית ולאינס גינארד על ציור הסכימה באיור 1. אנו מודים ל- ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) על תמיכתה ברכישת המיקרוסקופ הדו-פוטון. AB נתמך על ידי מלגות פוסט-דוקטורט מ- Etablissement Français du Sang (APR2016) ומ- Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

<ol><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+kinase+2+%28Sphk2%29+regulates+platelet+biogenesis+by+providing+intracellular+sphingosine+1-phosphate+%28S1P%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P).</a> Blood. 122 (5), 791-802 (2013).</li>
<li>Kowata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+demand+modulates+the+type+of+intravascular+protrusion+of+megakaryocytes+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow.</a> Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1alpha+induces+thrombopoiesis+through+megakaryocyte+rupture+in+response+to+acute+platelet+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs.</a> Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).</li>
<li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li>
<li>Potts, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+budding+is+a+major+mechanism+of+in+vivo+platelet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206(2020).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683(2014).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pf4-Cre+transgenic+mice+allow+the+generation+of+lineage-restricted+gene+knockouts+for+studying+megakaryocyte+and+platelet+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo.</a> Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).</li>
<li>Pertuy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broader+expression+of+the+mouse+platelet+factor+4-cre+transgene+beyond+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).</li>
<li>Calaminus, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+Pf4-Cre+marks+hematopoietic+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny.</a> PLoS One. 7 (12), 51361(2012).</li>
<li>Stegner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoiesis+is+spatially+regulated+by+the+bone+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 127(2017).</li>
<li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+suppresses+platelet+aggregation+possibly+by+suppressed+inositol+triphosphate+formation+and+subsequent+suppression+of+cytosolic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase.</a> Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).</li>
<li>Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+time-lapse+in+vivo+imaging+of+tibia+bone+marrow+to+visualize+dynamic+hematopoietic+stem+cell+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment.</a> Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).</li>
<li>Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window+chamber+model+for+in+vivo+cell+tracking+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Kim, J., Bixel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+the+bone+and+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment.</a> Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

המנגנונים של היווצרות טסיות דם תלויים מאוד בסביבת מח העצם. לפיכך, מיקרוסקופיה תוך-וינטלית הפכה לכלי חשוב בתחום כדי לדמיין את התהליך בזמן אמת. עכברים עם מגה-קריוציטים פלואורסצנטיים ניתן להשיג על ידי חציית עכברים המבטאים את Cre רקומבינאז במגקריוציטים עם כל עכברי כתב פלוקס המכילים קלטת ביטוי גן פלואורסצנטי מותנה. כאן, עכברי כתב mTmG שימשו (B6.129(Cg)-GT(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) חצו עם עכברי Pf4-cre11, המאפשר תיוג פלואורסצנטיות ירוק אינטנסיבי במגקריוציטים וטסיות דם<...

טסיות דם מיוצרות על ידי תאים מיוחדים megakaryocytes הממוקם במח העצם. הדרך המדויקת שבה מגהקריוציטים משחררים טסיות דם במחזור כבר מזמן לא ברורה בשל האתגר הטכני בהתבוננות באירועים בזמן אמת דרך העצם. מיקרוסקופיה דו-פוטונית סייעה להתגבר על אתגר זה והובילה להתקדמות משמעותית בהבנת תהליך היווצרות טסיות הדם. התצפיות הראשונות ב- vivo megakaryocyte נעשו על ידי פון אנדריאן ועמיתיו בשנת 2007, עם הדמיה של מגה-קריוציטים פלואורסצנטיים דרך הגולגולת1. זה היה אפשרי כי שכבת העצם בגולגולת הקדמית של עכברים צעירים יש עובי של כמה עשרות מיקרון והוא שקוף מספיק כדי לאפשר הדמיה של תאים פלואורסצנטיים במח העצם הבסיסי2.
מחקרים שלאחר מכן יישמו הליך זה כדי להעריך היווצרות proplatelet בתנאים שונים ולפענח את המנגנונים הבסיסיים3,4,5,6. מחקרים אלה סיפקו ראיות חותכות לכך שמקריוציטים מרחפים באופן דינמי בליטות, הנקראות מפיץ, דרך המחסום האנדיותל של כלי הסינוסואידים (איור 1). מרחיבים אלה משתחררים לאחר מכן כמו שברים ארוכים המייצגים כמה מאות טסיות בנפח. טסיות הדם ייווצרו לאחר שיפוץ של ההתפשטות במיקרו-מחזור של איברים במורד הזרם, במיוחד בריאות7. עם זאת, עד כה, התהליך המדויק והמנגנונים המולקולריים עדיין נתונים לדיון. לדוגמה, התפקיד המוצע של חלבונים שלד ציטו בהארכת פרופלטלטים שונה בין במבחנה לבין in vivo תנאים3, והבדלים בהיווצרות פרופלטלט הוכחו בתנאים דלקתיים6. מסבך את הדברים עוד יותר, מחקר שנערך לאחרונה ערער על הרעיון מונע פרופלטלט והציע כי ב vivo, טסיות נוצרות למעשה באמצעות מנגנון ניצני ממברנה ברמה megakaryocyte8.
מאמר זה מציג פרוטוקול לתצפית של megakaryocytes ו proplatelets במח העצם מעצם הגולגולת בעכברים חיים, באמצעות הליך זעיר פולשני. גישות דומות תוארו בעבר כדי לדמיין תאי מח עצם אחרים, במיוחד גזע hematopoietic ותאי אבות9. ההתמקדות כאן היא על תצפית של megakaryocytes וטסיות כדי לפרט כמה פרמטרים שניתן למדוד, במיוחד מורפולוגיות proplate ומהירות טסיות דם. פרוטוקול זה מציג כיצד להכניס קטטר לתוך הווריד הצווארי כדי להזריק מעקבים פלואורסצנטיים וסמים ולהתבונן דרך עצם הגולגולת. עצם השוק חשוף באמצעות ניתוח קטין, כך טבעת מודבקת לעצם. טבעת זו משמשת כדי לשתק את הראש ולמנוע תנועות עקב נשימה וליצור מלאה מלוחים כאמצעי טבילה של העדשה. טכניקה זו מתאימה היטב i) להתבונן בזמן אמת גיאומטריה סינוסואידי megakaryocytes אינטראקציה עם קיר כלי; ii) לעקוב אחר megakaryocytes בתהליך של היווצרות proplatelet, התארכות, ושחרור; ו- iii) למדוד תנועות טסיות דם כדי לפקח על זרימת הדם הסינוסואידית המורכבת. נתונים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה פורסמו לאחרונה3.

<table><tbody><tr><td>GNU Octave</td><td>תוכנה פרויקט</td><td></td> גנו <td>https://www.gnu.org/software/octave/</td></tr><tr><td>&nbsp; היסטואקריל 5 x 0, 5 מ"ל</td><td>בראון</td><td>1050052</td><td>תמיסה להזרקה של דבק כירורגי</td></tr><tr><td>גלאים היברידיים HyD Leica Microsystems 4tunes</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ImageJ פרויקט</td><td></td> GNU <td>גרסה מינימלית נדרשת</td></tr><tr><td>Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL</td><td>Boehring</td><td>03661103003199</td><td>הגנה על</td></tr> <tr><td>העינייםמיקרוסקופ צלילה Leica SP8 MP מצויד במטרת מים של 25x, צמצם מספרי של עירור סימולטני של 0.95</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>של AlexaFluor-488 ו-Qtracker-655</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Ocrygel 10 g</td><td>Laboratoires T.V.M.</td><td>03700454505621</td><td>משחת שיניים סיליקון כחול וצהוב</td></tr><tr><td>Picodent twinsin מהירות</td><td>Rotec</td><td>13001002</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 655 תווית כלי דם</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>תמיסה להזרקה</td></tr><tr><td>סורק תהודה, 8 או 12 קילו-הרץ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun Xylazine 2% fl/25 mL</td><td>Bayer</td><td>04007221032311</td><td></td></tr><tr><td>Superglue gel</td><td></td><td></td><td>להדבקת הטבעת לעצם</td></tr><tr><td>קטטר Surflo IV - כחול 22 G</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225C1</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Saph פועם לייזר (קוהרנטי) (פמטו-שנייה)</td> <td>קוהרנטי</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ב-vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

טסיות מיוצרות על ידי megakaryocytes, תאים מיוחדים הממוקמים במח העצם. האפשרות לדמיין megakaryocytes בזמן אמת ואת הסביבה הטבעית שלהם תוארה לפני יותר מ -10 שנים ושופכת אור חדש על תהליך היווצרות טסיות הדם. Megakaryocytes להאריך בליטות מוארכות, הנקראות proplatelets, דרך רירית אנדותל של כלי סינוסואיד. מאמר זה מציג פרוטוקול לתמונה בו זמנית בזמן אמת שכותרתו מגהקריוציטים במח העצם של הגולגולת ובכלי הסינוסואידים. טכניקה זו מסתמכת על ניתוח קטן השומר על הגולגולת שלמה כדי להגביל את התגובות הדלקתיות. ראש העכבר משותק עם טבעת המודבקת לגולגולת כדי למנוע מתנועות לנשום.
באמצעות מיקרוסקופיה דו פוטונית, ניתן לדמיין מגהקריוציטים עד כמה שעות, ומאפשר תצפית של בליטות תאים והתפשטות בתהליך התארכות בתוך כלי הסינוסואידים. זה מאפשר כימות של מספר פרמטרים הקשורים למורפולוגיה של בליטות (רוחב, אורך, נוכחות של אזורי התכווצות) והתנהגות התארכותם (מהירות, סדירות או נוכחות של הפסקות או שלבי נסיגה). טכניקה זו מאפשרת גם הקלטה סימולטנית של טסיות דם במחזור בכלי הסינוסואידים כדי לקבוע את מהירות טסיות הדם ואת כיוון זרימת הדם. שיטה זו שימושית במיוחד כדי לחקור את תפקידם של גנים מעניינים בהיווצרות טסיות דם באמצעות עכברים מהונדסים גנטית והיא גם נוחה לבדיקות פרמקולוגיות (חקר המנגנונים, הערכת תרופות בטיפול בהפרעות ייצור טסיות דם). זה הפך להיות כלי לא יסולא בפז, במיוחד כדי להשלים את המחקרים במבחנה כפי שהוא ידוע כיום כי היווצרות vivo ו אין ויטרו proplatelet להסתמך על מנגנונים שונים. הוכח, למשל, כי מיקרוטובולות במבחנה נדרשות להתארכות פרופלטלט כשלעצמה. עם זאת, ב vivo, הם מעדיפים לשמש פיגום, התארכות להיות מקודם בעיקר על ידי כוחות זרימת הדם.

באמצעות פרוטוקול זה, נותב הפלואורסצנטי, Qtracker-655, נוהל תוך ורידי כדי לדמיין כלי סינוס מוח anastomosed במח העצם הגולגולת ואת כיוון הזרימה כפי שמתואר על ידי החצים (איור 4A,משמאל). באמצעות עכברי mTmG, טסיות דם פלואורסצנטיות eGFP נרשמו מעל 20 s בכל ענף כלי, ומהירותם נמדדה באמצעות תוכנת ImageJ ו- GNU Octave(איור 4A,מימין). שימו לב להטרוגניות במהירות הזרימה ובכיוון. כלי סינוסטרואידים מציגים זרמים מורכבים עקב anastomoses, עם נוכחות של זרימת זרימה מחדש ואפילו קיפאון...

אנו מתארים כאן את השיטה להדמיית מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם הגולגולתית של עכברים חיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.

ב-Vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

שיטה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של אירועים שונים, המתרחשים במח העצם של עכבר הגולגולת, כגון megakaryocytes, הרחבת פרופלטלטים בתוך כלי הסינוסואידים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ניתוח קטין הדרוש למזעור התגובה הדלקתית, המאפשר הדמיה in vivo של אירועים בתנאי המפעל כמעט. כדי להתחיל, להעביר את העכבר לחדר ההדמיה.הפעל את המיקרוסקופ והמחשב והגדר את הפרמטרים הנדרשים. לאחר העכבר יש לגמרי esthetized למקם את העכבר על צלחת מחוממת, מחומם ל 37 מעלות צלזיוס עבור כל המניפולציות הבאות, לגלח את הראש והגרון של העכבר ולהחיל את הג'ל על העיניים כדי למנוע יובש. מניחים את העכבר על גבו ומתקנים את הרגליים האחוריות עם סרט ניתוחי כדי למתוח את הגרון.לאחר חיטוי הגרון, לעשות 0.7 עד 1 ס"מ חתכו על וריד הצוואר ימין או שמאל באמצעות מספריים ולמתוח את רקמת החיבור הסמוכה כדי לחשוף את וריד להטוטן החיצוני על גבי שריר החזה. ממלאים את הצנתר עם תמיסת מלח פיזיולוגית חמה וסטרילית. לחדור את הצנתר דרך שריר החזה ולאחר מכן להכניס את הקטטר לתוך הווריד.הסר בעדינות את המחט, חבר את המזרק עם העוקבים הפלואורסצנטיים והזריק את הנפח המת של הצנתר. מניחים טיפה של דבק כירורגי כדי לייצב את הקטטר. החזר בזהירות את העכבר לעמדה נוטה.לחטא את הקרקפת עם 70% אתנול עם מגבת נייר תוך הסרת השיער הרפוי. השתמש מספריים דקים סטריליים פינצטה כדי להפוך חתכים בצורת T בקו האמצע עד סנטימטר אחד בין האוזניים על הקרקפת כדי לחשוף את calvarium. לחשוף את הגולגולת עם פינצטה, ולאחר מכן להשתמש במספריים ופינצטה כדי להסיר בזהירות את periosteum.השתמש ספוגית כותנה סטרילית ספוגה תמיסת מלח פיזיולוגית כדי להסיר את כל periosteum וכל פסולת או שיער אשר יכול לשנות את ההדמיה. לשטוף את הגולגולת עם מלוחים כדי להסיר כל עקבות דם ולייבש במהירות את העצם עם צמר גפן. החל את ג'ל הדבק על הטבעת, מניחים את הטבעת על העצם החשופה ושומרים עליה במשך כמה שניות כדי לאפשר לטבעת להיצמד בחוזקה לגולגולת.להלח קלות את הגולגולת עם צמר גפן מלוח. הכן את הדבק הדנטלי סיליקון על ידי ערבוב זהיר של הרכיבים הכחולים והצהובים ביחס של אחד לאחד. לאטום את הטבעת על ידי החלת הדבק הדנטלי כדי למנוע דליפה במהלך הדמיה.הסר בזהירות כל הדבק שיניים או דבק שאולי נכנס לטבעת. ואז למלא את הטבעת עם תמיסת מלח כדי לבדוק את הדליפה. מניחים את העכבר על התמיכה ומניחים דחיסה מקופלת מתחת לראש החיה כדי להרים את הראש ולמנוע ניתוק של הטבעת מהגולגולת כאשר הוא מחובר למחזיק.לעזאזל עם הטבעת על מחזיק הבלוק. מקם את התמיכה ואת הרכבת העכבר בתא המיקרוסקופ המחומם. הגדר את אורכי הגל לייזר המתאימים לארבע הרביעיות שנבחרו והתאוששות של האורות הנפלטים.באמצעות קטטר להטוטנים בין להטוטנים להזריק 50 microliters של 0.2 פתרון micromolar של נותב פלורסנט לתייג את כלי ההדבקה. מקם את שלב המיקרוסקופ עם התמיכה והעכבר תחת מטרת המיקרוסקופ. ודא כי הטבעת תמיד מלאה מלוחים ולמלא אותו במידת הצורך, ולטבול את המטרה מלוחה.השתמש באפיפלואורסצנטיות כדי לאתר את כלי מח העצם ולהתבונן במגקריוציטים מיושרים לאורך כלי הסינוסואידים. לרכישות ארוכות, הגדירו רכישה תלת-ממדית של מרחב-זמן עם תמונה של 384 על 384 פיקסלים באמצעות סורק תהודה של שמונה קילו הרץ ומצב דו-כיווני. השתמש בממוצע שורה ברזולוציה טובה ולאחר מכן בחר את גודל שלב Z הממוטב והגדר את מרווח הזמן הדרוש לפני תחילת הרכישה.עבור רכישות קצרות ומהירות, בחר מרחב, סוג רכישת זמן ומזער את גודל התמונה. במידת הצורך, התאם את התמונה לכלי השיט על-ידי סיבוב שדה ההדמיה. השתמש במהירות הסריקה הזמינה הגבוהה ביותר ובסרייקה דו-כיוונית.מזער את הקו בממוצע כדי למצוא את הפשרה האופטימלית בין הגדרת תמונה ומהירות הרכישה. לרכוש תוכנית Z אחת בלבד ולמזער את מרווח הזמן לרכישה. למדידת מהירות טסיות הדם 10 עד 20 שניות של רכישה צריך להיות מספיק.נותב הפלואורסצנטי נוהל תוך ורידי כדי לדמיין את כלי הסינוסואידים של מח העצם בגולגולת, עם כיוון הזרימה המתואר על ידי החץ. מהירות טסיות הדם הפלואורסצנטית נרשמה בכל ענף כלי שיט, ונצפתה שונות. כלי הסינוסואיד מציגים זרמים מורכבים עקב האנסטומיוזים, עם נוכחות של זרימת זרימה ואפילו קיפאון.החצים הצביעו על כיוון הזרימה ההפוך בהיפוריקט. מהירות טסיות הדם נמדדה גם עבור ענפי כלי דם שמאליים וימנים הצביעו על אי סדירות לאורך זמן בכל ענף כלי שיט עם שלבי תאוצה, קיפאון והאטה. מורפולוגיות שונות של פרופלטלטים נצפו, כולל מפיץ עם שוליים לא סדירים, ואז en מרחיבים ארוכים ו proplatelets עבה וקצר.כאשר megakaryocytes הרחיב את הנפצים באזורים של זרימות מורכבות, ההתפשטות הוזרמה מענף כלי אחד לשני, בהתאם לכיוון הזרימה. עם עצירת זרימת הדם, הנפיצים נרגעו והעכבר עבר דום לב באופן בלתי צפוי, הצביע על החשיבות של כוחות הידרודינמיים בהארכת ההרחבה. הרוחב והאורך של המפיץ נמדדו גם ברוחב ממוצע של 5.2 מיקרומטר ואורך מקסימלי ממוצע של כ 185 מיקרומטר נצפו.התוויית אורך ההתפשטות כפונקציה של הזמן מאפשרת הדמיה של ההתנהגות של מפיץ במהלך שלבי התארכות, קיפאון, או אפילו נסיגה. מהירות התארכות ממוצעת של כ -10 מיקרומטר לדקה נצפתה. התקנת הצנתר, אפשרה הזרקת תרופות כדי לחקור את ההשפעות על היווצרות proplatelet או אירועים אחרים של עניין בזמן אמת.

in-vivo-two-photon-imaging-megakaryocytes-proplatelets-mouse-skull

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מתארים הליך כירורגי להשתלת מכלול טבעת גולגולת על עצם הגולגולת החשופה ולשתק עוד יותר את ראש העכבר לצורך דימות מוחי ברזולוציה גבוהה למשך זמן רב.

התקנת מכלול טבעת גולגולת במודל עכבר: הליך כירורגי להשתלת הרכבת חלון הדמיה על גולגולת מורין להדמיית מח עצם גולגולת ברזולוציה גבוהה

הדמיית זמן-lapse בבעל חיים חי מספקת מידע רב ערך על ארגון מחדש מבני במוח השלם. כאן, אנו מציגים תכשיר גולגולת דק המאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית של מבנים סינפטיים בעלי תווית פלואורסצנטית בקליפת העכבר החי על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

הטבע של האינטראקציות בין תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) ונישות מח עצם הוא הבין היטב. שינויי חומרה מותאם אישית ופרוטוקול רכישה רב שלבים לאפשר את השימוש בשני הפוטונים ומיקרוסקופיה confocal לתמונת vivo לשעבר HSPCs שכותרתו התביית בתוך אזורי מוח עצם, אינטראקציות מעקב ותנועה.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

מונוציטים הם מווסתים מרכזיים של חסינות מולדת וממלאים תפקיד קריטי בחידוש המערכת הפגוציטית החד-גרעינית ההיקפית ובמקרה של דלקת. כתב יד זה מתאר את הליך ההדמיה בזמן אמת של מח העצם של קלווריה של העכבר כדי לחקור את מנגנון הגיוס של המונוציטים.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

אנו מפרטים פרוטוקול לניטור התנהגותם של נויטרופילים ומונוציטים בוורידים מזנטריים במצב יציב ובתנאים דלקתיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-חיונית בעכברים מורדמים.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

הפרוטוקול מתאר מודל חדש של תא חלון עצם הירך של עכברים שניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תנועת תאים במח עצם הירך in vivo. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רב-פוטונית תוך-חיונית משמשת להדמיית שלושה מרכיבים של מח עצם הירך (כלי דם, מטריצת קולגן ונויטרופילים) לאורך זמן.

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; In vivo</em&gt; מעקב תא Murine מח עצם

מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח אולטרה מבנה של megakaryocytes במקום באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM). מח עצם מורין נאספים, קבועים, מוטבעים בשרף אפוקסי וחתוכים בחלקים אולטרה-דקים. לאחר כתמי ניגודיות, מוח העצם נצפה תחת מיקרוסקופ TEM ב 120 kV.

בסיטו חקר מורין Megakaryopoiesis באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

כאן, אנו מפרטים את שיטת הסבר מח העצם, מהכנת מדגם לניתוח שקופיות מיקרוסקופי, כדי להעריך את היכולת של מגהקריוציטים אשר הבדילו בסביבה הפיזיולוגית שלהם כדי ליצור מפיץ.

דינמיקת היווצרות Proplatelet של מסלקי מח עצם טריים של עכבר

מיקרוסקופיה תוך-ויטלית מאפשרת לחקור תהליכים ביולוגיים דינמיים כגון התחדשות רקמות והתפתחות גידולים. מח העצם הגולריאלי, רקמה דינמית ביותר, מציע תובנות לגבי המטופואיזיס ותפקוד כלי הדם. שימוש בשתל קיבוע ראש מודפס בתלת מימד תואם ביולוגית מאפשר הדמיה אורכית חוזרת, ומשפר את ההבנה שלנו לגבי דינמיקת הרקמות ומיקרו-סביבת הגידול.

הדמיה אורכית תוך-חיונית של דינמיקת כלי הדם במח העצם הגולגולתי

למד הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר. שיטה זו מאפשרת מחקר בזמן אמת של ייצור טסיות דם ודינמיקת זרימת הדם בקרבת תנאים פיזיולוגיים.

ב-Vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר

גלה סרטונים נוספים