גישה גנטית הפוכה לזיהוי מווסתי פיגמנטציה באמצעות דגי זברה
1 במרץ 2022
רגולטורים של פונקציות מלנוציטים שולטים בהבדלים גלויים בתוצאות הפיגמנטציה. פענוח הפונקציה המולקולרית של גן הפיגמנטציה המועמד מציב אתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש במערכת מודל דגי זברה כדי לזהות מועמדים ולסווג אותם לווסתים של תכולת המלנין ומספר המלנוציטים.
פרוטוקול זה הוא מיזוג של טכניקות שונות שיאפשרו לחוקרים לשרטט את תפקיד הגן המועמד בביולוגיה של המלנוציטים. זוהי גישה הוליסטית להשגת היסק לוגי. על ידי שילוב שיטות שונות, ניתן להימנע מגורמים מבלבלים וזה יכול לעזור לחוקרים להשיג תוצאה משמעותית.
כדי להתחיל את הניתוח, לשתק את 48 עוברי HPF עם 0.016% tricaine. הרכיבו את העוברים באמצעות כמה מיליליטרים של 1.5% עד 2% מתיל צלולוז בצלחת פטרי. בחר את העוברים עם פיפטה פסטר ומניחים אותם במתיל צלולוז כדי להגביל את התנועה במהלך ההדמיה.
להדמיה רוחבית או גבית אופטימלית, התאימו את מיקומם בהגדלה של יותר מפי 5. מניחים את צלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ. באמצעות מניפולטור, להתאים את הדג כך שכל חמשת הפסים העובריים מלנוציטים נראים בו זמנית.
באמצעות תוכנת הרכישה, ללכוד את התמונות. אם הדג מתעורר, הכניסו אותו למי טריקאין עד שהוא מתייצב. באמצעות הכלי הפתוח בתוכנת ImageJ, פתח את התמונה לכמת.
בחרו בכלי צורה חופשית כדי לשרטט את האזור לניתוח. בחר באפשרות הגדר מידות, לחץ על הערך האפור הממוצע ולאחר מכן על האזור. כדי לחשב את הערך האפור הממוצע עבור האזור שנבחר, לחץ על M או עבור לנתח ולבחור מדידה.
בהתבסס על שלב העניין, להעביר את העוברים לצלחת פטרי המכילה 0.6 מיליגרם למיליליטר Pronase. בעזרת פיפטה של פסטר, מעבירים את העוברים המפורקים לצלחת פטרי המכילה מי עובר רגילים לאחר חמש עד 10 דקות. בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית, אוספים ומעבירים כ-100 עוברים לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר.
השליכו את המדיום והוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת רינגרס חלמון קרה כקרח. מניחים את הצינור על קרח ומערבבים את התוכן בערך 20 פעמים עם פיפטה כדי להמיס את העול. צנטריפוגו את הצינורות ב-100 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס פעמיים, והשליכו את הסופרנטנט.
מעבירים את העוברים החלמונים באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד בצלוחית פטרי המכילה 10 מיליליטר של תמיסת טריפסין. מערבבים את התמיסה פעם או פעמיים באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד כדי להקטין את הצבירה. מעבירים את התרחיף הטריפסיני דרך מסננת של 70 מיקרומטר המונחת על צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי לאסוף תרחיף תא בודד.
שטפו את צלחות הפטרי עם ההשעיה הטריפסינית כדי להסיר את התאים המודבקים מפני השטח. לספירת התאים המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות ציטומטר זרימה, לאחר יצירת תיקיית ניסוי חדשה, ציירו תרשים פיזור קדימה לעומת צד. לעשות היסטוגרמה עבור עוצמת isothiocyanate fluorescein.
טען תחילה את תאי הסוג הפראי כדי להגדיר את שערי הפיזור קדימה וצדדית ואת סף FITC. לאחר מכן, טען את התאים שבודדו מעוברי קו FTYRP GFP טרנסגניים כדי לספור את המלנוציטים. הרכיבו את העוברים ב-1.5% עד 2% מתיל צלולוז בצלחת פטרי.
מניחים אותו מתחת למיקרוסקופ ומתאימים אותו בכיוון הרצוי באמצעות קצה פיפטה. באמצעות תוכנת הרכישה, לרכוש את התמונות. עבור עוברים פחות מ 24 HPF, באמצעות הגדלה פי 10, ללכוד את התמונה כולה, ואילו עבור עוברים מעל 24 HPF, לרכוש שדות סריקה מרובים ולאחר מכן להרכיב אותם.
לאחר ביצוע הבדיקה, ההדמיה של ברייטפילד לאחר 48 שעות חשפה את נוכחותם של כל חמשת פסי המלנופור הפיגמנטיים. בשלב 48 HPF חושב מספר המלנופורים הצדיים ונמצא כי וריאנט ההיסטון h2afv morphants הדגים מספר מופחת של מלנופורים בהשוואה לקבוצת הביקורת. הערך האפור הממוצע נמדד עבור מורפנטים CA14 ו-h2afv, מה שגילה כי הערכים היו גבוהים יותר עבור הווריאנטים מאשר מורפנטים של קבוצת הביקורת.
על ידי שימוש בשיטת ספיגה ספקטרופוטומטרית מבוססת נתרן הידרוקסידי, כומתה תכולת המלנין כאשר מורפנטים CA14 הראו פחות תוכן מאשר מורפנטים בקרה. הדמיה פלואורסצנטית בוצעה כדי להעריך שינוי מבוסס מורפולינו עבור שלבים שונים של התפתחות מלנופור דגי זברה. מספר המלנופורים במורפנטים CA14 ו-h2afv נותח באמצעות FACS.
נצפה כי מספר המלנופורים ב- CA14 נותר ללא שינוי, בעוד שהם הופחתו באופן משמעותי ב- h2afv בהשוואה למורפנט הביקורת. כמו כן חושבה עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לאזור, מה שמראה כי מורפנטים h2afv מראים ירידה ניכרת בערך ביחס למורפנטי ביקורת. בעת התאמת הדג לפני ההדמיה, ודא שאתה יכול לדמיין את כל חמשת הפסים המלנופוריים.
אתה צריך להטות את הדג קצת כדי להבחין בין שני פסים לרוחב. לאחר ביסוס תפקידו של גן מועמד בהתפתחות מלנוציטים, אנו יכולים לחסל את הגן באופן ספציפי לרקמה באמצעות טכנולוגיית CRISPR. זו תהיה גישה ממוקדת יותר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את תפקידם של גנים מועמדים לפיגמנטציה בביולוגיה של המלנוציטים באמצעות מערכת מודל של דג זבוב (zebrafish). באמצעות שימוש בטכניקות דימות ובבדיקות שונות, המחקר מזהה רגולטורים מרכזיים של תכולת המלנין ומספר המלנוציטים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- התפתחות מלנוציטים
- גנטיקה של פיגמנטציה
- דגי זהב כאורגניזם מודל
רקע
- הבנת התפקוד המולקולרי של גנים האחראים לפיגמנטציה חיונית לפענוח הווריאציות בצבע העור.
- גורמים מבלבלים במחקר עלולים להפריע להערכה מדויקת של תפקודי הגנים.
- עוברים של דג הזברה מהווים מודל יעיל לחקר תהליכי התפתחות מוקדמים של פיגמנטציה.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- קיבוע עוברים וטכניקות דימוי
- דג הזברה כמודל ביולוגי
- ציטומטריית זרימה לספירת מלנוציטים ובדיקות ספקטרופוטומטריות למדידת תכולת מלנין
תוצאות עיקריות
- נצפתה ירידה במספר המלנופורים במורפנטים של h2afv בהשוואה לבקרה.
- מורפנטים של CA14 הראו תכולת מלנין נמוכה יותר מאשר מורפנטי בקרה.
- דימוי פלואורסצנטי אישר הבדלים התפתחותיים במלנופורים.
מסקנות
- הממצאים ממחישים את חשיבותם של גנים ספציפיים של פיגמנטציה להתפתחות המלנוציטים.
- למחקר זה יש השלכות רחבות יותר להבנת ההשפעות הגנטיות על פיגמנטציה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר בחינה שיטתית של רגולטורים גנטיים בהתפתחות מלנוציטים, ובכך תומך בתיקוף מטרות (target validation) בהשפעת הפרעות הקשורות לפיגמנטציה. באמצעות שילוב של הדמיה פנוטיפית, ציטומטריה זרימה ובדיקות ביוכימיות, הוא מספק מדדים כמותיים להורדת סיכונים של היפותזות מכניסטיות בשלב מוקדם של הגילוי. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בהבחנה בין גנים המשפיעים על מספר המלנוציטים לבין אלו המשפיעים על תכולת המלנין לתא, ובכך מסייעת בתעדוף פורטפוליו של מודולטורים טופקליים או סיסטמיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר ניתוח תפקודי של גנים מועמדים למגדירי מלנוציטים ומבדילי מלנוציטים, בהתבסס על השפעות על מספר התאים לעומת סינתזה של פיגמנט.
- ערך תפעולי: משתמש בהשתקה באמצעות מורפולינו בזחלי דגי זהב (zebrafish) כדי להעריך במהירות השלכות פנוטיפיות על מסלולי פיגמנטציה.
- ערך מדעי: תומך בבדיקת השערות על ידי קישור הפרעה גנטית לשינויים מדידים במספר המלנופורים ובתוכן המלנין.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר פלטים כמותיים וסטנדרטיים, כולל ערך אפור ממוצע מדימות בשדה בהיר וריכוז מלנין באמצעות ספקטרופוטומטריה.
- ערך תפעולי: משלב ספירת מלנוציטים מבוססת FACS עם דימות כדי לאפשר סריקה פנוטיפית בעלת תוכן גבוה של מודולטורים גנטיים.
- ערך מדעי: מסייע לשחזור הבדיקה באמצעות שלבי התקדמות מוגדרים (48 HPF), קיבוע ופרמטרי דימות להשוואה לאורכית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שימוש במדווחים טרנסגניים של GFP (mitfa, tyrp1) למעקב אחר שלבי ההגדרה וההבחנה של מלנוציטים הרלוונטיים לביולוגיה של פיגמנטציה אנושית.
- ערך תפעולי: מאפשר הפרדה של תוצאות חיוביות למחלקות מכניסטיות (מגדירים לעומת מבחינים) כדי להוביל תיקוף בהמשך במודלים של יונקים.
- ערך מדעי: מספק מערכת הרלוונטית למחלות להערכת גנים המעורבים במסלולי פיבלדיזם (piebaldism), אלביניזם או ויטיליגו.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד
השיטה מתאימה לשלב שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים (lead identification), שבו מוצמדים פגיעות גנטיות (genetic hits) ונבדקים השפעותיהם על הביולוגיה של המלנוציטים לפני סריקת תרכובות או מעקב מכניסטי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בתיקוף מטרות על ידי בידוד השפעות ספציפיות לגן על התפתחות מלנוציטים באמצעות פנוקופי של מורפולינו והדמיה כמותית.
- סריקה: מאפשרת שימוש במודלים של דגי זברא המוכנים לבדיקה עם רפורטרים פלואורסצנטיים להערכה ניתנת להרחבה של מודולטורים גנטיים או מולקולות קטנות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות רב-פרמטריות — מספר מלאנופורים (FACS), תכולת מלנין (ספקטרופוטומטריה) והפצה מרחבית (הדמיה) — לתמיכה במיון פגיעות (hit triage) מבוסס נתונים.
- מחקר תרגומי: משתמשת בסמני מלנוציטים שמורים (mitfa, tyrp1) כדי לגשר בין ממצאים בדגי זברא למנגנוני פיגמנטציה אנושיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקת גנטיקה של פיגמנטים, הישמה על פני משפחות מטרות ותחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי הבחנה בין גנים המשנים את הגדרת המלנוציטים (melanocyte specification) לבין גנים המשפיעים על ייצור פיגמנט לכל תא.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של פרוטוקולי טיפול בעובריים, דימוג ודיסוציאציה כדי להבטיח הדירות בין מעבדות ומסעות סריקה.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של go/no-go על ידי מתן ביטחון פנוטיפי מוקדם במנגנון המטרה לפני השקעה בכימיה רפואית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מטרות מותאם סיכון על בסיס תיקוף גנטי של פנוטיפים ספציפיים למלנוציטים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באמבריולוגיה של דג הזברה (zebrafish), מיקרו-הזרקה ותכנון מורפולינו לצורך הערכה פנוטיפית מדויקת.
- המכשור כולל מיקרוסקופי פלואורסצנציה, ציטומטרים זורמים וספקטרופוטומטרים לקריאה רב-פרמטרית.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת סנכרון של שלבי ההתפתחות (HPF), פרוטוקולי קיבוע והגדרות דימות כדי למזער שונות.
- התאמה למודלים אחרים עשויה לדרוש תיקוף של רפורטרים מונעי-פרומוטורים שמורים ונקודות קצה פנוטיפיות.
- המגבלות כוללות השפעות של מורפולינו על יעדים לא רצויים (off-target) והשתקה זמנית, דבר המחייב מעקב באמצעות CRISPR או שושלות מוטנטים לאישור היעד.
