חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה
June 8th, 2021
מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור אלקטרופורזה מבוססת אלקטרופורזה נימית מימן / דיוטריום חילופי (HDX) גישה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. גישה זו מאפיינת את ההבדל במבנים מסדר גבוה יותר בין מיני חלבונים שונים, כולל חלבונים במצבים שונים ופרוטאופורמים שונים, על ידי ביצוע HDX דיפרנציאלי בו זמנית והפרדה אלקטרופורטית.
שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיני חלבונים דו-קיום, כולל קונפורמיסטים או וריאנטים שונים ואפיון מקוון של הבדלי מבנה הסדר הגבוה שלהם כדי להשלים במדידת CEMS אחת. הוא משתמש באפקט האלקטרופורטי כדי לספק סביבה של כמעט 100% עבור תגובות HDX והפרדה אורתוגונלית של מיני החלבון הדו-קיום במהלך HDX לניתוח טרשת נפוצה מלמעלה למטה. התחל עם תנאים מוקדמים של אלקטרופורזה נימית, חילופי דיטריום מימן או הגדרת CE HDX.
באמצעות ultrasonication בתערובת של 50% מתנול, 49% מים ו 1% חומצה פורמית, לנקות את הזרימה באמצעות ממשק CE-MS מיקרוביאלי לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. הר את הנימים המותאמים של HPC על אלקטרופרזיס נימי או מכשיר CE. לשטוף את הנימים עם פתרון אלקטרוליטים ברקע או BGE במשך 10 דקות באמצעות סמפלר אוטומטי ולהשאיר אותו מלא עם BGE.
השתמש באורך מתאים של צינורות נימי סיליקה מותכים ללא שינוי כמו צינורות עירוי לפתרון צירוף. השתמש איחוד ושרוול מתאים כדי לחבר את צינורות מכפיל למזרק זכוכית הדוק גז עם טמפרטורת קהה ולשטוף את הצינורות עם פתרון מכפיל במשך 10 דקות לפחות באמצעות משאבת עירוי. הכנס את השקעים של צינורות CE-MS מקודדים של HPC שנטענו עם הפתרונות המתאימים לממשק CE-MS המנוקה.
לקדם את המזרק עם משאבות עירוי כך פתרון צירוף מגיע לקצה הממשק. הר את ממשק CE-MS המורכב על מקור יינון תרסיס ננו אלקטרונים דיור של ספקטרומטר מסה. החל מתח ריסוס של 3-5 קילו-וולט על ממשק CE-MS.
החדירו את פתרון הצירוף למשאבת האינפוזיה בקצב זרימה הנע בין 0.1-10 מיקרוליטרים לדקה והבטיחו תרסיס אלקטרו יציב בקצה ממשק CE-MS. מקם את בקבוקון המדגם המכיל את BGE ואת המדגם האוטומטי, אשר ישמש מאוחר יותר כדי לרכוש אלקטרופרוגרמה ריקה ספקטרום מסה ריקה. להעריך את נפח ההזרקה באמצעות הקשר בין נפח הזרקה ופרמטרים הזרקה.
ולהזריק את הפתרון לדוגמה באמצעות סמפלר אוטומטי בשני PSI למשך זמן מתאים. התחל את הפרדת CE על ידי החלת מתח אלקטרופורטי של 20 קילו-וולט בלחץ עירוי הנע בין 0-2 PSI ולרכוש את האלקטרופרוגרמה. בינתיים, לרכוש את נתוני MS במצב כרומטוגרפי שבו הגרף הנוכחי יון נרכש כפונקציה של זמן וסריקות MS המתאימות אינן משולבות באופן אוטומטי לספקטרום יחיד.
שמור את האלקטרופרוגרמה הריקה ואת ספקטרום המסה כהפניות. הניחו את הבקבוקונים לדוגמה המכילים את הריכוזים הרצויים של פתרונות דגימת החלבון בסמפלר האוטומטי ורכשו את האלקטרופרוגרמה ואת הספקטרום MS1 של מיני החלבון המופרדים אלקטרופורטית ודיאוטריום. בצע מדידות Ms.measurements דו-מושביות עבור מינים של עניין, או לאחר רכישת ספקטרום MS1 בתוך אותה ריצה או בריצה נפרדת עוקבת.
לאחר כל מדידה, לשטוף את הנימים עם BGE בלחץ של 20 PSI במשך 10 דקות לפחות. נקו את ממשק CEMS ואת כל הצינורות לאחסון עם השלמת הניסויים. השג ערכת נתונים של דגימת נקודת הקצה HDX עם MS במצב עירוי ישיר.
לחץ עירוי נמוך הביא להפרדה טובה יותר של פסגות CE, אך הוביל לעלייה הן בזמן ההגירה והן במשך הניסוי. זמן תגובה ארוך יותר של HDX הביא לרמה גבוהה יותר של הסתה של ניתוחי החלבון. השונות A ו- B של אימונוגלובולין בטא או בטא IG, אשר נבדלים על ידי רק שתי שאריות חומצת אמינו ברצף שלהם, הולידה שתי פסגות מופרדות כראוי אלקטרופרוגרמה נגזרת EIC.
הדיאוטריום הדיפרנציאלי שכותרתו שונות הביאה לחלוקת מסה ברורה של יונים. מספר נמוך יותר בשפע יחסי של יוני Z מאשר יוני C נצפתה עקב הצמדה dysofied ייחודי באישור של בטא IG המגבילים את יעילות הפיצול בין CS 82 ו CS 176. רוב יוני השברים המיוצרים מביתא IGA, ובטא IGB מציגים מידה דומה של ספיגת דיטריום.
עם זאת, המקטעים הגדולים יותר המכסים את אתרי וריאציית הרצף מביתא IGA הופחתו במידה רבה יותר באופן משמעותי מאשר בטא IGB. ה- pH של BGE מותאם על פי הנקודה האיזואלקטרית של המדגם כדי למנוע הצטברות חלבון ולהקל על ההפרדה תוך שמירה על המתחם.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מתאר שיטת החלפת מימן/דאוטריום (HDX) מבוססת אלקטרופורזה בנימית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. היא מאפשרת אפיון של הבדלים מבניים מסדר גבוה בין מיני חלבון שונים, כולל מצבים ופרוטאופורמים שונים, באמצעות HDX דיפרנציאלי בו זמנית והפרדה אלקטרופורטית.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- ביוכימיה
- ספקטרומטריית מסה
- כימיה של חלבונים
רקע
- אלקטרופורזה בנימית (CE) היא טכניקה חזקה להפרדת ביומוולקולות.
- החלפת מימן/דאוטריום (HDX) מספקת תובנות לגבי הדינמיקה והמבנה של חלבונים.
- ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה מאפשרת ניתוח של חלבונים שלמים והשונות שלהם.
- שיטה זו יכולה לנתח קונפורמציות חלבונים מרובות במדידה אחת.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לניתוח מבנים מסדר גבוה של חלבונים.
- להקל על הפרדת מיני חלבונים קיימים.
- לשפר את היעילות של מדידות HDX באמצעות הפרדה אלקטרופורטית.
שיטות בשימוש
- מיזוג התקן האלקטרופורזה הבנימית.
- אולטרסאונד של ממשק ה-CE-MS בתערובת מתנול-מים-חומצה פורמית.
- שטיפת הנימה בתמיסת אלקטרוליט רקע.
- ביצוע תגובות HDX בסביבה מבוקרת במהלך אלקטרופורזה.
תוצאות עיקריות
- הפרדה מוצלחת של קונפורמציות חלבונים שונות.
- אפיון של הבדלים מבניים במדידת CEMS אחת.
- הוכחת יעילות השיטה לניתוח מקוון.
- תובנות לגבי הדינמיקה של מיני חלבונים.
מסקנות
- שיטת ה-CE HDX יעילה לחקר מבנה חלבונים.
- גישה זו יכולה להיות מיושמת על מיני חלבונים ומצבים שונים.
- היא מציעה תהליך יעיל לניתוח הדינמיקה של חלבונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Resolving conformational heterogeneity of protein therapeutics remains a critical challenge in biopharma R&D, particularly for characterizing higher-order structures and dynamics of coexisting protein states. This capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (CE-HDX) method enables conformer-specific analysis of protein structural differences in a single measurement, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By integrating electrophoretic separation with top-down MS, the approach enhances predictive confidence in protein behavior and informs go/no-go decisions during lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving conformational differences between protein variants and proteoforms.
- Operational Value: Supports functional target validation through conformer-specific higher-order structure characterization.
- Predictive Value: Improves confidence in target selection by revealing structural dynamics relevant to biological function.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares biologically relevant protein systems for downstream screening by separating and characterizing coexisting states.
- Quantitative Output: Provides global and fragment-level deuteration measurements enabling quantitative comparison of protein conformers.
- Reproducibility: Minimizes residual protic solvent during HDX, creating a near-complete deuterating environment for consistent results.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage conformational insights to preclinical validation by characterizing protein dynamics in solution.
- Mechanistic De-risking: Clarifies structure-function relationships in protein variants, reducing ambiguity in lead optimization.
- Biomarker Alignment: Supports identification of conformational biomarkers linked to functional outcomes in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification, where conformational resolution informs protein engineering and screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by separating and analyzing coexisting protein conformers under near-native conditions.
- Screening: Enables assay standardization by delivering reproducible, quantitative structural readouts for protein species.
- Analytics: Delivers global deuteration levels and fragment-specific uptake patterns that facilitate comparative analysis of protein states.
- Translational Research: Connects structural dynamics to functional outcomes, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for characterizing protein heterogeneity across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in protein behavior by resolving conformational heterogeneity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through automated CE-MS integration and minimized solvent artifacts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by reducing mechanistic uncertainty in protein targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of protein candidates based on structural stability and dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in capillary electrophoresis, mass spectrometry, and protein HDX principles.
- Depends on CE-MS interface compatibility, background electrolyte optimization, and modifier solution delivery.
- Necessitates cross-team standardization of HDX quenching, denaturing, and MS acquisition parameters.
- Involves adaptation considerations for varying protein size, charge, and solubility under electrophoretic conditions.
- Limited by analysis time at low infusion pressures, which improve separation but extend experiment duration.
