גישה גנטית הפוכה לזיהוי מווסתי פיגמנטציה באמצעות דגי זברה
March 1st, 2022
רגולטורים של פונקציות מלנוציטים שולטים בהבדלים גלויים בתוצאות הפיגמנטציה. פענוח הפונקציה המולקולרית של גן הפיגמנטציה המועמד מציב אתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש במערכת מודל דגי זברה כדי לזהות מועמדים ולסווג אותם לווסתים של תכולת המלנין ומספר המלנוציטים.
פרוטוקול זה הוא מיזוג של טכניקות שונות שיאפשרו לחוקרים לשרטט את תפקיד הגן המועמד בביולוגיה של המלנוציטים. זוהי גישה הוליסטית להשגת היסק לוגי. על ידי שילוב שיטות שונות, ניתן להימנע מגורמים מבלבלים וזה יכול לעזור לחוקרים להשיג תוצאה משמעותית.
כדי להתחיל את הניתוח, לשתק את 48 עוברי HPF עם 0.016% tricaine. הרכיבו את העוברים באמצעות כמה מיליליטרים של 1.5% עד 2% מתיל צלולוז בצלחת פטרי. בחר את העוברים עם פיפטה פסטר ומניחים אותם במתיל צלולוז כדי להגביל את התנועה במהלך ההדמיה.
להדמיה רוחבית או גבית אופטימלית, התאימו את מיקומם בהגדלה של יותר מפי 5. מניחים את צלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ. באמצעות מניפולטור, להתאים את הדג כך שכל חמשת הפסים העובריים מלנוציטים נראים בו זמנית.
באמצעות תוכנת הרכישה, ללכוד את התמונות. אם הדג מתעורר, הכניסו אותו למי טריקאין עד שהוא מתייצב. באמצעות הכלי הפתוח בתוכנת ImageJ, פתח את התמונה לכמת.
בחרו בכלי צורה חופשית כדי לשרטט את האזור לניתוח. בחר באפשרות הגדר מידות, לחץ על הערך האפור הממוצע ולאחר מכן על האזור. כדי לחשב את הערך האפור הממוצע עבור האזור שנבחר, לחץ על M או עבור לנתח ולבחור מדידה.
בהתבסס על שלב העניין, להעביר את העוברים לצלחת פטרי המכילה 0.6 מיליגרם למיליליטר Pronase. בעזרת פיפטה של פסטר, מעבירים את העוברים המפורקים לצלחת פטרי המכילה מי עובר רגילים לאחר חמש עד 10 דקות. בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית, אוספים ומעבירים כ-100 עוברים לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר.
השליכו את המדיום והוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת רינגרס חלמון קרה כקרח. מניחים את הצינור על קרח ומערבבים את התוכן בערך 20 פעמים עם פיפטה כדי להמיס את העול. צנטריפוגו את הצינורות ב-100 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס פעמיים, והשליכו את הסופרנטנט.
מעבירים את העוברים החלמונים באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד בצלוחית פטרי המכילה 10 מיליליטר של תמיסת טריפסין. מערבבים את התמיסה פעם או פעמיים באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד כדי להקטין את הצבירה. מעבירים את התרחיף הטריפסיני דרך מסננת של 70 מיקרומטר המונחת על צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי לאסוף תרחיף תא בודד.
שטפו את צלחות הפטרי עם ההשעיה הטריפסינית כדי להסיר את התאים המודבקים מפני השטח. לספירת התאים המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות ציטומטר זרימה, לאחר יצירת תיקיית ניסוי חדשה, ציירו תרשים פיזור קדימה לעומת צד. לעשות היסטוגרמה עבור עוצמת isothiocyanate fluorescein.
טען תחילה את תאי הסוג הפראי כדי להגדיר את שערי הפיזור קדימה וצדדית ואת סף FITC. לאחר מכן, טען את התאים שבודדו מעוברי קו FTYRP GFP טרנסגניים כדי לספור את המלנוציטים. הרכיבו את העוברים ב-1.5% עד 2% מתיל צלולוז בצלחת פטרי.
מניחים אותו מתחת למיקרוסקופ ומתאימים אותו בכיוון הרצוי באמצעות קצה פיפטה. באמצעות תוכנת הרכישה, לרכוש את התמונות. עבור עוברים פחות מ 24 HPF, באמצעות הגדלה פי 10, ללכוד את התמונה כולה, ואילו עבור עוברים מעל 24 HPF, לרכוש שדות סריקה מרובים ולאחר מכן להרכיב אותם.
לאחר ביצוע הבדיקה, ההדמיה של ברייטפילד לאחר 48 שעות חשפה את נוכחותם של כל חמשת פסי המלנופור הפיגמנטיים. בשלב 48 HPF חושב מספר המלנופורים הצדיים ונמצא כי וריאנט ההיסטון h2afv morphants הדגים מספר מופחת של מלנופורים בהשוואה לקבוצת הביקורת. הערך האפור הממוצע נמדד עבור מורפנטים CA14 ו-h2afv, מה שגילה כי הערכים היו גבוהים יותר עבור הווריאנטים מאשר מורפנטים של קבוצת הביקורת.
על ידי שימוש בשיטת ספיגה ספקטרופוטומטרית מבוססת נתרן הידרוקסידי, כומתה תכולת המלנין כאשר מורפנטים CA14 הראו פחות תוכן מאשר מורפנטים בקרה. הדמיה פלואורסצנטית בוצעה כדי להעריך שינוי מבוסס מורפולינו עבור שלבים שונים של התפתחות מלנופור דגי זברה. מספר המלנופורים במורפנטים CA14 ו-h2afv נותח באמצעות FACS.
נצפה כי מספר המלנופורים ב- CA14 נותר ללא שינוי, בעוד שהם הופחתו באופן משמעותי ב- h2afv בהשוואה למורפנט הביקורת. כמו כן חושבה עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לאזור, מה שמראה כי מורפנטים h2afv מראים ירידה ניכרת בערך ביחס למורפנטי ביקורת. בעת התאמת הדג לפני ההדמיה, ודא שאתה יכול לדמיין את כל חמשת הפסים המלנופוריים.
אתה צריך להטות את הדג קצת כדי להבחין בין שני פסים לרוחב. לאחר ביסוס תפקידו של גן מועמד בהתפתחות מלנוציטים, אנו יכולים לחסל את הגן באופן ספציפי לרקמה באמצעות טכנולוגיית CRISPR. זו תהיה גישה ממוקדת יותר.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה חוקר את התפקיד של גנים של פיגמנטציה מועמדים בביולוגיה של מלנוציטים באמצעות מערכת מודל של דג זברה. על ידי שימוש בטכניקות הדמיה שונות ובדיקות, המחקר מזהה רגולטורים עיקריים של תוכן מלנין ומספר המלנוציטים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המחקר
- התפתחות המלנוציטים
- גנטיקה של פיגמנטציה
- דג זברה כאורגניזם מודל
רקע
- הבנת הפונקציה המולקולרית של גני הפיגמנטציה היא חיונית לפיענוח וריאציות בצבע העור.
- גורמים מבלבלים במחקר יכולים להפריע להערכה מדויקת של פונקציות הגנים.
- עוברים של דג זברה מספקים מודל יעיל לחקר תהליכי התפתחות מוקדמים בפיגמנטציה.
שיטות ששימשו
- אי-תזוזה של עוברים וטכניקות הדמיה
- דג זברה כמודל ביולוגי
- ציטומטריה של זרימה לספירת מלנוציטים ובדיקות ספקטרופוטומטריות לתוכן מלנין
תוצאות עיקריות
- צפייה במספר מלנופור נמוך יותר ב-morphants h2afv בהשוואה לבקרות.
- ב-morphants CA14 הוצג תוכן מלנין נמוך יותר מאשר ב-morphants הבקרה.
- הדמיה פלואורסצנטית אישרה הבדלים התפתחותיים במלנופור.
מסקנות
- הממצאים ממחישים את החשיבות של גני פיגמנטציה מסוימים בהתפתחות המלנוציטים.
- למחקר זה יש השלכות רחבות יותר להבנת ההשפעות הגנטיות על הפיגמנטציה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables systematic interrogation of genetic regulators in melanocyte development, supporting target validation in pigment-related disorders. By combining phenotypic imaging, flow cytometry, and biochemical assays, it provides quantitative readouts for de-risking mechanistic hypotheses early in discovery. The approach enhances predictive confidence in distinguishing genes affecting melanocyte number versus melanin content per cell, informing portfolio prioritization for topical or systemic modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional dissection of candidate genes into melanocyte specifiers and differentiators based on effects on cell number versus pigment synthesis.
- Operational Value: Uses morpholino knockdown in zebrafish larvae to rapidly assess phenotypic consequences on pigmentation pathways.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing by linking gene perturbation to measurable changes in melanophore count and melanin content.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs including mean gray value from brightfield imaging and melanin concentration via spectrophotometry.
- Operational Value: Integrates FACS-based melanocyte counting with imaging to enable high-content phenotypic screening of genetic modulators.
- Scientific Value: Facilitates assay reproducibility through defined staging (48 HPF), immobilization, and imaging parameters for longitudinal comparison.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses transgenic GFP reporters (mitfa, tyrp1) to track melanocyte specification and differentiation stages relevant to human pigmentation biology.
- Operational Value: Enables segregation of hits into mechanistic classes (specifiers vs. differentiators) to guide downstream validation in mammalian models.
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for evaluating genes implicated in piebaldism, albinism, or vitiligo pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are validated for effects on melanocyte biology before compound screening or mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports target validation by isolating gene-specific effects on melanocyte development through morpholino phenocopy and quantitative imaging.
- Screening: Enables assay-ready zebrafish models with fluorescent reporters for scalable evaluation of genetic or small-molecule modulators.
- Analytics: Delivers multiparametric readouts—melanophore number (FACS), melanin content (spectrophotometry), and spatial distribution (imaging)—to support data-driven hit triage.
- Translational Research: Uses conserved melanocyte markers (mitfa, tyrp1) to bridge zebrafish findings to human pigmentation mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pigment genetics screening applicable across target families and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing genes that alter melanocyte specification from those affecting pigment production per cell.
- Operational Value: Standardizes embryo handling, imaging, and dissociation protocols to ensure reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic confidence in target mechanism before investing in medicinal chemistry.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on genetic validation of melanocyte-specific phenotypes.
Implementation Considerations
- Expertise in zebrafish embryology, microinjection, and morpholino design is required for accurate phenotypic assessment.
- Instrumentation includes fluorescence microscopes, flow cytometers, and spectrophotometers for multiparametric readout.
- Standardization across teams requires synchronized staging (HPF), immobilization protocols, and imaging settings to minimize variability.
- Adaptation to other models may require validation of conserved promoter-driven reporters and phenotypic endpoints.
- Limitations include morpholino off-target effects and transient knockdown, necessitating follow-up with CRISPR or mutant lines for target confirmation.
