מודל דימום טרנסקציה של וריד זנב בהמופיליה מורדמת לחלוטין עכברים

מודלים של דימום זנב יכולים להיות כלים חשובים להערכת ההשפעות הפרמקולוגיות של תרכובות המוסטטיות in vivo כדי להבטיח יכולת שכפול בין ניסויים. בהשוואה למודלים רגישים אחרים של דימום, המודל שלנו משתמש באיבוד דם ובזמן דימום כנקודות קצה במקום הישרדות. כמו כן, המודל מבוצע בהרדמה, ובכך מפחית כאב ומצוקה לבעלי החיים.

טכניקה זו שימושית במיוחד עבור המחקר הפרה-קליני של המופיליה והפרעות קרישה אחרות, שכן היא מודדת את היכולת של הדם לקריש ולעצור דימום לאחר פציעה. השתמשנו במודל זה באופן נרחב, ובדקנו תרכובות פרו-קרישיות בעבודתנו לפיתוח טיפולים חדשניים בהמופיליה באמצעות עכברי המופיליה A. עם זאת, ניתן להשתמש גם בזנים אחרים של עכברים המופיליים, או בעכברים שבהם המופיליה מושרית עם נוגדן אנטי-פקטור VIII.

מי שידגימו את הניסוי יהיו שרה ודניס, שהם טכנאים מומחים במעבדה שלי. לאחר הרדמת העכבר, הניחו אותו על לוח חימום וודאו שהאף נמצא בקונוס האף. יש למרוח משחה מתאימה לעיניים כדי למנוע יובש בהרדמה.

סמן את הזנב בקוטר של 2.5 מילימטרים באמצעות בלוק סימן הזנב, תוך הקפדה שלא לכפות את הזנב לתוך החריץ ולוודא שהוא מתאים היטב. לאחר מכן, מניחים את הזנב בצינור המלוח למשך חמש דקות לפחות כדי להבטיח וריד זנב חם האופטימלי למינון תוך ורידי. במידת הצורך, מינון IV יכול להתבצע לאחר חמש דקות.

לאחר מכן, הניחו כיסוי פלסטיק מעל העכבר כדי להפחית את אובדן החום. השאירו את הזנבות שקועים במשך חמש דקות לאחר מינון תמיסת הבדיקה, ולאחר מכן בצעו את הטרנסקציה של וריד הזנב על ידי הנחת הזנב בגוש החיתוך והפיכתו ב-90 מעלות כדי לחשוף את הווריד. בצע את החתך בצד הנגדי מהמקום שבו תמיסת הבדיקה הייתה מינון.

ציירו את להב האזמל מספר 11 דרך החריץ של גוש החיתוך, המחזיק את הזנב, כדי ליצור דימום. לאחר מכן, החזירו מיד את הזנב למלח ואיפסו את שעון העצר. דימום צריך להיות גלוי מיד.

טבילת הזנב במי מלח חשובה לדימום עקבי, שכן הוא ייעצר במהירות באוויר החופשי. שימו לב לדימום והביאו את ההתחלה והעצירה של הדימום במשך 40 דקות על נייר הסימון של זרימת הדם. לפסול ולהחליף את העכבר אם הדימום הראשוני אינו נעצר תוך שלוש דקות לאחר ביצוע החתך, מה שעשוי להצביע על כך שהחתך עמוק מדי או שהעכבר לוקה בחסר בהמוסטאזיס ראשוני.

אתגרו את חתך הזנב אם אין דימום, 10, 20 ו-30 דקות לאחר הפציעה. בעזרת ספוגית גזה ספוגה ותמלחת חמימה, מרימים את הזנב מתוך המלוח ומנגבים אותו ברכות אך בחוזקה פעמיים עם הגזה הרטובה בכיוון דיסטלי מעל חתך הזנב. מיד החזירו את הזנב לתוך הצינור המלוח לאחר כל אתגר.

בסיום הניסוי, הסירו את הזנב ממלח, אספו דגימות דם אם תרצו, והרדימו את העכברים כשהם עדיין תחת הרדמה מלאה. צנטריפוגה צינורות איסוף הדם 15 מיליליטר עם מלח ב 4, 000 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט מהצינורות.

Resuspend את הכדור בשני מיליליטרים של תמיסת ליזוז אריתרוציטים. לאחר מכן, דיללו אותו עם עד 12 מיליליטרים נוספים של תמיסת ליזוז עד שהוא מגיע לצבע קפה בהיר. שים לב לנפח הכולל ולהעביר שני מיליליטרים של הדילול לצינור המוגלובין.

מכניסים אותו למקרר עד לניתוח המוגלובין. הפחתה משמעותית באיבוד הדם עבור קבוצות טיפול של גורם קרישה רקומביננטי VIII נצפתה באמצעות הפרוטוקול המותאם. מנה של 20 יחידות בינלאומיות לקילוגרם נרמלה לחלוטין את הדימום, ו-10 יחב"ל לקילוגרם גרמו להשפעה משמעותית, והפחיתו את איבוד הדם כמעט עד לגבול העליון של טווח הבר.

תוצאות דומות נצפו לזמן הדימום. נצפתה ירידה בקבוצות של 5, 10 ו-20 יחב"ל לקילוגרם, ונורמלה לחלוטין בקבוצת 20 הח'לים לקילוגרם. בעכברים מסוג בר, אובדן הדם הכולל נע בין 200 ל-840 ננומולה של המוגלובין, ובעכברי רכב, בין 5, 300 ל-7, 100 ננומולה של המוגלובין.

הדימום הממוצע היה 5, 200 ננומול בעכברים שטופלו ברכב, ו-720 ננומול בקבוצת 20 יב"ל לקילוגרם. זמן הדימום של עכברים מסוג בר נע בין דקה לתשע דקות ורמות המינון של 10 ו-20 יחב"ל לקילוגרם הפחיתו את זמן הדימום לטווח זה. מתאם חזק בין איבוד דם לזמן הדימום נצפה בנתונים המשולבים.

כל פרקי הדימום המתועדים תוכננו כדי לספק הדמיה של אורך ומספר הדימומים שחווה כל עכבר בנפרד. שימו לב שבקבוצת הרכב, לאחר האתגר השני, רוב בעלי החיים ממשיכים לדמם עד סוף הניסוי. מדידת ריכוז פקטור VIII בפלזמה אישרה כי ההשפעה שנצפתה בהפחתת אובדן הדם וזמן הדימום הייתה תלוית ריכוז רקומביננטית VIII.

ספירת הטסיות לא הושפעה באופן ניכר ורמות ההמטוקריט היו בטווח התקין אצל בעלי חיים שקיבלו מינונים מתונים וגבוהים יותר של גורם רקומביננטי VIII, אך נמוכים משמעותית בבעלי חיים שדיממו באופן נרחב, כגון ברכב ובקבוצה אחת של IU לכל קילוגרם. אצל בעלי חיים שחווים דימום כבד, השפעה מינורית על ספירת הדם, במיוחד המוגלובין מוחלט או המטוקריט, יכולה להתרחש. כדי להעריך את ההשפעה של מגדר במודל מותאם זה, הן אובדן דם והן תוצאות זמן דימום היו נתונים לניתוח ANOVA דו כיווני, עם מגדר ומינון כגורמים.

תוצאות אלה הצביעו על כך שהתגובה לטיפול לא הייתה שונה בין המינים. סימון נכון של הזנב ויצירת החתך הם צעדים חיוניים כדי להבטיח אמינות ויכולת שכפול בטכניקה, וכך גם האתגר אם אין דימום. יתר על כן, אינדוקציה של הרדמה טובה ושמירה על טמפרטורת הגוף של בעלי החיים רלוונטית במיוחד.

השתמשנו גם במודל זה כדי לחקור עצירה של דימומים מבוססים בסביבה יותר לפי דרישה על ידי טיפול עם גורם VIIA 10 דקות לאחר גרימת דימום.