Name: גישה גנטית הפוכה לזיהוי מווסתי פיגמנטציה באמצעות דגי זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: חקור את תפקידם של גנים מועמדים בביולוגיית מלנוציטים באמצעות דגי זברה. שיטה זו משלבת דימות, ציטומטריית זרימה ומדידות מלנין כדי לזהות ווסתים של פיגמנטציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים על תמיכת המימון של המועצה למחקר מדעי ותעשייתי בפרויקט MLP2008 והמחלקה למדע וטכנולוגיה עבור הפרויקט GAP165 לתמיכה בעבודה המוצגת בכתב יד זה. אנו מודים לג'יאשרי רנגראג'ו ולצ'טאן מישרא על עזרתם בניסויים.

ניסויים בדגי זברה בוצעו בהתאמה קפדנית לאישור האתיקה המוסדית של בעלי חיים (IAEC) של CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), הודו (הצעה מספר 45a). כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של בעלי החיים.
1. הזרקת מורפולינו לעוברים של דגי זברה
<ol><li>באמצעות מושך מחטים סטנדרטי, ציירו פיפטים חדים מאוד וסגורים.</li>
	<li>טען את התמיסה המכילה מורפולינו לתוך micropipettes באמצעות קצה microloader ולהכניס אותו לתוך מנגנון microinjector. הדקו את הבורג כראוי כדי לנעול את המיקרופיפטה. הערה: יש צורך בסטנדרטיזציה של מינון מורפולינוס. למינון המתאים יש שיעור הישרדות של >70% ופנוטיפ ספציפי ב 24 hpf.</li>
	<li>חותכים את קצה המיקרופיפטה באמצעות מלקחיים עדינים ומכיילים אותה11.</li>
	<li>כדי לכייל, הזריקו נפח 1 של תמיסת מורפולינו לתוך צינור הנימים מהמיקרופיפטה, תוך שמירה על זמן הזרקה של 1 שניות. חזור על פעולה זו חמש פעמים. באמצעות התקן 1 מ"מ = 30 nL נפח, למצוא את נפח מוזרק 5 s על ידי שמירה על צינור נימי כנגד סולם מדידה. באמצעות המידע לעיל, חשב את הזמן (בשניות) הדרוש כדי להזריק 1-3 nL לכל זריקה12. הערה: התקן, 1 מ"מ = 30 nL, הוא ספציפי להגדרות לחץ מיקרו-מזרק וקוטר הנימים המשמש לכיול. באופן אידיאלי, ההזרקה חייבת להתבצע לתוך ממשק תא החלמון, אשר נוצר בתוך 15-20 דקות לאחר ההפריה. כדי להקל על זריקות מרובות, הפיתוח יכול להיות מעוכב מעט על ידי שמירה על עוברים בטמפרטורה נמוכה יותר (18 ° C). עם זאת, זה צריך להישמר למינימום ולא להאריך מעבר 30 דקות בשל ההשפעה המורכבת של טמפרטורה נמוכה יותר על שינויים ביטוי גנים.</li>
	<li>הרכיבו את העוברים על צלחת פטרי יצוקה באגרוס (60 מ"מ). עורמים את העוברים בחוזקה בתוך הרכסים. בעזרת פיפטות זכוכית מלוטשות אש, מיישרים אותן בכיוון הנכון להזרקה.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ, השתמש במניפולטורים כדי לקרב את המיקרופיפטה לעובר ולהזריק בתוך ממשק תא החלמון על ידי לחיצה על מתג הרגל.</li>
	<li>להזריק את כל העוברים באופן דומה; לאסוף אותם בצלחת פטרי המכילה מים עוברים טריים בינוני לדגור ב 28 ° C.</li>
	<li>בדוק את העוברים המוזרקים לאחר 6-8 שעות. הסר את כל העוברים המתים הניתנים לזיהוי בשל האטימות הגבוהה שלהם והמשך להחליף את מי העובר לפחות פעם ביום כדי למנוע זיהום.</li>
</ol>2. ניתוח פיגמנטציה
<ol><li>הכנה לספירת מלנופורים צדיים בקו האמצע ב-3 עוברי דגי זברה dpf<ol><li>לטפל בעוברים עם 0.016% הרדמה נוירו-שרירית כדי לשתק אותם.</li>
		<li>כדי להרכיב את העוברים להדמיה, להוסיף כמה מיליליטר של 1.5-2% methylcellulose בצלחת פטרי (60 מ"מ) כך שהוא יוצר שכבה דקה. בעזרת פיפטה של פסטר, בחרו עוברים ומקמו אותם בעדינות במתילצלולוז כדי להגביל תנועה נוספת במהלך ההדמיה.</li>
		<li>התאימו את מיקומם להדמיית רוחב אופטימלית (פס גבי, פס גחון, פס חלמון ומלנופורים בקו האמצע) או גביים (מלנופורים בחלק הגבי של הראש). לרזולוציה טובה יותר של מלנופורים סמוכים, תמונה בהגדלה גבוהה יותר (>5x)</li>
	</ol></li>
	<li>הדמיה של ברייטפילד הערה: הדמיית Brightfield מתבצעת באמצעות סטריאומיקרוסקופ עם הגדלה של 8-10x.<ol><li>הניחו את צלחת הפטרי המכילה את עוברי דגי הזברה מתחת למיקרוסקופ. באמצעות מניפולטור, התאימו את הדג בכיוון כזה כך שכל חמשת הפסים העובריים של המלנוציטים ייראו בו זמנית (גבי, גחוני, שני רוחביים, חלמון) (איור 1C). צלם תמונות במהירות באמצעות תוכנת הרכישה. במקרה שבו בעל החיים חוזר לתנועה לפני שהוא מצולם, לטבול אותו מחדש בהרדמה ולהמשיך עם הדמיה ברגע שהוא משותק מספיק.</li>
		<li>חזור על כך עם כל הדגים וודא שההגדלה נשארת זהה בכל תמונה.</li>
	</ol></li>
	<li>חישוב ערך אפור ממוצע באמצעות תוכנת ImageJ<ol><li>צלם תמונות גביות וצדדיות של 2 עוברי דגי זברה dpf.</li>
		<li>פתחו את התמונה לכימות ב-ImageJ באמצעות הכלי Open . השתמש בכלי צורה ביד חופשית כדי לשרטט את האזור לניתוח. עבור אל האפשרות קבע מידות ובחר ערך אפור ממוצע | אזור. הקש M (או נתח | מדידה) כדי לחשב את הערך האפור הממוצע עבור האזור שנבחר.</li>
		<li>שמירה על השטח לניתוח קבוע, לחשב את השטח האפור הממוצע עבור כל חיה בנפרד.</li>
		<li>שרטט גרף עמודות עם הנתונים שנרכשו (איור 2F).</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת תוכן מלנין<ol><li>ב 2 dpf, להשתמש פיפטה פסטר זכוכית לאסוף ~ 25 עוברים דגי זברה.</li>
		<li>בצע dechorionation ידני באמצעות 1 מ"ל מחטי אינסולין ולהוסיף אותם 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge.</li>
		<li>יש להשליך את מדיום העובר בזהירות ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ ליזה קר כקרח (20 מ"מ נתרן פוספט (pH 6.8), 1% טריטון X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) עם קוקטייל מעכב פרוטאז ולהכין חלבון ליזט על ידי סוניקציה.</li>
		<li>להמיס את lysates ב 1 מ"ל של 1 N NaOH ולדגור את הדגימות ב 100 ° C במשך 50 דקות באמבט מים. מערבולת זה לסירוגין הומוגניזציה של lysates לחלוטין.</li>
		<li>בצע קריאות ספיגה של הדגימות ב- 490 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.</li>
		<li>חשבו את תכולת המלנין על-ידי השוואת ספיגת הדגימה לעקומה סטנדרטית של ריכוזים ידועים של מלנין סינתטי (איור 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. ספירת מלנופורים
הערה: ניתוח פלואורסצנטי בעוברים של דגי זברה טרנסגניים יכול להיעשות בשתי שיטות: 1) ספירת תאים חיוביים ל- GFP; 2) מדידת עוצמת פלואורסצנטיות.
<ol><li>הכנה לספירה מבוססת FAC של תאים חיוביים ל-GFP בעוברים מוקדמים של דגי זברה<ol><li>אספו עוברים בגודל 200-250 ftyrp:GFP ושטפו אותם במסננת באמצעות מי עוברים רגילים. כבקרה שלילית, יש לעבד עוברי בר שליליים ל-GFP ומותאמים לשלב (Assam Wildtype)12.</li>
		<li>בהתבסס על שלב העניין, להעביר את העוברים לצלחת פטרי המכילה 0.6 מ"ג / מ"ל pronase. לאחר 5-10 דקות, באמצעות פיפטה של פסטר, מעבירים את העוברים המפורקים לצלחת פטרי טרייה המכילה מי עובר רגילים. באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, לאסוף ~ 100 עוברים ולהעביר אותם צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל.</li>
		<li>יש להשליך את התווך בזהירות ולהוסיף 200 מיקרוליטר של תמיסת רינגר קרה כקרח (חיץ החלמון). שומרים את הצינור על קרח, פיפטה את התוכן למעלה ולמטה ~ 20 פעמים עד החלמון מומס. צנטריפוגה את הצינורות ב 100 × גרם למשך דקה אחת בצנטריפוגה שולחנית ב 4 ° C. שוב צנטריפוגה ובזהירות להשליך את הסופרנטנט.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, מעבירים את העוברים החלמונים לצלחת פטרי המכילה 10 מ"ל של תמיסת טריפסין (מאגר דיסוציאציה של תאים). בצעו אותו בצלחות פטרי מרובות כדי למנוע צפיפות יתר של העוברים וטריפסיניזציה לא יעילה. השתמש פיפטה 1 מ"ל, לערבב את התמיסה המכילה את גוף העובר פעם או פעמיים כדי להקטין את הצבירה.</li>
		<li>יש לדגור על צלחות הפטרי בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (<24 עוברי HPF) או 30 דקות (24-30 עוברי HPF). שאפו ושחררו את התרחיף מדי פעם באמצעות פיפטה של 1 מ"ל כדי לסייע להתפוררות התאים.</li>
		<li>במהלך תקופת הדגירה, אתחל את מכונת ציטומטר הזרימה לספירת תאים.</li>
		<li>מניחים מסננת תאים של 70 מיקרומטר מעל צינור חרוטי של 50 מ"ל ומעבירים את המתלה הטריפסיני דרך המסננת כדי לקבל תרחיף חד-תאי. שטפו את כלי הפטרי עם אותו תרחיף כמה פעמים כדי להסיר תאים שנצמדו לפני השטח.</li>
		<li>סובב את הדגימות ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות ברוטור דלי מתנדנד.</li>
		<li>השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט 1x קר כקרח (PBS).</li>
		<li>סובבים שוב ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות ו להשליך את supernatant.</li>
		<li>לבסוף, יש להשעות מחדש את הגלולה בסרום PBS + 5% בקר עוברי ולשמור אותה על קרח עד להפעלת FACS.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת ציטומטר הזרימה<ol><li>הפעל את ציטומטר הזרימה והתחל בהפעלה. הערה: לפני הפעלת המכונה, רוקן את פח האשפה ומלא את מיכל נוזל הנדן.</li>
		<li>נרמל את זרימת הנחל עבור זרבובית 70 מיקרומטר (או 85 מיקרומטר). השאירו אותו ללא הפרעה למשך 10-15 דקות אם הוא לא יציב.</li>
	</ol></li>
	<li>ספירת תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות ציטומטר זרימה<ol><li>אתחל תיקיית ניסוי חדשה וצור תרשים פיזור של פיזור קדימה לעומת פיזור צדדי והיסטוגרמה של עוצמת איזותיוציאנט פלואורסצאין (FITC).</li>
		<li>טען תחילה את התאים מסוג Wild כדי להגדיר את שערי הפיזור קדימה וצדדית (כדי לא לכלול כפילים ופסולת) ואת סף FITC.</li>
		<li>לאחר הגדרת השערים, הסר את הדגימה וטען את התאים שבודדו מעוברים Tg (ftyrp1:GFP) כדי לספור מלנוציטים. הערה: כאן, מכיוון ש - ftyrp1:GFP מסמן באופן ספציפי מלנוציטים בוגרים, מספר התאים החיוביים ל- GFP מתחת לשער FITC יתאים למספר המלנוציטים.</li>
		<li>חזור על השלב לעיל עם דגימות מוזרק מורפולינו כדי להעריך ולהשוות את מספר המלנוציטים עם הביקורת.</li>
	</ol></li>
	<li>מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות בעוברים של דגי זברה<ol><li>בעזרת פיפטה מזכוכית פסטר אוספים 100-120 עוברים ומעבירים אותם לצלחת פטרי המכילה מי עוברים רגילים.</li>
		<li>ב ~ 10-12 hpf, להעביר את העוברים ל 0.003% 1-phenyl-2-thiourea כדי לעכב פיגמנטציה.</li>
		<li>ביצוע דכוריונציה ידנית באמצעות מחטי אינסולין להדמיית <48 עוברי HPF.</li>
		<li>כדי לשתק עוברים, לטפל בהם עם 0.016% טריקאין.</li>
		<li>כדי להרכיב עוברים להדמיה, לשים כמה מ"ל של 1.5-2% methylcellulose בצלחת פטרי (60 מ"מ) כך שהוא יוצר שכבה דקה. הוסף את העוברים למתילצלולוז כדי להגביל כל תנועה נוספת במהלך ההדמיה. הניחו את צלחת הפטרי המכילה את הדגימות מתחת למיקרוסקופ. באמצעות קצה פיפטה, להתאים את החיה בכיוון הרצוי.</li>
		<li>רכוש תמונות באמצעות תוכנת הרכישה. עבור עוברים <24 hpf, ללכוד את כל העובר בבת אחת תחת הגדלה פי 10. עבור שלבי >24 HPF, רכוש שדות סריקה מרובים ולאחר מכן הרכיב (תפר) אותם יחד.</li>
		<li>חזור על כך עם כל הדגים וודא שההגדרה לרכישה נשארת קבועה לאורך כל הניסוי.</li>
	</ol></li>
	<li>כימות<ol><li>נתח את התמונה עוד יותר באמצעות תוכנת ImageJ.</li>
		<li>פתחו את התמונה לכימות ב-ImageJ באמצעות הכלי Open .</li>
		<li>השתמשו בכלי צורת היד החופשית כדי לשרטט את האזור לניתוח (איור 3E).</li>
		<li>הקש M (או נתח | מדידה) כדי לקבל מדידת עוצמת שטח שנבחר .</li>
		<li>שמירה על השטח לניתוח קבוע, לחשב את העוצמה הממוצעת לכל אזור עבור כל חיה בנפרד.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kelsh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+evolution+of+pigment+patterns+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Genetics and evolution of pigment patterns in fish.</a> Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).</li>
<li>Jablonski, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+human+skin+and+skin+color%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Anthropology%22%5BJournal%5D)">The evolution of human skin and skin color.</a> Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).</li>
<li>Hoekstra, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+development+and+evolution+of+adaptive+pigmentation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates.</a> Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).</li>
<li>Quigley, I. K., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment+pattern+formation+in+zebrafish%3A+a+model+for+developmental+genetics+and+the+evolution+of+form%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form.</a> Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).</li>
<li>Meyers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+development+of+a+vertebrate+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: development of a vertebrate model organism.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19(2018).</li>
<li>Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+melanophore+development+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos.</a> Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).</li>
<li>Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development%3A+insights+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Neural crest development: insights from the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).</li>
<li>Carney, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+role+for+Sox10+in+specification+of+neural+crest-derived+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons.</a> Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).</li>
<li>Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxd3+controls+melanophore+specification+in+the+zebrafish+neural+crest+by+regulation+of+Mitf%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf.</a> Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).</li>
<li>Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fugu+tyrp1+promoter+directs+specific+GFP+expression+in+zebrafish%3A+tools+to+study+the+RPE+and+the+neural+crest-derived+melanophores%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores.</a> Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).</li>
<li>Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microinjection into zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 125-132 (1999).</li>
<li>Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon+for+efficient+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery.</a> Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).</li>
<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for morpholino use in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 13 (10), 1007000(2017).</li>
<li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progress+of+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+in+generating+mouse%2Fzebrafish+models+of+human+skeletal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).</li>
<li>Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+eumelanin+and+pheomelanin+markers+in+diverse+biological+samples+by+HPLC-UV-MS+following+solid-phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction.</a> PLoS One. 14 (10), 0223552(2019).</li>
<li>Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+quantification+of+melanin%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent quantification of melanin.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. 29 (6), 707-712 (2016).</li>
<li>Hultman, K. A., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+direct-developing+and+stem+cell-derived+melanocytes+to+the+zebrafish+larval+pigment+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern.</a> Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).</li>
<li>Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+melanocyte+lineage+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The melanocyte lineage in development and disease.</a> Development. 142 (4), 620-632 (2015).</li>
</ol>

כל המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

פנוטיפ פיגמנטציה מתבטא לעיתים קרובות כשינויים בתכולת המלנין או במספר המלנוציטים נושאי הפיגמנט. השיטה המתוארת כאן מאפשרת דיסקציה של דיכוטומיה זו ומאפשרת הערכה איכותית וכמותית של תכולת המלנין ומספר המלנופורים לעובר, ללא קשר לתכולת המלנין. הפריון הגבוה של דגי הזברה, הטבע הנראה לעין של מלנוציטים פיגמנטיים והיעדר העברת מלנוזום מאפשרים דיסקציה של ביולוגיה של מלנוציטים באמצעות גישה גנטית הפוכה זו המקובלת על בדיקות סקר בתפוקה בינונית.
הבחירה בהשתקה על בסיס מורפולינו נובעת מקלות ההשתקה ומהיכולת לבחון מ...

בעוד שהשימוש במלנין להגנה מפני אור התפתח מספר פעמים ברחבי ממלכת החי, נראה כי בעלי חוליות שכללו את התהליך. תאים ייעודיים מייצרי פיגמנט עם מנגנון משוכלל לסנתז ולהכיל מלנין נשמרים מדגים לבני אדם1. עם זאת, התוצאה של פיגמנטציה היא מגוונת באופן דרמטי, נע בצבע כדי הדדיות ומציג דפוסים חיים על אינטגמנטים, העור, ושיער2. למרות הגיוון, רפרטואר הגנים המעורבים בתגובת פיגמנטציה נשמר להפליא. מרכיבי הליבה של מנגנון סינתוז המלנין, כגון אנזימי המפתח המסנתזים מלנין, מרכיבי המלנוזומים, והקישוריות במעלה הזרם למסלול האיתות, נשארים זהים במהותם בין אורגניזמים. הבדלים גנטיים עדינים מביאים לשינויים דרמטיים בדפוסי הפיגמנטציה שנצפו בין מינים3. לפיכך, גישה גנטית הפוכה באורגניזם בעל חוליות נמוך יותר, דג הזברה (Danio rerio), מציעה הזדמנות מצוינת לפענח את מעורבות הגנים בהפיכת מצב פיגמנטי4.
עוברים של דגי זברה מתפתחים מזיגוטה מופרית חד-תאית לזחל בטווח של ~24 שעות לאחר ההפריה (HPF)5. באופן מדהים, התאים המקבילים למלנוציטים - המלנופורים - הם תאים גדולים הנמצאים בדרמיס ובולטים בשל תכולת המלנין הכהה6. תאים עצביים אלה שמקורם בסמל העצבי נובעים ~ 11 hpf ומתחילים פיגמנט ~ 24 hpf 6,7. מודולי ביטוי גנים שמורים אפשרו זיהוי של גורמי מפתח המתזמרים תפקודי מלנוציטים והובילו לפיתוח קווי כתב פלואורסצנטיים טרנסגניים Tg(sox10:GFP), Tg (mitfa:GFP) ו- Tg (ftyrp1:GFP)8,9,10 המסמנים שלבים סלקטיביים של התפתחות מלנוציטים. שימוש בקווי דגים טרנסגניים אלה מאפשר לחקור את הביולוגיה התאית של מלנוציטים ברמת האורגניזם בהקשר הרקמתי עם רמזים מתאימים בהתאם לצירי הזמן ההתפתחותיים. כתבים אלה משלימים כימות מבוסס פיגמנט של מלנוציטים ומאפשרים הערכה ברורה של מספרי המלנוציטים ללא קשר לתכולת המלנין.
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לפענוח הביולוגיה של מלנוציטים על ידי הערכת שני פרמטרים קריטיים, כלומר תכולת המלנין ומספרי המלנוציטים. בעוד הראשון הוא קריאה פונקציונלית נפוצה הנובעת מתגובת היפופיגמנטציה, האחרון קשור לירידה במפרט או הישרדות של מלנוציטים והוא קשור לעתים קרובות עם תנאי פיגמנטציה גנטיים או נרכשים. האסטרטגיה הכוללת של מסך גנטי הפוך זה היא להשתיק גנים נבחרים באמצעות מורפולינו ולחקור את התוצאות הספציפיות למלנוציטים. תוכן המלנין מנותח באמצעות כימות מבוסס תמונה של ערכים אפורים ממוצעים, ולאחר מכן אישור באמצעות בדיקת תוכן מלנין. מספר המלנוציטים בשלבים שונים של הבשלה מנותח באמצעות כימות מבוסס תמונה ומאושר עוד יותר באמצעות ניתוח FACS. כאן, פרוטוקול הסינון מודגם באמצעות שני גנים מועמדים, כלומר פחמן אנהידראז 14, המעורב במלנוגנזה, ווריאנט היסטון H2AFZ.2 המעורב באפיון מלנוציטים מאוכלוסיית קודמני הפסגה העצבית. בעוד הראשון משנה את תכולת המלנין ולא את מספרי המלנוציטים, האחרון משנה את מספר המלנוציטים שצוינו, וכתוצאה מכך, את תכולת המלנין בעובר. בסך הכל, שיטה זו מספקת פרוטוקול מפורט לזיהוי תפקידו של גן מועמד בפיגמנטציה ולהבחנה בין תפקידו בשליטה על מספרי המלנוציטים לעומת תכולת המלנין.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו-צינורות</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-A</td><td>להכנת תמיסת MO</td></tr><tr><td>2 מ"ל מיקרו-צינורות</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td>לשלבי כביסה בפרוטוקול FACS</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9539-500G</td><td>למיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td>למיון תאים</td></tr><tr><td>צינור נימי</td><td>Drummond</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאי קורנינג</td><td>קורנינג</td><td>CLS431751</td><td>להכנת תרחיף תאים בודדים</td></tr><tr><td>DMEM מדיה גבוהה של גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5648</td><td>פרוטוקול FACS</td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונאט (טריקאין)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E10521-50G</td><td>לקיבוע ZF להדמיית</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית דיסודיום מלח דיהידראט (EDTA)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E5134</td><td>עבור מאגר ליזה קרה</td></tr><tr><td>צינורות FACS</td><td>BD-Biosciences</td><td>342065</td><td>פרוטוקול FACS</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Invitrogen</td><td>10270</td><td>פרוטוקול FACS</td></tr><tr><td>Graphpad פריזמה תוכנה</td><td>Graphstats Technologies</td><td>NA</td><td>לייצוג נתונים</td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ</td><td>המכון הלאומי לבריאות</td><td>NA</td><td>לניתוח תמונה</td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין (1 מ"ל)</td><td>DispoVan</td><td>NA</td><td>לפירוק ידני</td></tr><tr><td>מלנין,</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td> סינתטי <td>M8631</td><td>לבדיקת תכולת מלנין</td></tr><tr><td>מתיל צלולוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M7027-250G</td><td>לקיבוע ZF להדמיה</td></tr><tr><td>קצות מיקרו-טוען</td><td>אפנדורף</td><td>5242956003</td><td>למיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>מורפולינו</td><td>כלי גן</td><td>NA</td><td>לניסויים נוק-דאון</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>לעיכוב היווצרות מלנין</td></tr><tr><td>מושך מחט</td><td>מכשיר סאטר</td><td>P-97</td><td>למיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>Nunc 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטריליים חרוטיים מפוליפרופילן</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>פרוטוקול FACS</td></tr><tr><td>Petridish (60 מ"מ)</td> <td>Tarsons</td><td>460090</td><td>עבור צלחות עובר</td></tr><tr><td>פניל מתיל-סולפוניל פלואוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>10837091001</td><td>למאגר ליזה קר</td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלח (PBS)</td> <td>HiMedia</td><td>TL1099-500 מ"ל</td><td>לשטיפת תאים</td></tr><tr><td>פרונאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>53702</td><td>לניקוי כושרון</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8340</td><td>לנדן מאגר ליזה קרה</td></tr><tr><td> נוזל</td><td>BD FACSFlowTM</td><td>342003</td><td>פרוטוקול FACS</td></tr><tr><td>נתרן פוספט</td><td>Merck</td><td>7558-79-4</td><td>מאגר ליזה קרה</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td>למאגר ליזה קרה</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>1677119</td><td>לטריפסיניזציה</td></tr></tbody></table>

גישה גנטית הפוכה לזיהוי מווסתי פיגמנטציה באמצעות דגי זברה

Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

מלנוציטים הם תאים מיוחדים שמקורם בפסגה עצבית הנמצאים בעור האפידרמיס. תאים אלה מסנתזים פיגמנט מלנין המגן על הגנום מפני קרינה אולטרה סגולה מזיקה. הפרעות בתפקוד המלנוציטים מובילות להפרעות פיגמנטריות כגון פיבלדיזם, לבקנות, ויטיליגו, מלזמה ומלנומה. דג זברה הוא מודל מצוין להבנת תפקודי מלנוציטים. נוכחותם של מלנוציטים פיגמנטיים בולטים, קלות המניפולציה הגנטית והזמינות של קווים פלואורסצנטיים טרנסגניים מקלים על חקר הפיגמנטציה. מחקר זה משתמש בקווי דגי זברה מסוג בר ודגי זברה טרנסגניים המניעים ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת מקדמי Mitfa ו - tyrp1 המסמנים שלבים שונים של מלנוציטים. 
השתקה מבוססת מורפולינו של גנים מועמדים מושגת כדי להעריך את התוצאה הפנוטיפית על פיגמנטציה של הזחל והיא ישימה לסינון מווסתי פיגמנטציה. פרוטוקול זה מדגים את השיטה ממיקרו-הזרקה לדימות ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) מבוסס נתיחה של פנוטיפים באמצעות שני גנים מועמדים, פחמן אנהידראז 14 (Ca14) וגרסת היסטון (H2afv), כדי להעריך באופן מקיף את תוצאת הפיגמנטציה. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים הפרדת גנים מועמדים למפרטים ומבדילים של מלנוציטים המשנים באופן סלקטיבי את מספרי המלנוציטים ואת תכולת המלנין בכל תא, בהתאמה.

תהליך העבודה המתואר באיור 1 שימש לביצוע הפרעה גנטית מבוססת מורפולינו בשלב החד-תאי של דג הזברה. ניתוח פיגמנטציה בוצע בשיטות שונות, כמפורט להלן. כדי להמחיש את התוצאות המייצגות, הוזרקו כמויות מתוקננות של אנטיסנס מורפולינו המכוון לגנים h2afv ו-ca14 בשלב החלמון או התא האחד של עובר דג הזברה. הפנוטיפ הראשוני המבוסס על הדמיית שדה בהיר בוצע 48 שעות לאחר ההפריה (HPF), כאשר כל חמשת פסי המלנופור הפיגמנטיים (גבי, גחוני, חלמון, שניים רוחביים) היו ברורים.
<stro...

רגולטורים של פונקציות מלנוציטים שולטים בהבדלים גלויים בתוצאות הפיגמנטציה. פענוח הפונקציה המולקולרית של גן הפיגמנטציה המועמד מציב אתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש במערכת מודל דגי זברה כדי לזהות מועמדים ולסווג אותם לווסתים של תכולת המלנין ומספר המלנוציטים.

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from ...

פרוטוקול זה הוא מיזוג של טכניקות שונות שיאפשרו לחוקרים לשרטט את תפקיד הגן המועמד בביולוגיה של המלנוציטים. זוהי גישה הוליסטית להשגת היסק לוגי. על ידי שילוב שיטות שונות, ניתן להימנע מגורמים מבלבלים וזה יכול לעזור לחוקרים להשיג תוצאה משמעותית.כדי להתחיל את הניתוח, לשתק את 48 עוברי HPF עם 0.016% tricaine. הרכיבו את העוברים באמצעות כמה מיליליטרים של 1.5% עד 2% מתיל צלולוז בצלחת פטרי. בחר את העוברים עם פיפטה פסטר ומניחים אותם במתיל צלולוז כדי להגביל את התנועה במהלך ההדמיה.להדמיה רוחבית או גבית אופטימלית, התאימו את מיקומם בהגדלה של יותר מפי 5. מניחים את צלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ. באמצעות מניפולטור, להתאים את הדג כך שכל חמשת הפסים העובריים מלנוציטים נראים בו זמנית.באמצעות תוכנת הרכישה, ללכוד את התמונות. אם הדג מתעורר, הכניסו אותו למי טריקאין עד שהוא מתייצב. באמצעות הכלי הפתוח בתוכנת ImageJ, פתח את התמונה לכמת.בחרו בכלי צורה חופשית כדי לשרטט את האזור לניתוח. בחר באפשרות הגדר מידות, לחץ על הערך האפור הממוצע ולאחר מכן על האזור. כדי לחשב את הערך האפור הממוצע עבור האזור שנבחר, לחץ על M או עבור לנתח ולבחור מדידה.בהתבסס על שלב העניין, להעביר את העוברים לצלחת פטרי המכילה 0.6 מיליגרם למיליליטר Pronase. בעזרת פיפטה של פסטר, מעבירים את העוברים המפורקים לצלחת פטרי המכילה מי עובר רגילים לאחר חמש עד 10 דקות. בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית, אוספים ומעבירים כ-100 עוברים לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר.השליכו את המדיום והוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת רינגרס חלמון קרה כקרח. מניחים את הצינור על קרח ומערבבים את התוכן בערך 20 פעמים עם פיפטה כדי להמיס את העול. צנטריפוגו את הצינורות ב-100 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס פעמיים, והשליכו את הסופרנטנט.מעבירים את העוברים החלמונים באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד בצלוחית פטרי המכילה 10 מיליליטר של תמיסת טריפסין. מערבבים את התמיסה פעם או פעמיים באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד כדי להקטין את הצבירה. מעבירים את התרחיף הטריפסיני דרך מסננת של 70 מיקרומטר המונחת על צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי לאסוף תרחיף תא בודד.שטפו את צלחות הפטרי עם ההשעיה הטריפסינית כדי להסיר את התאים המודבקים מפני השטח. לספירת התאים המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות ציטומטר זרימה, לאחר יצירת תיקיית ניסוי חדשה, ציירו תרשים פיזור קדימה לעומת צד. לעשות היסטוגרמה עבור עוצמת isothiocyanate fluorescein.טען תחילה את תאי הסוג הפראי כדי להגדיר את שערי הפיזור קדימה וצדדית ואת סף FITC. לאחר מכן, טען את התאים שבודדו מעוברי קו FTYRP GFP טרנסגניים כדי לספור את המלנוציטים. הרכיבו את העוברים ב-1.5% עד 2% מתיל צלולוז בצלחת פטרי.מניחים אותו מתחת למיקרוסקופ ומתאימים אותו בכיוון הרצוי באמצעות קצה פיפטה. באמצעות תוכנת הרכישה, לרכוש את התמונות. עבור עוברים פחות מ 24 HPF, באמצעות הגדלה פי 10, ללכוד את התמונה כולה, ואילו עבור עוברים מעל 24 HPF, לרכוש שדות סריקה מרובים ולאחר מכן להרכיב אותם.לאחר ביצוע הבדיקה, ההדמיה של ברייטפילד לאחר 48 שעות חשפה את נוכחותם של כל חמשת פסי המלנופור הפיגמנטיים. בשלב 48 HPF חושב מספר המלנופורים הצדיים ונמצא כי וריאנט ההיסטון h2afv morphants הדגים מספר מופחת של מלנופורים בהשוואה לקבוצת הביקורת. הערך האפור הממוצע נמדד עבור מורפנטים CA14 ו-h2afv, מה שגילה כי הערכים היו גבוהים יותר עבור הווריאנטים מאשר מורפנטים של קבוצת הביקורת.על ידי שימוש בשיטת ספיגה ספקטרופוטומטרית מבוססת נתרן הידרוקסידי, כומתה תכולת המלנין כאשר מורפנטים CA14 הראו פחות תוכן מאשר מורפנטים בקרה. הדמיה פלואורסצנטית בוצעה כדי להעריך שינוי מבוסס מורפולינו עבור שלבים שונים של התפתחות מלנופור דגי זברה. מספר המלנופורים במורפנטים CA14 ו-h2afv נותח באמצעות FACS.נצפה כי מספר המלנופורים ב- CA14 נותר ללא שינוי, בעוד שהם הופחתו באופן משמעותי ב- h2afv בהשוואה למורפנט הביקורת. כמו כן חושבה עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לאזור, מה שמראה כי מורפנטים h2afv מראים ירידה ניכרת בערך ביחס למורפנטי ביקורת. בעת התאמת הדג לפני ההדמיה, ודא שאתה יכול לדמיין את כל חמשת הפסים המלנופוריים.אתה צריך להטות את הדג קצת כדי להבחין בין שני פסים לרוחב. לאחר ביסוס תפקידו של גן מועמד בהתפתחות מלנוציטים, אנו יכולים לחסל את הגן באופן ספציפי לרקמה באמצעות טכנולוגיית CRISPR. זו תהיה גישה ממוקדת יותר.

reverse-genetic-approach-to-identify-regulators-pigmentation-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדגימים את הגישה שלנו למציאת פוטנציאל משפר אלמנטים מן הגנים מוסדר מבחינה התפתחותית והערכה תפקידם דרך transgenesis דג הזברה פסיפס.

דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

דרך מהירה למסך למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה מוצגת. הוא מנצל את וקטור miniCoopR המאפשר ביטוי של גנים מלנומה מועמד במלנוציטים. שיטה להשיג עקומות מלנומה ללא הישרדות, assay פלישה, פרוטוקול למכתים נוגדן של מלנוציטים קנה המידה וassay השתלה מלנומה מתוארת.

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.

הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

דג זברה שימשו מודל גנטי אמין האורגניזמים במחקר ביו-רפואי, במיוחד עם כניסתו של טכנולוגיות לעריכת ג'ין. כאשר הזחל פנוטיפים צפויים, זיהוי ה-DNA החילוץ, גנוטיפ יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים הליך genotyping יעיל עבור הזחלים דג זברה, מאת הזנב מסיכה, מוקדם ככל 72-h שלאחר ההפריה.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

כאן אנו מציגים שיטה לדימוי המוח העוברי של דג הזברה בשלבים של זחלים ונוער. הליך מיקרו-פולשני זה, המותאם מגישות אלקטרופיזיולוגיות, מספק גישה לפרטים תאיים ותת-תאיים של נוירון בוגר וניתן לשלבו עם אופטוגנטיקה ומחקרים נוירופרמקולוגיים לאפיון תפקוד המוח והתערבות תרופתית.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה להסרה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) באמצעות מודל של דגי זברה מהונדסים. התאמת הפרוטוקול לשילוב אפנון מסלול איתות באמצעות תרכובות פרמקולוגיות מפורטת בהרחבה. פלטפורמת MATLAB לכימות התחדשות RPE המבוססת על פיגמנטציה פותחה והוצגה ונדונה.

ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע עריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM כדי לבנות מודל מדויק של מחלת דגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e.

עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e

חקור את תפקידם של גנים מועמדים בביולוגיית מלנוציטים באמצעות דגי זברה. שיטה זו משלבת דימות, ציטומטריית זרימה ומדידות מלנין כדי לזהות ווסתים של פיגמנטציה.

גישה גנטית הפוכה לזיהוי מווסתי פיגמנטציה באמצעות דגי זברה

גלה סרטונים נוספים