הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן mGFPHis תג כפול, לספק שיטה חסכונית, מהירה, אמינה, וקל לאפיין חלבונים ממברנה באורגניזם מודל אאוקריוטי, Saccharomyces cerevisiae. היתרון הגדול ביותר של טכנולוגיה זו הוא הקלות והמהירות שבהן ניתן לקבוע את רמות ביטוי החלבון הממברנה, את פעילות ה- ATP ואת חומר הניקוי המתאים ביותר לטיהור שלהם. טכנולוגיה זו ידידותית מאוד למשתמש.

עם זאת, נקודה חשובה אחת לזכור היא לקצור תאים כמו OD 600 של 2, אשר מבטיח זיהום מיטוכונדריאלי נמוך ואת הפעילויות ATPase הגבוה ביותר האפשרי. התחל על ידי טרום פולחן מושבת שמרים אחת ב 10 מיליליטר של YPD בינוני ב 30 מעלות צלזיוס במשך שבע עד שמונה שעות ב 200 סיבובים לדקה. השתמש 10 מיליליטר של תרבות מראש כדי לחסן 40 מיליליטר של מדיום YPD טרי.

ואז לדגור על התאים ב 30 מעלות צלזיוס לילה ב 200 סיבובים לדקה עד צפיפות התא מגיע OD 600 של אחד עד שלושה. ביום שלמחרת קציר 40 יחידות צפיפות אופטית, או ODU, של תאי פנים לוגריתמיים על ידי צנטריפוגה ב 4, 200 פעמים G לחמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשעות ולשטוף תאים עם 40 מיליליטר של מים סטריליים קרים כקרח מזוקקים כפולים.

חזור על הכביסה באמצעות מיליליטר אחד של מים קרים כקרח עם צנטריפוגליזציה בין שלבי הכביסה. להשעות מחדש את הכדור במיליליטר אחד של מים סטריליים קרים כקרח ולהעביר את השעיית התא לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר מקורר מראש על קרח. תאי קציר ב 3, 300 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

שאפו את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה התא ב 500 microliters של חוצץ הומוגניזציה טרי בתוספת אחד מילימולר פנאל מתיל סולפה ניל פלואוריד, או PMSF. יש לאחסן את מתלה התא במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. להפשיר את התאים על קרח במשך כשעה אחת.

לאחר מכן להוסיף קר כקרח 0.5 מילימטר קוטר חרוזים סיליקה 500 microliters של השעיית התא כדי להגיע לנפח כולל של מיליליטר אחד. כדי לשבור את התאים, מערבולת את השעיית התא בעוצמה רועדת מקסימלית במשך דקה אחת, במשך שישה מחזורים, עם תקופת קירור של שלוש דקות על קרח לאחר כל מחזור. לאחר מערבולת, לעשות חור דק בתחתית הצינור עם להב אזמל מחומם ולאסוף את התא השבור הומוגנט לתוך עוד צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר מיקרו עם ספין במהירות נמוכה במשך 10 שניות.

צנטריפוגה התא שנאסף הומוגנט ב 5, 156 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאים. העבר 450 מיקרוליטרים של supernatant לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר קר כקרח ולהוסיף מיליליטר אחד של חוצץ הומוגניזציה קר כקרח בתוספת PMSF טרי מילימולר אחד. כדי לקצור קרום פלזמה צנטריפוגה השעיית התא ב 17, 968 פעמים G במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את supernatant ולהוסיף 100 microliters של חוצץ הומוגניזציה טרי בתוספת PMSF מילימולרי אחד. ואז לשחרר את גלולה קרום פלזמה על ידי ערבוב עם קצה פיפטה 100 microliter ולהשעות מחדש את הכדור על ידי צינור חוזר למעלה ולמטה. מדוד את ריכוז החלבון של הכנת קרום הפלזמה עם ערכת בדיקת חלבון התואמת למאגרים המכילים את חומר ההפחתה וחומר הניקוי.

לאחסן את ממברנות הפלזמה במינוס 80 מעלות צלזיוס, או לשמור אותם על קרח לשימוש מיידי. יוצקים ארבעה עד חמישה מיליליטר של ג'ל הפרדה לתוך מנגנון הג'ל המורכב עד שני סנטימטרים מלמעלה. שכבה בזהירות אחת עד שתי מיליליטר של 0.1%SDS על גבי ולאפשר ג'ל אקרילאמיד פולי להגדיר במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר שעה להסיר את שכבת 0.1%SDS מן ג'ל הפרדה פולימרית ולשטוף את הג'ל עם מים מזוקקים כפולים כדי להסיר עקבות של SDS. יוצקים את תערובת ג'ל הערימה על ג'ל ההפרדה. מניחים מסרק לתוך ג'ל הערימה ולהסיר את כל בועות האוויר מסביב מסרק.

לאחר מכן אפשר ג'ל לערום להגדיר במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את המסרק ולאחר מכן לשטוף את חריצי ג'ל עם מים. שים את הג'ל לתוך מיכל הג'ל ולמלא את מיכל הג'ל למעלה עם חוצץ פועל.

מערבבים בין 5 ל-10 מיקרוליטרים של דגימות קרום פלזמה בנפחים שווים של פי שניים צבע טעינת חלבונים ומיד מעמיסים את תערובת הדגימה לחריצי ג'ל בודדים, שקועים במאגר ריצה. טען סמני משקל מולקולריים של חלבון בטווח שבין 10 ל-245 קילודלטון לחריץ נפרד כדי לאפשר הערכת גודל של שברי חלבון בודדים. בצע אלקטרופורזה ג'ל ב 200 וולט עד צבע הטעינה הכחול מגיע לתחתית הג'ל.

בדוק את הג'ל עבור פלואורסצנטיות GFP in-gel עם מערכת הדמיה ג'ל. בעקבות הדמיה פלואורסצנטית לתקן חלבונים ב 10 עד 20 מיליליטר של פתרון תיקון ג'ל חלבון על ידי עצבנות עדינה של הג'ל במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף את פעמיים במשך 10 דקות עם 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ומניחים את הג'ל ב 10 מיליליטר של פתרון כתם קומסי קולואידי עם רועד עדין במשך שעה בטמפרטורת החדר כדי לדמיין רצועות חלבון.

להדמיה משופרת של רצועות חלבון, יש להכתים את הג'ל פעם או פעמיים ב-20 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים למשך שעה אחת לפני הקלטת תמונות עם מערכת הדמיית הג'ל. תדירות גבוהה של טרנספורמציה של Saccharomyces cerevisiae דלתא דלתא D הושגה עם שליטה חיובית plasmid PS2. לא הושגו טרנספורמטים של יורוסל פרוטרונים עבור השליטה השלילית.

כ-50 תאי URA פרוטוטרופים CDR1-mGFPHis transformant הושגו לאחר הדגירה של תאי דלתא של דלתא של AD שעברו טרנספורמציה ב-CSM פחות לוחות URA במשך שלושה ימים. טרנספורמטנט קטן שלא יכול לגדול על לוחות אגר YPG בוטלו. דגימות CDR1-mGHPHis בריכוזים שונים היו כימותו עם פלואורסצנטיות בג'ל.

עוצמות הפלואורסצנטיות של mGFP היו ליניאריות לאורך כל טווח הריכוז עם פלואורסצנטיות רקע מינימלית. שינוי צפיפות התאים הצביע על כך שבירת 40 ODU של תאים הניבה את האיכות הגבוהה ביותר של קרום פלזמה עם פעילות ATPase CDR1 הגבוהה ביותר. עם זאת, התשואה של קרום הפלזמה גדלה ביחס להגדלת צפיפות התאים.

היכולת של 31 חומרי ניקוי עם תכונות שונות כדי solubilize CDR1-mGHPHis ממברנות פלזמה גולמית של דלתא AD דלתא, CDR1-mGHPHis תאים נבדקו עם דף SDS. בטא ואלפא DDM ופוס-כולין 13 היו חומרי הניקוי הטובים ביותר כדי solubilize CDR1-mGHPHis. עם זאת, פוס-כולין 13 לגרום הידרוליזה חלקית של CDR1-mGHPHis.

חלבון קרום פלזמה גולמי solubilized עם 1%דטרגנט הופרד באמצעות superos שש גדל 10 300 GL גודל אי הכללה עמודה. כרומטוגרמה של מלטוזידים וחלבונים המופקים על ידי LMNG הראו שרוב CDR1-mGHPHis חמקו כשיא גאוסי בצורת יפה ב 15.5 מילימטר CDR1-mGHPHis solubilized עם גלוקוז המכיל חומרי ניקוי נרמז כמו פסגה מצטברת או רחבה. הפסגות הגבוהות יותר עבור DDM הצביעו על כך שחלק גדול של DMN G solubilized CDR1-mGHPHis עשוי להיות denatured.

בכרומטוגרמה FSCC עבור zwitterionic Fos-כולינים ושני חומרי ניקוי לא יוניים רק Digitonin ונתן כרומטוגרמה דומה ל- DDM. Fos-choline 13 נתן שיא בצורת חד סימטרית, אבל זה רמז עם נפח חמקמקה נמוך משמעותית מזה עבור DDM. התג הכפול הממוטב גם משפר את תפוקת הטיהור ועזר לקבוע את הלוקליזציה, הסחר והיציבות התרמית של חלבוני הממברנה.

טכנולוגיית הביטוי ההטרולוגית יכולה לשמש גם בהקרנת סמים בתפוקה גבוהה, ובאפיון מפורט של חלבונים רבים אחרים.