דיסקציה פלנרית של השחלה לניתוח אולטרה-סטרוקטורלי וצביעת נוגדנים
10 בספטמבר 2021
פרוטוקול זה מציג צעדים שננקטו לניתוח השחלות בפלנריות המים המתוקים, Schmidtea mediterranea. השחלות המנותחות תואמות לניתוח חיסוני נוגדנים וניתוח אולטרה-סטרוקטורלי עם מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת כדי לחקור את הביולוגיה התאית של הביציות והתאים הסומטיים, ומספקות עומק ואיכות הדמיה שלא היו נגישים בעבר.
מטרת שיטה זו היא לנתח את השחלות של מדיטרנה Schmidtea פלנרית לאנליזה תאית ותת-תאית של ביולוגיה של ביציות עם TEM או צביעת נוגדנים. פרוטוקול זה משתמש בשלב קיבוע קצר כדי להקל על לוקליזציה ודיסקציה של שחלות פלנריות, אשר יספק עומק ואיכות הדמיה כי הם היו נגישים בעבר. המאבק הגדול ביותר עבור מי שמעולם לא ביצע טכניקה זו לפני כן יהיה למקם את השחלות לאחר קיבוע.
היכרות עם האנטומיה של מתכננים מיניים לפני הניסוי תהיה מועילה. התכוננו לניסוי על ידי האכלת פלנרים מיניים במשחת כבד אורגנית פעמיים בשבוע כדי להשיג בגרות מינית. טפלו בתולעים בוגרות מינית עם 5%N-אצטיל-L-ציסטאין, או NAC, בצלחת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
החליפו את NAC ב-10 מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד טרי שהוכן, וקיבעו את התולעים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם רעידות מזדמנות. התחל את הדיסקציה 10 דקות לאחר הוספת 4% paraformaldehyde כמו התולעים להיות קבוע. שימו לב לפיגמנטציה האפיתל כדי לאתר את מיתרי העצבים הגחונים, המופיעים כשני קווים עם פיגמנטציה בהירה יותר העוברת מהגרעינים הצפליים הקדמיים לכיוון הזנב.
אתר את השחלות המשוערות על ידי התבוננות בפיגמנטציה ואמת את מיקומן. באמצעות שני סכינים כירורגיות, לבצע חתכים אחוריים וקדמיים לשחלות כדי להסיר את שברי התולעת הקדמית והאחורית לחלוטין. השתמש בסכין אחת כדי לעגן את התולעת ובסכין השנייה לנתיחה.
נקו את הסכין המשמשת לביצוע החתכים. כדי להפריד בין שתי השחלות, לחתוך בקו האמצעי של שבר השחלה, ולאחר מכן להפוך את הצד הגחוני שבר כלפי מטה. השתמש בשני זוגות של פינצטה מחודדת מסוג 5-SA כדי לקלף את הרקמה הגבית ולחשוף את המעי.
הסירו בעדינות את ענפי המעיים היושבים מעל רקמות הגחון בעזרת קצה הפינצטה או מברשת רכה כדי לחשוף את השחלה. הסר את הרקמות שמסביב כדי להוציא את השחלה. הוציאו את השחלות והעבירו אותן לצינור של 1.5 מיליליטר לשטיפה עם 1 מיליליטר PBS.
תבניות הפיגמנטציה הגבית והגחונית שימשו לאיתור מיקום השחלות. רקמה עודפת נחתכה בצורה שלב אחר שלב. ברגע שהשחלה נחשפה, הרקמה שמסביב נחתכה.
שחלות המכילות סוגי תאים סומטיים מרובים שימשו הן לניתוח אולטרה-סטרוקטורקלי והן לצביעת אימונופלואורסצנטיות. השחלות המנותחות מאפשרות הדמיה באיכות גבוהה של האנטומיה התאית והתת-תאית של הביציות. הליך זה אמור לאפשר ניסויים בהפרעות RNA כדי לבחון תקנות מולקולריות של ביולוגיה של ביציות.
טכניקה זו הובילה לגילוי תופעה חדשה בביציות התולעים השטוחות, שמעטפת הגרעין מתפרקת לשלפוחיות העוטפות חלבונים גרעיניים במקום להישאר שלמות, כלומר מיטוזה סגורה, או נשברות לחתיכות, כלומר מיטוזה פתוחה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את תהליך הדיסקציה של השחלה בתוחלת המים המתוקים Schmidtea mediterranea, במטרה לאפשר ניתוח תאי ותת-תאי של ביולוגיית הביצית. השיטה משפרת את איכות ועומק הדימות באמצעות טכניקות כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) וצביעה אימונוהיסטוכימית של נוגדנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ביולוגיה של התא
- ניתוח תאי ביצית
- ביולוגיה של פלנריה
רקע
- האנטומיה של פלנריה מינית היא קריטית לצורך נתיחה יעילה.
- האכלת פלנריות במשחת כבד אורגנית מקדמת בשלות מינית.
- מיקום השחלות נקבע על בסיס דפוסי פיגמנטציה אפיתליאליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שיטות נתיחה כירורגית
- פלאנריה של מי מתיקים Schmidtea mediterranea
- מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) וצביעה אימונופלואורסצנטית
תוצאות עיקריות
- מיקום יעיל וניתוח של שחלאות מפלנריות מיניות.
- דימוי באיכות גבוהה של מבנים תאיים וסוגי תאים סומטיים.
- השיטה תומכת בניסויי הפרעה של RNA (RNA interference) לחקר ויסות מולקולרי.
מסקנות
- מחקר זה מספק טכניקה חדשנית לניתוח תאי רבייה בפלנריות.
- הוא מקדם את ההבנה של הביולוגיה של האוציט ותומך במחקרים גנטיים עתידיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גישה ישירה לשחלות שלמות של פלנריה מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של התפתחות תאי נבט, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. פרוטוקול זה מקל על דימות כמותי ובדיקה מולקולרית של ביולוגיית הביציות, ובכך מגביר את הביטחון החזוי במחקרי קו נבט. גישה זו מיועדת לספק מידע לצורך תיקוף מטרות וגנומיקה תפקודית בנתיבי עבודה של ביולוגיה של הרבייה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מדויקת של התפתחות תאי רבייה ותהליכי מיוזה.
- תומך בתיקוף תפקודי של הפרעות גנטיות באמצעות השתקה של RNA (RNA interference) בביציות.
- משפר את הבהירות המכניסטית לבחירת מטרות רבייתיות ולהפחתת סיכונים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק הכנה סטנדרטית של שחלאות שלמות לצורך דימות ובדיקות מבוססות נוגדנים בהמשך.
- מאפשר ניתוח כמותי הדיר של מבנים תאיים ותתי-תאיים.
- מאפשר הערכה איתנה של תפקוד גנים תחת תנאים ניסיוניים מבוקרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות לצורך חקר האפיגנטיקה של תאי הנבט והארכיטקטורה התאית.
- תומך ברצף החל משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של מטרות רבייתיות.
- מספק תובנות ניבויות לגבי מנגנונים שמורים של ביולוגיה של התבואה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
פרוטוקול נתיחה זה משתלב בשלבים המוקדמים של הגילוי ותיקוף המטרה, ומאפשר ניתוחים המשכיים של מבנה על (ultrastructural) וצביעה אימונולוגית. הוא תומך בתהליכי עבודה החל מבדיקת השערות ועד להערכת תפקוד גנים במערכות של תאי נבט.
- ביולוגיה של הגילוי: מסייע במחקרים מונחי-השערה של התמיינות תאי נבט ובקרה מייוטית.
- סריקה: מספק רקמת שחלה מוכנה לבדיקה לצורך דימוי כמותי וסריקת נוגדנים.
- אנליטיקה: מספק תוצאות תאיות ותת-תאיות ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין גילויים בסיסיים להערכה פרה-קלינית של מטרות רבייתיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פרוטוקול בר-שימוש למחקרים מגוונים של קו נבט והפרעות גנטיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בניבוי ומפחית עמימות באימות מטרות של תאי נבט.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי נתיחה והדמיה של השחלה לצורך הדירות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go בתיקי פיתוח של ביולוגיה של הרבייה.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מותאם סיכון של מטרות בקו הנבט ומחקרי תפקודי גנים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באנטומיה של פלנריה ובטכניקות ניתוח.
- נדרשת גישה לתשתית של מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) וצביעה אימונוהיסטוכימית.
- נדרש סטנדרזציה בין צוותים להכנת רקמות והדמיה הניתנות לשחזור.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור מערכות מודל אחרות של חסרי חולר או תאי נבט.
- מוגבל עקב מספרם המועט של ציטות הביצה בפלנריה ומיקומן העמוק.
