Name: הדמיה של תאים חיים של פעילות תמלול בהפסקות דו-סטרנד DNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: למד שיטה לזיהוי תמלול בודד ברמת מולקולה בודדת בהפסקות דו-סטרנד DNA בתאים חיים. הטכניקה משתמשת במיקרוסקופיית פלואורסצנציה כדי לחקור את הקשר בין נזק DNA לתהליכי תמלול בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לזינגר RH, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca על מתנות של פלסמידים וריאגנטים. אנו גם אסירי תודה לצוות מתקן הביו-הדמיה של IMM, א. טמודו, א. נסימנטו וג'יי רינו, לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי PTDC / MED-OUT / 32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 ו-PTDC/MED-OUT/4301/2020 מ Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), פורטוגל ועל ידי LISBOA-01-0145-FEDER-007391, פרויקט במימון משותף של FEDER דרך POR Lisboa, פורטוגל 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa ו- FCT. המימון התקבל גם מתוכנית המחקר והחדשנות של האיחוד האירופי Horizon 2020 (RiboMed 857119). תואר שני הוא מקבל מלגת FCT לדוקטורט 2020.05899.BD.

1. הכנה וזיהוי של תאים למיקרוסקופיה של תאים חיים
<ol><li>הכן בקבוקון תרבית תאים בגודל 25 ס"מ2 של קו התאים של הכתב (EX2, EX2-AS או PROM) עם 5 מ"ל של DMEM כדי להשיג השפעה של 80-90% ביום שלפני ניסוי המיקרוסקופיה של התא החי.</li>
	<li>שאפו את המדיום עם פיפטה מבקבוק תרבית התאים 25 ס"מ2 ושטפו את התאים עם 2.5 מ"ל של 1x PBS.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.05%) ודגרה ב 37 °C (2-3 דקות עבור ניתוק התא.</li>
	<li>לאחר ניתוק התא, להוסיף 4 מ"ל של DMEM ללא פנול אדום המכיל חיץ HEPES, בתוספת 10% (v/ v) סרום בקר עוברי מופשט פחם, בעדינות resuspend התאים.</li>
	<li>צלחת 1 מ"ל של פתרון התא בצלחת עגולה 35 מ"מ עם 10 מ"מ זכוכית תחתון באר (קוטר מס '1.5) הומוגניזציה. אחסן את המנה העגולה בקוברות 35 מ"מ בתוך צלחת תרבית תאים סטנדרטית של 100 מ"מ ודגר אותה ב-37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2.</li>
	<li>~ 6 שעות לאחר זריעה, לבצע את ההדבקה של התאים בצלחת התחתונה של הזכוכית. עבור כל תערובת טרנספקטו, הכינו שני פתרונות באופן הבא:<ol>
<li>בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, להכין פתרון A המכיל 150 μL של מדיום חיוני מינימלי בסרום מופחת (MEM), DNA plasmid (כמתואר בטבלה 1), ו 2.5 מיקרוגרם / μL של DNA של ריאגנט עוזר טרנספקטי (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>במקביל, להכין פתרון B, המכיל 150 μL של MEM בסרום מופחת ו 1.5 מיקרוגרם / μL DNA של ריאגנט transfection מבוסס שומנים (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>לדגור על שני הפתרונות בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות את פתרון A לפתרון B ודגרו 20 דקות ב-RT.</li>
		<li>כדי להעביר את התאים, להוסיף 300 μL של פתרון A + B dropwise לכל מנה ולהפיץ בעדינות. לאחסן את צלחת התחתונה זכוכית בתוך צלחת תרבית תאים סטנדרטית 100 מ"מ ודגור אותו ב 37 °C (5 °F) באווירה לחה עם 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל עם 200 μL של DMEM עם HEPES, ללא פנול אדום בתוספת 10% (v / v) סרום בקר עוברי מופשט פחם ולהוסיף ת"א לריכוז של 7.5 x 10-7 M.</li>
</ol>2. התקנה ניסיונית
<ol><li>הגדר את הטמפרטורה של תא הדגירה הגדול של מיקרוסקופ פרספקס ותא הדגירה של השלב העליון ל -37 מעלות צלזיוס ביחידת הבקרה המשותפת. הגדר את התנאים הסביבתיים בתוך תא הדגירה של הבמה ל-5% CO2 ו-100% לחות. הערה: יש להגדיר את כלוב המיקרוסקופ וטמפרטורת האינקובטור של השלב לפחות שעה אחת לפני תחילת הניסוי כדי לאפשר חימום של המערכת השלמה כדי למזער את תנודות הטמפרטורה. הפעל את כל יחידות בקרת המיקרוסקופ האחרות בו-זמנית.</li>
	<li>לגרום את התמלול של הגנים הכתב על ידי הוספת דוקסיציקלין (0.5 מיקרוגרם / מ"ל) למדיום הצמיחה ולערבב בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה עם micropipette 200 μL ~ 1 שעה לפני תחילת התצפית מיקרוסקופיה. הערה: שמור את צלחת תחתית הזכוכית עם התאים transfected הוא בתוך צלחת תרבית תאים סטנדרטית 100 מ"מ לטיפול קל והובלה מתרבית התא לחדר המיקרוסקופ במיכל קלקר כדי לשמור על הטמפרטורה יציבה ככל האפשר.</li>
	<li>להעביר את התאים למיקרוסקופ לפחות 30 דקות לפני תחילת התצפית ועם ההגעה, מניחים את צלחת 100 מ"מ עם התאים מיד בתוך תא הדגירה מיקרוסקופ גדול מחומם מראש.</li>
	<li>מניחים את צינור המיקרוצנטריפוגה עם ת"א מדוללת מראש מהשלב 1.7. בתוך התא הסביבתי המיקרוסקופ הגדול כדי להתחמם עד 37 °C (70 °F).</li>
	<li>החליפו את המכסה של צלחת הזכוכית התחתונה בדומה לזו שהוכנה בעבר בחור בקוטר 3 מ"מ שנקדח במכסה (איור 2A). הערה: ת"א תתווסף מאוחר יותר לתאים דרך החור הקטן במכסה מבלי לתמרן את המנה המותקנת על במת המיקרוסקופ.</li>
	<li>בחר את המטרה טבילת שמן 100x (אובייקט אפוכרומטי, 1.4 צמצם מספרי) בלוח הבקרה של המיקרוסקופ. החל טיפה של שמן טבילה על המטרה.<ol>
<li>מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה עם התאים בתוך תא הדגירה של שלב המיקרוסקופ ונעלו אותה במקומה. סגור את המכסה של חממת הבמה ואת כל הדלתות של דיור מיקרוסקופ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל את תוכנת ההפעלה והבקרה של המיקרוסקופ, פתח את החלון בקרת מיקוד (איור 2B), לחץ על החלונית טווח ובחלונית בחירת פליטה , לחץ על התיבה 100% עין כדי להגדיר את נתיב הקרן העין לתצפית מדגם ישיר בעין.<ol>
<li>בתפריט ערכת מסננים , עבור לסט מסנן עין ולחץ על ברייטפילד ולחץ על לחצן פתח את ברייטפילד .</li>
	</ol>
</li>
	<li>הזז את מטרת המיקרוסקופ לכיוון צלחת התחתונה של הזכוכית עד שהשמן נוגע בכוס. ואז להסתכל דרך המשקפת ולהתמקד באופן ידני במישור של התאים. כבה את לחצן פתח את ברייטפילד .</li>
	<li>השאירו את התאים למשך 30 דקות לפני תחילת התצפיות הניסיוניות כדי להסתגל לתנאים סביבתיים ולמנוע סחף מוקדי במהלך הדמיה על ידי שיפועי טמפרטורה.</li>
	<li>מניחים מיקרופיפט 200 μL 200 טיפים מסנן μL מוכן לשימוש בצד בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>3. רכישת תמונות
<ol><li>בחלון 'בקרת מיקוד' של תוכנת בקרת המיקרוסקופ, הגדר את עוצמת הלייזר ל-5% והזן ערך של 50 אלפיות שני לזמן החשיפה (איור 2B).</li>
	<li>פתחו את חלון הלכידה כדי להתאים את ההגדרות לביצוע רכישת תמונה אוטומטית של מעידות זמן תלת-ממדיות (איור 2C).</li>
	<li>בחר את סוג רכישת לכידת 3D והגדר 12 עד 16 פרוסות אופטיות המופרדות באמצעות 0.4 מיקרומטר, סמן את תיבות הסימון של טווח סביב הנוכחי וחזר למיקום הנוכחי לאחר הלכידה.</li>
	<li>בחלונית לכידת Timelapse , הזן ערך של 120 עבור # נקודות הזמן ו- 30 שניות עבור מרווח הזמן.</li>
	<li>בחר את מסנן הקונפוקלי שנקבע בהתאם לתוויות חלבון פלואורסצנטיות עם λ = 488 ננומטר עבור GFP, λ = 561 ננומטר עבור TagRFPt, ו - λ = 640 ננומטר עבור iRFP713 והגדר את זמן החשיפה עבור כל ערוץ ל - 50 ms.</li>
	<li>השתמש בהגדרה Current עבור כוח הלייזר כדי להשתמש בערך של 5% שנבחרו בחלון המוקד (איור 2C).</li>
	<li>בחלון 'בקרת מיקוד' , עבור לחלונית 'מצלמה ', בחר בפקד תצוגת התמונה 'שנה קנה מידה ' ובחר בלחצן ידני כדי להגדיר טווח קבוע של עוצמות תמונה שיוצגו. הזן ערכים עבור נמוך: 500 וגבוה: 5000 (ראה איור 2B). הערה: הגדרה זו מגבילה את הטווח הדינמי של לכידת המצלמה המוצגת בתצוגה החיה כדי לבחור תאים באותו טווח של עוצמות פלואורסצנטיות (איור 2D).</li>
	<li>בחר את התאים להדמיה תלת-ממדית של אתרי שעתוק בעת אינדוקציה של DSB. מסך התאים ובחר שלושה שדות תצוגה בהתאם לתנאים המתוארים בדיון.</li>
	<li>התמקד בכל תא שנבחר שהיה ממוקם בעבר במרכז שדה הראייה עם אתר התמלול במישור האמצעי של מחסנית Z. הערה: מיקוד התא ואתר התמלול ב- XYZ מתאים לתנועה מסוימת של התא.</li>
	<li>סמן כל מיקום XYZ בחלונית XY של חלון בקרת מיקוד על-ידי לחיצה על קבע נקודת. הערה: בקר שוב בעמדות שנבחרו 2-3 פעמים במהלך 5 הדקות הבאות כדי לאשר תמלול רציף של הגנים הכתבים ויציבות מיקום יחסית של מיקומי התאים בממדי XYZ.</li>
	<li>הוסף 200 μL של ת"א מדולל מראש מהשלב 1.7. לתאים כפי שמוצג באיור 2F. הערה: הקפיד מאוד לא לגעת בצלחת התחתית של הכוס או במכסה תוך הוספת הת"א כדי למנוע כל תזוזה מעמדות XY המסומנות. לאחר אינדוקציה של DSB, ודא שהתאים מרוכזים בשדה הראייה, ואתר התמלול נמצא במרכז Z-plane. המיקוד מחדש ועדכון המיקום אמורים להימשך לא יותר מ-1-2 דקות.</li>
	<li>התחל את הדמיית סדרת הזמן של 3D על-ידי לחיצה על התחל בחלון לכידה .</li>
	<li>שמור את נתוני ההדמיה בתבנית הנתונים של תוכנת בקרת המיקרוסקופ בכונן הקשיח של מחשב בקרת המיקרוסקופ.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>פתח את נתוני ההדמיה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ וייצוא כקבצים בתבנית TIFF של 16 סיביות.</li>
	<li>פתח את הקבצים המיוצאים באמצעות תוכנת StaQtool21 . בחרו במצב '3D ספוט בודד' וטענו את קובצי התמונה על-ידי הקשה על 'עבור'. הערה: סדרת הזמן שנבחרה נפתחת במציג Timelapse של הקרנה מרבית, המציג הקרנה בעוצמה מרבית של ערימת z של נקודת הזמן הראשונה (איור 3A).</li>
	<li>התאם את תצוגת עוצמת התמונה באמצעות מחוון MAX האנכי בצד שמאל.</li>
	<li>בחר את נקודת הזמן לניתוח באמצעות המחוון האופקי של נקודת זמן .</li>
	<li>רחף עם הסמן למיקום אתר התמלול המסומן בתווית לסימון ידני או לשימוש בפונקציה זיהוי אוטומטי ולחץ באתר התמלול המתאים אם זוהו מספר אובייקטים.</li>
	<li>השתמש בפונקציה מסלול אוטומטי כדי לקבוע את מיקומי XYZ של אתר התמלול לאורך זמן. הערה: אם לא עקבו אחר מיקום נתון כראוי, בחר את אתר התמלול באופן ידני בהתאם למדריך התוכנה StaQtool.</li>
	<li>לחץ על לחצן אוטומטי כדי לבצע את התאמת גאוס עבור כל נקודת זמן ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת (TFI). הערה: אם פעילות התמלול נפסקת, כלי המעקב נשאר במיקום האחרון שבו זוהה אובייקט מוגבל עקיפה (אתר תמלול שכותרתו). אם התא נע בכיוון XY לאחר שתווית אתר התמלול נעלמת, נדרשת מיקום מחדש ידני של ריבוע החיפוש .</li>
	<li>לאחר סיום התאמת ערך TFI עבור כל נקודת זמן, לחץ על לחצן סיום timelapse כדי לסגור את קובץ התמונה הנוכחי של סידרת הזמן ולהמשיך לקובץ הבא. הערה: ערכי TFI מיוצאים ונשמרים באופן אוטומטי בקובץ Excel.</li>
</ol>5. מדידות וניתוח כיול מיקרוסקופי
<ol><li>זרע תאים לתוך 35 מ"מ זכוכית תחתיות מנות ולהעביר עם חלבוני מעיל MS2 ו PP7 מתויגים פלואורסצנטית כמתואר בסעיף 1. הערה: עבור מדידות הכיול, השתמש באותם קווי תאי גן כתב המתוארים במבוא.</li>
	<li>הוסף 0.5 מיקרוגרם /mL של דוקסיציקלין למדיום הצמיחה של התאים 1 שעות לפני תחילת רכישת התמונה microscopy.</li>
	<li>הר את צלחת התחתונה זכוכית בתוך תא הדגירה שלב מיקרוסקופ ולהכין את רכישת התמונה כמו קודם (ראה סעיף 2). הערה: המכסה המקורי של צלחת התחתונה של הזכוכית אינו מוחלף בניסויי הכיול.</li>
	<li>השתמש באותה עוצמת לייזר והגדרות חשיפה כמתואר בנקודה 3.1.</li>
	<li>קבעו את הגדרות הלכידה לסדרות זמן כפולות (בטלו את הבחירה באפשרות תלת-ממד בחלונית 'סוג לכידה ') והגדירו 120 נקודות זמן במרווחי זמן של 500 אלפיות השנייה בחלונית 'לכידת Timelapse ' (איור 2C). הערה: הגדרת רכישת תמונה זו תגרום לסדרת זמן בתוך מישור אופטי יחיד במרווחי זמן קצרים מאוד.</li>
	<li>לרכוש עשרות סדרות זמן כיול ממיקומים מרובים כדי ליצור ערכות נתונים לספור כמה מאות מדידות TFI תעתיקים בודדים.</li>
	<li>לניתוח סידרת זמן הכיול, המר את הקבצים לקבצים בתבנית TIFF של 16 סיביות בהתאם לנקודה 4.1.</li>
	<li>פתח את הקבצים המיוצאים באמצעות תוכנת StaQtool21 (איור 3). לחץ על לחצן בחר קובץ LOG, בחר את קובץ היומן של סידרת הזמן הדו-ממד המתאימה שנרכשה כמתואר בנקודה 4.2.</li>
	<li>בחר בתיבת הסימון נקודות מרובות 2D ולחץ על לחצן GO כדי לטעון את סידרת הזמן לתוכנת הניתוח.</li>
	<li>בחלון מציג Timelapse (איור 3A), ב- PSF FWHM, שדה הקלט מוסיף את הערך המחושב עבור מערכת המיקרוסקופ והמטרה כמתואר21.</li>
	<li>כדי להתחיל בתהליך הניתוח, לחץ על לחצן זיהוי אוטומטי כדי לזהות את כל האובייקטים המוגבלים לעקיפה עבור נקודת הזמן הנוכחית המוצגת. לאחר מכן, לחץ על התאמה אוטומטית כדי לבצע את התאמת גאוס כדי לקבוע את ערך ה- TFI עבור כל אובייקט (איור 3A).</li>
	<li>לחלופין, הצבע על הסמן מעל אובייקט מוגבל עקיפה ולחץ כדי לבחור אותו (מופיע עיגול ירוק בתוך ריבוע לבן) ולחץ על לחצן גאוסיאן Fit לבחירה ידנית ולהליך התאמת גאוס. הערה: מומלץ לא לכלול אובייקטים שאינם נספרים, כגון אתרי תמלול בהירים עם מספר תמלילים המתהווים באותו גרעין.</li>
	<li>לחץ על לחצן סיום הזמן כדי לסיים את השלב הקודם. הערה: התוצאות נשמרות באופן אוטומטי בתבנית קובץ של Microsoft Excel באותה תיקיה שבה נמצא קובץ התמונה.</li>
	<li>הפעל את מודול הפצות TFI ו- W עבור נקודות מרובות על-ידי לחיצה על הלחצן המתאים (איור 3B).</li>
	<li>טען קבצי Excel באמצעות לחצן הוסף קובץ והתחל את ניתוח TFI על-ידי לחיצה על לחצן בצע. הערה: הפלט הוא ערך TFI הממוצע שנקבע ממספר תעתיקים בודדים שנמדדו TFIs.</li>
	<li>התחל את ניתוח W על-ידי הוספת PSF FWHM ששימש בעבר בנקודה 5.10. ולחץ על לחצן עבור באמצעות ערך ברירת המחדל עבור הסל. הערה: הפרמטר W הוא בקרת איכות עבור מדידות TFI תעתיק יחיד כדי לעמוד בערך PSF FWHM הנכון עבור מערכת המיקרוסקופ המשמשת.</li>
</ol>6. מיזוג נתונים וכיול
<ol><li>הזן את ערכי TFI מסדרת הזמן שהתקבלו מגיליון Excel שנשמר בנקודה 4.8. לתוך גיליון Excel חדש ולחלק כל ערך נקודת פעם על ידי TFI הממוצע עבור תמלילים בודדים שהושגו בנקודה 5.15. הערה: לתקנון תהליך זה, נעשה שימוש טפסי תבנית Excel שהוכנו בהתאמה אישית.</li>
</ol>

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Capozzo, I., Iannelli, F., Francia, S., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Express+or+repress%3F+The+transcriptional+dilemma+of+damaged+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Express or repress? The transcriptional dilemma of damaged chromatin.</a> FEBS Journal. 284 (14), 2133-2147 (2017).</li>
<li>Michelini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage-induced+lncRNAs+control+the+DNA+damage+response+through+interaction+with+DDRNAs+at+individual+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Damage-induced lncRNAs control the DNA damage response through interaction with DDRNAs at individual double-strand breaks.</a> Nature Cell Biology. 19 (12), 1400-1411 (2017).</li>
<li>Vítor, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+transcription+at+damaged+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of transcription at damaged chromatin.</a> Science Advances. 5 (1), (2019).</li>
<li>Michalik, K. M., Böttcher, R., Förstemann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+response+at+DNA+ends+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Small RNA response at DNA ends in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 40 (19), 9596-9603 (2012).</li>
<li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+small+RNAs+in+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for small RNAs in DNA double-strand break repair.</a> Cell. 149 (1), 101-112 (2012).</li>
<li>Francia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+DICER+and+DROSHA+RNA+products+control+the+DNA-damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Site-specific DICER and DROSHA RNA products control the DNA-damage response.</a> Nature. 488 (7410), 231-235 (2012).</li>
<li>Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+DNA+double-strand+break+repair%3A+An+ever-growing+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 24(2020).</li>
<li>Alt, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+secreted+and+membrane-bound+immunoglobulin+mu+heavy+chains+is+directed+by+mRNAs+that+differ+at+their+3%27+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synthesis of secreted and membrane-bound immunoglobulin mu heavy chains is directed by mRNAs that differ at their 3' ends.</a> Cell. 20 (2), 293-301 (1980).</li>
<li>Watakabe, A., Tanaka, K., Shimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+exon+sequences+in+splice+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The role of exon sequences in splice site selection.</a> Genes & Development. 7 (3), 407-418 (1993).</li>
<li>Guth, S., Martínez, C., Gaur, R. K., Valcárcel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+substrate-specific+requirement+of+the+splicing+factor+U2AF%2835%29+and+for+its+function+after+polypyrimidine+tract+recognition+by+U2AF%2865%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for substrate-specific requirement of the splicing factor U2AF(35) and for its function after polypyrimidine tract recognition by U2AF(65).</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8263-8271 (1999).</li>
<li>Martin, R. M., Rino, J., Carvalho, C., Kirchhausen, T., Carmo-Fonseca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+visualization+of+pre-mRNA+splicing+with+single-molecule+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Live-cell visualization of pre-mRNA splicing with single-molecule sensitivity.</a> Cell Reports. 4 (6), 1144-1155 (2013).</li>
<li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li>
<li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li>
<li>Chao, J. A., Patskovsky, Y., Almo, S. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+coevolution+of+a+viral+RNA-protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (1), 103-105 (2008).</li>
<li>Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li>
<li>Soutoglou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+stability+of+single+double-strand+breaks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Positional stability of single double-strand breaks in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 675-682 (2007).</li>
<li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096(1994).</li>
<li>Roukos, V., Voss, T. C., Schmidt, C. K., Lee, S., Wangsa, D., Misteli, T. Spatial Dynamics of Chromosome Translocations in Living Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoukos%2C+V+%22Science%22">Science</a>. 341 (6146), New York, N.Y. 660(2013).</li>
<li>Rino, J., de Jesus, A. C., Carmo-Fonseca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STaQTool%3A+Spot+tracking+and+quantification+tool+for+monitoring+splicing+of+single+pre-mRNA+molecules+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">STaQTool: Spot tracking and quantification tool for monitoring splicing of single pre-mRNA molecules in living cells.</a> Methods. 98, 143-149 (2016).</li>
<li>Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-replication+conflict+orientation+modulates+R-Loop+levels+and+activates+distinct+DNA+damage+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription-replication conflict orientation modulates R-Loop levels and activates distinct DNA damage responses.</a> Cell. 170 (4), 774-786 (2017).</li>
<li>D'Alessandro, G., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+and+DNA+Damage%3A+Holding+Hands+or+Crossing+Swords%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription and DNA Damage: Holding Hands or Crossing Swords.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (21), 3215-3229 (2017).</li>
<li>Boulant, S., Kural, C., Zeeh, J. C., Ubelmann, F., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+counteract+membrane+tension+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics counteract membrane tension during clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature Cell Biology. 13 (9), 1124-1131 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

קונפליקטים בין תהליכים ביולוגיים חיוניים כגון שכפול, שעתוק, נזק לדנ"א ותיקון DNA זוהו כמקור קריטי לחוסר יציבות בגנום22. מחקרים אלה הובילו גם לגילוי תמלול באתרים של נזק לדנ"א וייחסו תפקיד תפקודי לתעתיקים הנגרמים על ידי שבירה בוויסות תהליכי תיקון נזקי DNA23. הכלים החדשים והפרוטוקול המתואר כאן מאפשרים חקירה נוספת של דינמיקת התמלול של RNA Pol II ב- DSBs. נקודה קריטית בפרוטוקול זה היא יצירת קווי תאים המכילים עותק יחיד של הגן הכתב המשולב בגנום. תכונה מרכזית זו מבטלת את הרעש שנוצר על ידי תמלול של מספר גנים עיתונאיים המשולבים עם עותקים מרובים בתוך לוקוס גנומי אחד ומאפשרת איסוף של פרמטרים קינטיים של דינמיקת שעתוק ותעתיקי RNA בודדים. דרישה טכנית חיונית לבחון תמלול של שילובי גנים של כתב יחיד היא הזמינות של מערכת מיקרוסקופ המאפשרת זיהוי של תמלילי RNA בודדים המסומנים במערכת MS2 או PP7 בתאים חיים4,12. כאן, מיקרוסקופיה של תאים חיים מבוצעת במערכת דיסק ספינינג קונפוקלית המותקנת על מיקרוסקופ הפוך, המצוידת בלייזרים במצב מוצק של 100 מגה-ואט בשילוב עם מסנן טונה אקוסטי-אופטי כמתואר במקום אחר24. יתר על כן, כדי ללמוד תמלול ב- DSB יחיד באמצעות הכתבים, תאים בודדים חייבים להיות במעקב קפדני כדי להשיג את רזולוציית הזמן הגבוהה ביותר, הדורשת תאי הדמיה במשך מספר שעות, מה שהופך את זה לבדיקת תפוקה נמוכה. ובכל זאת, אנו מתבוננים במספר תאים במקביל למיקום הנשלט על ידי שלב מיקרוסקופ מונחה פיזו. להבטחת תנאים סביבתיים אופטימליים לתצפית על תאים חיים במשך שעות, גוף המיקרוסקופ, כולל שלב הדגימה, ממוקם בתוך תא סביבתי פרספקס. בנוסף, תא דגירה בשלב סגור מותקן על במת המיקרוסקופ ומחובר לבקרי אספקת CO2 ולחות.
השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול הוא בחירת אזורי עניין עם תאים להדמיה. כל מיקום XY המסומן להדמיה חייב להכיל תא אחד או יותר המציגים טרנספקטציה עם חלבונים מחייבים לולאת גזע RNA פלואורסצנטית בהתאם לגן הכתב ולתוכנית הטרנספקטיון המתוארים בסעיף 1, טבלה 1, וכן באיור 2D, E. יתר על כן, התאים חייבים להציג אתרי שעתוק בעלי תווית בהירה חייבים להיות מודבקים במשותף עם מבנה I-SceI-GR-iRFP713, ויש למקם את החלבון בתחילה בציטופלזמה (איור 2D ו- E).
התאים צריכים להראות רמת עוצמת פלואורסצנטיות של חלבון מעיל MS2 ו/או PP7 לא מאוגד נמוך מספיק כדי לזהות תעתיקים מסומנים יחידים מעל רמת הפלואורסצנטיות ברקע. יחד עם זאת, יש צורך ברמת עוצמת פלואורסצנטיות חזקה של חלבוני הציפוי MS2 ו/או PP7 המתויגים באופן פלואורסצנטי כדי לאפשר הדמיה מעל 60 דקות לפחות מבלי לאבד יותר מדי פלואורסצנטיות עקב כמה אקונומיקה המתרחשת. "תצוגת תמונת קנה מידה" עם טווח קבוע כמתואר בסעיף 3.7 משמשת כדי לאפשר בחירה סטנדרטית של תאים בהתאם לרמת עוצמת הפלואורסצנטיות שלהם.
שלב פרוטוקול קריטי שני הוא הוספת הת"א לתאים על עמדות XY שנקבעו מראש דרך החור הקטן במכסה של צלחת התחתונה זכוכית. כל מניפולציה של צלחת התחתונה זכוכית תגרום לשינוי מעמדת XY המסומנת של התאים ויש להימנע. לכן, טיפול זהיר במיקרופיט תוך הוספת הת"א המדולל במדיום הצמיחה התאית חיוני לתצפית המוצלחת של התאים שנבחרו מראש, כפי שהודגם באיור 2F. הסתגלות של מערכות שונות להוספת תרופות לתאים המותקנים על במת מיקרוסקופ, כגון מערכת זלוף, תדרוש תא דגירה שלב נפרד עם פתחי כניסה ויציאה של צינור ומערכת משאבה או הזרקה לניהול תרופות. שיטות אחרות כגון שקופיות ערוץ עם משטחים תחתוניים דמויי כיסוי לגרום דיפוזיה איטית של תרופות מנוהלות לתוך הערוץ ולגרום לעיכוב נוסף בין תוספת סמים והשפעה. לבסוף, צנרת לא אותנטית לתוך פתח שקופית ערוץ עשוי לשנות את המיקום לדוגמה גם כן. לכן, המערכת הנוכחית עם חור קדח מותאם אישית במכסה של צלחת תחתית זכוכית היא פשוטה להתאמה, עלות נמוכה, ומתאים לניהול מדיה צמיחה שונים, תרופות, ורכיבים. הקוטר הקטן של החור והאטמוספירה הלחות בתא הדגירה של הבמה מונעים גם הם ייבוש מתוך המדיום של התא.
צעד קריטי שלישי בפרוטוקול זה הוא ניתוח הנתונים, הדורש בדיקה ידנית של נקודות הזמן כאשר התמלול נפסק עקב אינדוקציה של DSB. נקודת הזמן של סיום התמלול מסומנת על ידי שחרור התמלילים האחרונים מהאתר שכותרתו הבהירה בעבר של תמלול הגנים של הכתב. באופן דומה, האירועים של ייזום תמלול המושרה על ידי שבירה חייבים להיבדק בזהירות כדי לזהות אירועי שעתוק בודדים עם יחס אות לרעש נמוך יחסית של mRNAs פלואורסצנטי יחיד.
הדינמיקה של תיקון DSB המושרה מוסיפה שכבה נוספת של מורכבות לנתחים של נתונים שנוצרו באמצעות כתבים אלה, ומגבילה אותם לדקות הראשונות מיד לאחר גיוס ה- DSB. האופי הטרנסגני של גנים עיתונאיים והאופי העשיר החוזר של מערכי לולאת הגזע MS2 ו- PP7 עשויים להרכיב נוף כרומטין ייחודי, ולהפריע להקמת תוכניות שעתוק יציבות. עם זאת, בהשוואה להקרנה מייננות או UV, אינדוקציה תיווך I-SceI של DSB בגנים עיתונאיים היא מערכת הרבה יותר חזקה לחקור תמלול ב- DSBs בודדים.
ניתן לשלב מערכות אנדונוקלאז שונות כגון I-CreI, I-PpoI או AsiSI שיש להן או אין להן אתרי זיהוי נוספים בתוך הגנום האנושי עם מערכות הגנים הכתב הנוכחיות ליעילות גבוהה יותר אפשרית של יצירת DSBs. עם זאת, הם דורשים תחילה להציג את אתר זיהוי אנדונוקלאז לתוך הגנים העיתונאים. שנית, ייתכן שיש להם שונות דומה על התזמון ואת האינדוקציה היעילות של DSB בתאים בודדים. מצד שני, הוספת עותקים דו-מושביים של אתרי זיהוי אנדונקולאז עשויה להגביר את היעילות של אינדוקציה DSB. יתר על כן, בדיקת מערכות הגנים העיתונאיות המוצגות בשורות תאים שונים תאפשר השוואה של דינמיקת שעתוק באתרי DSB בין רקעים תאיים שונים לבין הזמינות של מסלולי תיקון נזקי DNA שונים כגון בתאים סרטניים, תאים ראשוניים ותאים שאינם רוכבי אופניים מובחנים. עם זאת, בניית הגנים הכתב להיות תואם עם מערכת Flp / FRT מגבילה כעת את האינטגרציה לתוך קווי תאים מארחים Flp / FRT זמין.
בנוסף ליישומים מבוססי מיקרוסקופיה, הגנים הכתב הנוכחי עשויים להיות משולבים גם עם בדיקות ביוכימיות, כגון אימונופרציפיטציה כרומטין, כדי לחקור את הגיוס של גורמי תיקון DNA או שעתוק ל- DSB יחיד או כדי להעריך תפוסת נוקלאוזום, שינויים histone, ומצב כרומטין סביב אתר DSB. יתר על כן, שילוב עם מערכות עיתונאיות שונות יאפשר לחקור קשרים פונקציונליים בין נזק לדנ"א ותהליכים כמו ארגון גנום או שכפול DNA.

הפסקות גדיל כפול DNA (DSBs) הם נגעים DNA רעילים לשבש את תפקוד התא ולתרום להתקוממות של מספר מחלות והזדקנות1. מוטציות הנובעות מתיקון לא מדויק של ביטוי הגנים משפיעות על DSBs ומגדירות את הבסיס לירידה התפקודית של התא. ההשקפה המתהווה כי DSBs לנהוג דה נובו שבירת תעתיק באתר הנגע2,3,4,5,6,7 מציע כי DSBs עשוי להשפיע גם על תפקוד התא באמצעות RNAs המושרה פריצה. מספר מחקרים שנערכו לאחרונה מצביעים על כך ש- DSBs מספיקים כדי ליזום תמלול מתוכנת (למשל, בגנים שאינם ניתנים לגירוי) ולא מתוזמן (למשל, אצל מקדמים לא קנוניים) תמלול4,5,7. עם זאת, למרות מספר מחקרים שבדקו את הקשרים בין נזק לדנ"א לתעתיק, התחום עדיין מפגר ביכולתו לספק אפיון מדויק (כלומר, מולקולה אחת) של אירועי התמלול באתרי שבירת DNA. אחת הסיבות החשובות לכך הייתה היעדר כלים ניסיוניים מתאימים. הקרנת תאים (γ צילומי רנטגן, יונים כבדים) וטיפולים תרופתיים (למשל, מעכבי topoisomerase או חומרים מתערבים) חסרים דיוק מרחבי ומעוררים נגעים ב- DNA מלבד DSBs, כולל שברים חד-גדיליים ותוספות DNA8. אנדונוקלאזים, כגון I-PpoI ו- AsiSI, יוצרים DSBs ספציפיים ללוק, אך לא שולבו עם מערכת המאפשרת הדמיה סימולטנית של תאים חיים של תמלול בלוקוס יחיד עם דיוק טמפורלי גבוה8. כדי לעקוף מגבלה זו, המעבדה שלנו הובילה פיתוח קבוצה של כתבים חדשניים שמדמיינים ישירות תמלול עם רזולוציה של מולקולה אחת על אינדוקציה מבוקרת של DSB4 ייחודי. כאן, אנו מתארים כתבים אלה, מספקים פרוטוקול מפורט להדמיה של תאים חיים של תמלול ב- DSBs ומציגים נתונים החושפים ייזום תמלול ב- DSB יחיד.
מערכות הגנים הכתביות המשמשות בפרוטוקול זה מבוססות על הגן העיתונאי IgM של העכבר המאופיין היטב ומכילים את ה- exons M1 ו- M2 של הצורה הקשורה לממברנה (מיקרומטר) של השרשרת הכבדה μ IgM9,10,11. אינטרון היברידי מפריד בין שני האקסונים עם תעתיק מאוחר אדנווירוס חזק (AdML) PY עלון12. הביטוי של הגנים הכתב נשלט על ידי מקדם cytomegalovirus האנושי (CMV), שבו שני עותקים דו-מושביים של מפעיל טט (TetO) רצף הוכנסו. הגנים הכתבים מוכנסים כל אחד לווקטור פלסמיד המכיל אתר יעד Recombination Flp (FRT) ומוכנסים לאתר יעד FRT ספציפי בגנום של קו תא מארח HEK293. קו תא זה גם מבטא באופן מרכיב את חלבון דכאן טט כדי לווסת את הביטוי של הגן הכתב באמצעות נוכחות או היעדר טטרציקלין / דוקסיציקלין. כדי לאפשר הדמיה של תמלול הגן הכתב, 24 חזרות דו-מושביות של רצף לולאת גזע MS2 ו-24 חזרות דו-מושביות של רצף לולאת הגזע של PP7 הוכנסו למיקומים שונים ביחס לאתר התחלת התמלול ומבנה אקסון/אינטרון של הגן הכתב. לולאות גזע הרנ"א MS2/PP7 נוצרות בעת שעתוק וכבולות במיוחד לחלבוני מעיל MS2/PP7 המתויגים בחלבוני פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים, אסטרטגיה שהייתה בשימוש נרחב בעבר לתעתיק תמונה13,14,15. בנוסף, הוכנס עותק יחיד של רצף הזיהוי של 18 bp עבור ה- I-SceI של ה- endonuclease ביות, המוקפת ישירות על-ידי מערכי רצף לולאת גזע RNA בגנים הכתבים. טכניקות שיבוט סטנדרטיות שימשו ליצירת כל הפלסמידים, הקטע המכיל את לולאת הגבעול I-SceI-24xMS2 של הגן כתב PROP היה מסונתז על ידי שירות סינתזת גנים מסחרי.
הגן כתב DSB (PROP) של האמרגן הפרוקסימלי של האמרגן נבנה על ידי הכנסת אתר חיתוך I-SceI 45 זוגות בסיס (bp) במורד הזרם של אתר ההתחלה של תמלול putative ב- exon I, ואחריו 149 bp עד תחילת קלטת לולאת הגזע 24x MS2, אשר תוכננה דה נובו עם שני רצפי לולאת גזע לא זהים לסירוגין16 וחמישה רצפי רווחים נוספים שאינם חוזרים על 20 bp כדי להפחית את היתירות. מערך לולאת הגבעול MS2 מלווה ב- 72 bp עד תחילת אינטרון 1844 bp ו- 1085 bp אקסון II עד לאתר המחשוף והפוליאדנילציה. האקסון II מקודד חלבון ציאן פלואורסצנטי (CFP) התמזג לרצף פילוח פרוקסיזום C-terminal (PTS) מ acyl CoA אוקסידאז פרוקסיזום האנושי כדי לאפשר הקרנה עצמאית של ביטוי הגנים הכתב (איור 1A).
גן כתב ה- DSB אקסון II (EX2) מורכב מאקסון של 167 bp ואחריו האינטרטרון והאקסון השני קידוד CFP-PTS. בהמשך הזרם במרחק של 169 סיביות לפנה"ס, הוכנסה קלטת המכילה לולאות גזע MS2 24x MS2, ואחריה רצף מקשר 84 bp עם אתר I-SceI במרכז, ואחריו לולאות גזע PP7 24x ו- 221 bp עד לאתר המחשוף והפוליאדנילציה17 (איור 1B).
לבסוף, גן כתב ה- DSB exon II עם תיוג שעתוק אנטיסנס (EX2AS) מבוסס על תעתיק הגן האנושי UBB-201 המכיל שני אקסונים ואחד אינטרון. האקסון יש לי אורך כולל של 1534 bp עם הכנסה הפוכה של רצף לולאת גזע MS2 24x. לכן, רצף הרנ"א הנכון של לולאת גזע MS2 יתעתק בכיוון אנטיסנס ביחס לתמלול החושים של הגן הכתב ממקדם CMV. לאינטרון אורך של 490 bp, ואחריו אקסון II עם אתר I-SceI , ואזור קידוד הוכנס לשני תתי-מסגרות בכל מקום במסגרת. במורד הזרם של הגן UBB הוא רצף היוצר לולאת גזע 24x PP7 עם שעתוק הגן הכתב בכיוון תחושה (איור 1C).
ההדבקה החולפת של מבנה בלתי ניתן לתקדים של אנדונקולייז ביות I-SceI מאפשרת יצירה מבוקרת של DSB באתר הזיהוי שהוכנס בתוך כל גן כתב18. האנדונוקלאז I-SceI מותך במסגרת עם תחום מחייב ליגנד של קולטן הגלוקוקורטיקואיד וחלבון פלואורסצנטי אדום בהרבה iRFP713. מבנה זה הוא ציטופלסמי בהיעדר אצטוניד טרימצינולון (ת"א), אך נודד במהירות לגרעין עם הוספת ת"א למדיום הצמיחה של התאים (איור 1D). הגיוס של DSBs על ידי מערכת I-SceI הוא חזק, כפי שהוכח לפני 18,19,20. ניתן לעקוב אחר תמלול הגנים של הכתב במקביל על ידי הדמיית מערכות לולאת גזע RNA מתויגות באופן פלואורסצנטי MS2 ו- PP7.

<table><tbody><tr><td>100 mW לייזרים במצב מוצק</td><td>Coherent Inc., סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk</td><td>system Intelligent Imaging Innovations Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמת EMCCD מקוררת אוויר Evolve 512</td><td>פוטומטריה, טוסון, אריזונה ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer Z1 מיקרוסקופ הפוך</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מופשט פחם</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6765-500 ML</td><td></td></tr><tr><td>CO2 מודול S</td><td>PeCon GmbH, Erbach, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>יחידת דיסק מסתובב קונפוקלי CSU-X1</td><td>Yokogawa Electric, טוקיו, יפן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM עם Hepes no PhenolRed</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Doxicyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>לאינדוקציה של ביטוי גנים מדווח; נעשה שימוש בתמיסת מלאי של 0.5 מ"ג/מ"ל בדילול של 1:1000 ב מדיום גידול</td></tr><tr><td>תאים FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In T-REx 293 קו תאים</td><td>Thermo Fischer Scientific Invitrogen</td><td>R75007</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI-24x MS2 רצף לולאת גזע</td><td>GeneArt, Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td>שבר DNA מסונתז בהתאמה אישית המכיל רצף זיהוי I-SceI יחיד ו-24 רצפי לולאת גזע MS2 טנדם</td></tr> לחות <tr><td>מכשיר חימום 2000</td><td>PeCon GmbH, Erbach, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>שמן טבילה Immersol 518 F</td><td>Carl Zeiss MicroImaging Inc.)</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>תרמו פישר 25030081</td><td></td><td></td>מדעי</tr><tr><td>ליפופקטמין 3000 מגיב עוזר P3000</td><td>תרמו פישר מגיב</td><td>עוזר L3000001</td><td>טרנספקציה</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 3000 מגיב</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>L3000001</td><td>מגיב טרנספקציה מבוסס</td></tr><tr><td>שומנים MatTek צלחת 35 מ"מ, תחתית זכוכית מס' 1.5</td><td>MatTek תאגיד, אשלנד, MA, ארה"ב</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>תא דגירה מיקרוסקופ</td><td>PeCon GmbH, Erbach, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcDNA5 / FRT / TO</td><td>Thermo Fischer Scientific Invitrogen</td><td>V652020</td><td></td></tr><tr><td>pOG44 פלסמיד</td><td>Thermo Fischer Scientific Invitrogen</td><td>V600520</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 6.0 Software</td><td>Intelligent Imaging Innovations Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא דגירה במה PeCon P-Set 2000</td><td>PeCon GmbH, Erbach, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת StaQtool</td><td>iMM-JLA ליסבון, פורטוגל</td><td></td><td>זמין בכתובת: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip</td></tr><tr><td>triamcinolone acetonide (TA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6501</td><td>גלוקוקורטיקואיד סינטטי; גורם לקולטן הגלוקוקורטיקואיד לנדוד מהציטופלזמה לגרעין</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution (TE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R001100</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה של תאים חיים של פעילות תמלול בהפסקות דו-סטרנד dna

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

שברי גדיל כפול DNA (DSB) הם הסוג החמור ביותר של נזק DNA. למרות ההשלכות הקטסטרופליות על שלמות הגנום, זה נשאר עד כה חמקמק איך DSBs להשפיע על שעתוק. סיבה לכך הייתה היעדר כלים מתאימים לניטור סימלול בו זמנית וגיוס של DSB genic עם רזולוציה זמנית ומרחבית מספקת. עבודה זו מתארת קבוצה של כתבים חדשים המדמיינים ישירות את התמלול בתאים חיים מיד לאחר יצירת DSB בתבנית ה- DNA. לולאות גזע RNA בקטריופאג', משמשות לניטור התמלול ברגישות למולקולה אחת. עבור מיקוד DSB לאזור גנים מסוים, הגנים הכתבים מהונדסים להכיל רצף זיהוי יחיד של אנדונוקלאז ביות I-SceI, אחרת נעדר מהגנום האנושי. עותק יחיד של כל גן עיתונאי שולבו בגנום של קווי התא האנושי. מערכת ניסיונית זו מאפשרת זיהוי של מולקולות RNA בודדות שנוצרו על ידי שעתוק הגנים הקנוניים או על ידי חניכת שעתוק הנגרמת על ידי שבירת DNA. כתבים אלה מספקים הזדמנות חסרת תקדים לפרש את האינטראקציות ההדדיות בין שעתוק לנזק לדנ"א ולחשוף עד כה היבטים לא מוערכים של תמלול המושרה ב- DNA.

קווי התאים המסתירים את הגנים העיתונאיים המתוארים באיור 1A-C מאפשרים לחקור את דינמיקת התמלול ב- DSB יחיד בתאים חיים. המספרים באיור 1A-C מתחת לכל ייצוג גן כתב גרפי מציינים את האורך בזוגות קילו-בסיס (kbp). CMV מציין את מקדם cytomegalovirus, TetO הוא רצפי מפעיל טט, pA מדגיש את 3 'מחשוף ואתר פולי אדנילציה בקצה הגן. CFP-PTS הוא חלבון ציאן פלואורסצנטי מקודד הותך לאות מיקוד peroxisomal, ו 2UBB היא יחידת טנדם B ubiquitin אנושי מקודד. על-ידי ביצוע פרוטוקול ונהלי ניתוח שתוארו לעיל, ניתן להשיג גרפים המציגים את מספר תמלילי הגנים העיתונאיים המסומנים באופן פלואורסצנטי לאורך זמן, עם רזולוציה זמנית של שניות על פני תקופות של עד שעות (איור 4A-D). הגרף באיור 4A מציג את מהלך הזמן של ערכי TFI של אתר שעתוק גנים של כתב PROM המסומן על-ידי הצטברות של מולקולות MS2-GFP בתעתיקים המתהווים. גרף מסוים זה מייצג ניסוי בקרה ללא תוספת ת"א; לכן, אין DSB מושרה. התמלול ממשיך עם פסגות דמויות פרץ ותעתיקים של 2-8 בכל פעם לאורך כל תקופת התצפית של 60 דקות. תוצאות דומות התקבלו עבור הגנים כתב EX2 ו- EX2-AS (נתונים שאינם מוצגים כאן)4. אינדוקציה של DSBs יחיד בגנים הכתבים (באמצעות I-SceI-GR-iRFP) מאפשרת לחקור את ההשפעה של ה- DSB על תמלול הגנים העיתונאי המתמשך וניטור אירועי שעתוק העולים מאתר DSB, כלומר תמלול המושרה על ידי שבירה (איור 4B-D).
הדינמיקה של תמלול פריצה DNA תלויה במיקום של DSB בתוך הגן האינדוקציה של DSB יחיד על ידי I-SceI-GR-iRFP בגן הכתבים עם אתר זיהוי I-SceI פרוקסימלי מובילה להשתקה תמלולית של גן הכתב לאחר כ-11 דקות לאחר הוספת ת"א, והתמלול אינו משוחזר בתוך תקופת התצפית של 60 דקות (איור 4B). בעת התבוננות בתעתיק הגנים של כתב EX2, דיכוי מלא של התמלול מונחה האמרגן הקנוני זוהה על ידי אובדן מלא בו זמנית של אותות MS2-GFP ו- PP7-RFP סביב 30 דקות לאחר הוספת ת"א. עם זאת, בתוך 10 דקות, שעתוק מחדש, כפי שנחשף על ידי הופעתו מחדש פסגות של פלואורסצנטיות PP7-RFP. השחזור המלא של אות PP7-RFP (ולא הפלואורסצנטיות של MS2-GFP) מראה ייזום שעתוק שנגרם על-ידי שבירה (איור 4C). התמלול המושרה בפריצה אינו יציב לאורך תקופות ארוכות; נראה כי עוצמת שיא דמוית פרץ ופסגה נמוכה, מה שמצביע על כך שרק כמה תמלילים שנגרמו על ידי שבירה הופעלו מאתר DSB.
גן כתב EX2AS, המכיל מערך לולאת גזע 24x PP7 ב- exon II במורד הזרם של אתר I-SceI כדי לזהות את תמלול החושים, מראה את התמלול מונחה האמרגן הקנוני המסיים בתוך גן הכתב EX2AS בתוך כ -25 דקות לאחר הוספת ת"א. לאחר מכן הוא מוחלף על ידי שעתוק פריצה אנטיסנס, כפי שנחשף על ידי הצטברות של כריכת חלבון MS2-GFP ל- RNA שנוצר מרצפי לולאת גזע MS2 אנטיסנס (איור 4D). פעילות התמלול האנטי-נאספו נעדרה לפני ההפרעה לתמלול החושים עקב גיוס ה- DSB ומראה בדוגמה זו כי מספר תמלילים בוצעו מאתר ההפסקה בתוך כ -15 דקות. הנתונים הייצוגיים שהושגו כאן מראים כי DSBs יש השפעות שונות על שעתוק בהתאם למיקומו בתוך הגן, כפי שדווח לאחרונה4. הנתונים גם חושפים שונות תא לתא בתזמון של אינדוקציה DSB על ידי I-SceI-GR-iRFP, אשר נע בין 12 ל 30 דקות לאחר הוספת ת"א. יתר על כן, זיהוי של תמלילים בודדים מאפשר גילוי של תא לתא ולשבור את הבדלי האתר לקראת עוצמת פעילות התמלול המושרה הפסקה. התמלול המושרה בפריצה מזוהה רק ב- DSBs בתוך הגן. הוא נעדר ב- DSBs פרוקסימלי מקדם, שם התמלול הקנוני מפסיק על DSB לתקופת התצפית הנותרת.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig1v2.jpg"> איור 1: גנים של כתבים והמערכת כדי לגרום ל-DNA לשבור גדיל כפול. הייצוג הסכמטי ב- (A) ל- (C) מראה את המבנה של שלושת הגנים העיתונאיים המשמשים לחקר שעתוק בעת אינדוקציה של שבירת גדיל כפול DNA. גן הכתבים עם אתר I-SceI הפרוקסימלי של האמרגן באקסון הראשון (PROM) מוקף במורד הזרם על ידי מערך רצף לולאת גזע MS2 (MS2-SL) 24x מתואר ב ( A). גן הכתב עם אתר I-SceI באקסון השני (EX2) מוקף במעלה הזרם עם רצף לולאת גזע MS2 24x ובמורד הזרם על ידי מערך 24x PP7 גזע לולאה (PP7-SL) מוצג ב (B). גן הכתב עם אתר I-SceI הממוקם ב- exon II עם החדרה אנטי-מקבילית של רצף לולאת גזע MS2 24x במעלה הזרם של אתר I-SceI כדי לזהות תמלול אנטיסנס (EX2-AS) מוצג ב (C). הפונקציה של מבנה חלבון ההיתוך I-SceI-GR-iRFP מתוארת (D) על ידי תצוגה גרפית ותמונות תואמות של תאים חיים מתחת. על ביטוי חולף של המבנה (צבע אדום) בשורות תאי הגן הכתב, החלבון הוא ציטופלסמי באופן בלעדי, אשר מונע מחשוף מוקדם של אתר היעד על ידי אנדונוקלאז I-SceI . עם תוספת של ת"א, חלבון ההיתוך מתחיל לנדוד לתוך גרעין התא (המצוין על ידי קו מקווקו) ומתחיל לצבור בין 5-15 דקות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig2v2.jpg"> איור 2: בחירת תאים להדמיה תלת-ממדית של אתרי שעתוק. התמונה (A) מציגה צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ המשמשת להדמיית תאים חיים, עם מכסה מותאם אישית, שבו נקדח חור בקוטר 3 מ"מ כדי להוסיף את ת"א מדולל במדיום צמיחה ישירות. מיקום החור מסומן בעיגול אדום. החלונית ב- (B) מציגה צילום מסך של חלון "פוקוס" של תוכנת בקרת המיקרוסקופ כדי להגדיר את זמן החשיפה לתצוגה החיה, הגדרת המסנן, עוצמת הלייזר ותצוגת התמונה בקנה מידה למסך עבור תאים להדמיה לאחר מכן בזמן לשגות ב- (C), צילום המסך של החלון המתאים "לכידה" כדי להתאים את כל ההגדרות לרכישת זמן 3D של תאים חיים. ההגדרות הספציפיות עבור החלוניות 'מסנן', 'סוג לכידה', 'לכידת זמן לשגות' ו'לכידת תלת-ממד' מתוארות בסעיף 3. בתצוגה המוצגת כאן, ההגדרות מותאמות לרכישת תפלת זמן של קו הגנים כתב PROM שהודבק עם MS2-GFP ו- I-SceI-GR-iRFP מבנים עבור תמלול הדמיה על אינדוקציה של שבר גדיל כפול DNA באזור הקדם-פרוקסימלי של הגן הכתב. התמונה ב- (D) ממוזגת עבור ערוצי GFP ו- iRFP ומציגה שדה ראייה כפי שניתן לראות דרך מערכת המיקרוסקופ, עם מספר תאים של קו תאי הגנים של כתב 293-PROM. התאים הועברו בשיתוף עם מבנה חלבון המעילים MS2 המותך לרצף לוקליזציה גרעיני, שני חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים (GFP-MS2CP) ומבנה I-SceI-GR-iRFP. מספר תאים מראים ביטוי של מבנה GFP-MS2CP, ובכך מדגישים את הגרעינים ואת מבנה I-SceI-GR-iRFP המדגיש את הציטופלסמה. הריבוע המקווקו מציין את האזור המוגדל המוצג ב- (E). עבור הדמיית זמן 3D, התאים נבחרים בהתאם לדרישות שהוענקו בדיון, כגון התא עם הגרעין הגדול יותר באזור המוגדל ב- (D). תא זה מועבר לשני המבנים הפלואורסצנטיים ומציג אתר שעתוק בעל תווית בהירה (ראש חץ) על-ידי צבירת GFP-MS2CP בגן הכתבים המתומלל דה נובו לפני mRNAs (תמונה שמאלית). אמצעי הצמיחה של התאים אינו מכיל ת"א; לכן, המבנה I-SceI-GR-iRFP הוא ציטופלסמי בלבד (תמונה ימנית). ב- (F), צלחת התחתונה של הזכוכית מותקנת בתא הדגירה של שלב המיקרוסקופ לניסויי הדמיה תלת-ממדיים לשקיעת זמן ומצוידת במכסה המותאם אישית המכיל את חור הטעינה של ת"א. קצה המיקרופיט 200 μL מוכנס בקפידה לתוך החור כדי להחיל את ת"א מדולל למדיום הצמיחה של התאים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig3v2.jpg"> איור 3: תוכנה לרכישת תמונות וניתוח תמונות. החלונית ב- (A) מציגה צילום מסך של כלי המעקב וההמנות STaQTool: מעקב כתמים וכימות. התמונה מציגה סדרת זמן לדוגמה של שורת תא הגן של כתב PROM עם אתר שעתוק המסומן בעיגול ירוק/ריבוע לבן בתצוגת הקרנה בעוצמה המרבית במרכז. החלונות בצד ימין מציגים תצוגה מוגדלת של נקודת אתר התמלול שנבחרה, את התוויית משטח העוצמה המוצללת התלת-ממדית המתאימה עם רשת ההתאמה הגאוסית הדו-ממדית לנקודת הזמן הנוכחית, כמו גם התוויות של מיקום אתר התמלול Z בתוך מחסנית z, רוחב ההתאמה הגאוסית (W) ומדידת TFI לאורך זמן. התמונה המיקרוסקופית ב- (B) מציגה מישור אופטי יחיד זום של גרעין של קו תא גן כתב PROM שהודבק עם MS2-GFP. התמונה מייצגת נקודה חד-פעמית של סדרת זמן כיול 2D עם 120 נקודות זמן. הגרעין מציג מספר תמלילים המסומנים בפלואורסצנטיות המופיעים כאובייקטים מוגבלי עקיפה בגרעין (מסומן בריבועים לבנים). החלונית הימנית מציגה צילום מסך של הכלי הפצות TFI ו- W ב- STaQTool כדי לנתח נקודות מרובות ברכישות 2D לשגות זמן. בניתוח לדוגמה זו, הכלי זיהה 408 כתמים מוגבלים עקיפה המייצגים תמלילי גנים עיתונאיים המסומנים עם MS2-GFP המתפזרים בגרעין. הגרפים מימין מציגים את היסטוגרמה של התפלגות רוחב TFI וגאוסיאן של האובייקטים ואת עקומות ההתאמה הגאוסיות. ערכי הממוצע TFI ו- W הנגזרים ממיקום הפסגה המרכזית של עקומת ההתאמה של גאוס ומרווחי הביטחון המחושב מוצגים בחלונית המתאימה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig4v2.jpg"> איור 4: תוצאות מייצגות של זיהוי תמלול באתרים של הפסקות גדיל כפול DNA. הגרפים ב- (A) עד (D) מייצגים את עקומת ה- TFI המכוילת של אתר תמלול אחד לאורך זמן. ערכי TFI מומרים לתעתיקים באמצעות TFI הממוצע של תמלילים בודדים הנמדדים בניסויי הכיול עבור מבנה הגן הכתב בהתאמה וחלבון מחייב לולאת גזע RNA מתויג פלואורסצנטרי MS2 או PP7 המשמש בניסוי המתאים. ב- (A), מוצג גרף מניסוי בקרה באמצעות הגן כתב PROM ללא תוספת ת"א. תעתיקים המסומנים ב- MS2-GFP מצביעים על פעילות תמלול רציפה לאורך כל תקופת התצפית. הגרף ב-(B) מייצג את הגן כתב PROM עם הוספת ת"א וגיוס של DSB מה שמוביל לדיכוי התמלול לזמן התצפית הנותר. גרף הגנים כתב EX2 ב (C) מציג דיכוי תמלול של תמלול מונחה מקדם קנוני בתוספת ת"א. מאוחר יותר באותה מעידה בזמן, רק פעילות שעתוק PP7-RFP שכותרתה מופיעה. בגרף ב(D), תמלול הגנים של כתב EX2-AS מהמקדם הקנוני בכיוון ההגיון מודחק באופן דומה בתוספת ת"א לגן כתב EX2 ב (C). עם זאת, המראה של MS2-RFP שכותרתו תעתיקים שמקורם ברצף לולאת גזע MS2 הוסיף הפוך מציין תמלול antisense נעדר במהלך פעילות תמלול תחושה לפני הוספת ת"א. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שורת תא כתב</td>
			<td>EX2 ו- EX2-AS</td>
			<td>הנשף</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">פלסמידים לבצע טרנסג'נדר</td>
			<td>1.5 מיקרוגרם pI-SceI-GR-iRFP</td>
			<td>1.5 מיקרוגרם pI-SceI-GR-iRFP</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.65 מיקרוגרם pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry</td>
			<td>0.5 מיקרוגרם pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.35 מיקרוגרם pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: תעתיק של קווי תאי הגנים של הכתב. הטבלה מתארת את תוכניות ההדבקה ואת הכמויות של הפלסמידים השונים המשמשים להדבקה של קווי תאי הגנים השונים של הכתב באופן ארעי.

פרוטוקול זה מציג מערכת גנים כתב חדשה ואת ההתקנה הניסיונית כדי לזהות שעתוק ב- DNA כפול גדיל נשבר עם רגישות מולקולה אחת.

הדמיה של תאים חיים של פעילות תמלול בהפסקות דו-סטרנד DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

פרוטוקול זה מאפשר להתבונן ולזהות אירועי שעתוק ונותן תובנות על ההשפעות של הפסקות גדיל כפול DNA על שעתוק מתמשך של גן. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא תצפית של תמלילי RNA המסומנים בנפרד בתאים בודדים במרווחי זמן של שניות על פני תקופה כוללת של שעה אחת או יותר. שיטה זו מספקת תובנה על תגובת הנזק לדנ"א כדי לחקור את ההצלבה בין תמלול לתהליכים תאיים, כגון שכפול DNA ונגעים ב- DNA.העצה שלנו היא להתבונן בתאים המשתמשים בדוקסיציקלין ולבצע מדידות כיול כדי לאמן את איתור אתר התמלול ומולקולות RNA המסומנות. בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר, להכין פתרון A המכיל 150 microliters של DNA פלזמה MEM בסרום מופחת ו 2.5 מיקרוגרם לכל microliter של DNA ריאגנט עוזר transfection. במקביל, להכין פתרון B המכיל 150 microliters של MEM בסרום מופחת ו 1.5 מיקרוגרם לכל microliter של DNA ב ריאגנט transfection מבוסס שומנים בדם.לדגור על שני הפתרונות בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, ולאחר מכן להוסיף בעדינות פתרון A לפתרון B ודגר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כדי להעביר את התאים, להוסיף 300 microliters של פתרון מעורב A ו- B טיפה לכל צלחת ולהפיץ אותו בעדינות. לאחסן את צלחת התחתונה זכוכית בתוך צלחת תרבית תאים סטנדרטית 100 מ"מ ודגור אותה ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה לחה עם 5% פחמן דו חמצני.הכן 1.5 מיליליטר מיקרוצנטריפוגה צינור עם 200 microliters של DMEM עם HEPES ללא פנול אדום בתוספת עם 10% סרום בקר עוברי פחם, ולאחר מכן להוסיף ת"א. כשעה לפני תחילת תצפית מיקרוסקופיה, לגרום תמלול של הגנים הכתב על ידי הוספת דוקסיציקלין למדיום הצמיחה בעדינות לערבב על ידי צנרת למעלה ולמטה עם micropipette 200 microliter. להעביר את התאים למיקרוסקופ לפחות 30 דקות לפני תחילת התצפית ולהניח את צלחת 100 מ"מ עם התאים בתוך תא הדגירה מיקרוסקופ גדול מחומם מראש. מניחים את צינור המיקרוצנטריפוגה עם ת"א מדולל מראש בתוך התא הסביבתי המיקרוסקופ הגדול כדי לחמם אותו ל -37 מעלות צלזיוס.החליפו את המכסה של צלחת הזכוכית התחתונה במכסה בעל חור קוטר של שלושה מילימטרים. בחר את המטרה טבילת שמן 100X בלוח הבקרה מיקרוסקופ ולהחיל טיפה של שמן טבילה למטרה. הגדר את צלחת התחתונה זכוכית עם התאים בתוך תא הדגירה שלב מיקרוסקופ ולנעול אותו במקום, ולאחר מכן לסגור את המכסה של אינקובטור הבמה ואת כל הדלתות של דיור מיקרוסקופ.הפעל את תוכנת ההפעלה והשליטה של המיקרוסקופ, פתח את חלון בקרת המוקד ולחץ על חלונית הטווח. בחלונית בחירת הפליטה, לחץ על התיבה 100%עין כדי להגדיר את נתיב הקרן העין לתצפית ישירה מדגם באמצעות עין. בתפריט ערכת המסננים, עבור לסט מסנן עיניים ולחץ על ברייטפילד ולאחר מכן לחץ על לחצן ברייטפילד הפתוח.הזז את מטרת המיקרוסקופ לכיוון צלחת התחתונה של הזכוכית עד שהשמן נוגע בכוס. הסתכל דרך המשקפת והתמקד באופן ידני במישור התאים, ולאחר מכן כבה את לחצן ברייטפילד הפתוח. השאירו את התאים למשך 30 דקות לפני תחילת התצפיות הניסיוניות כדי לאפשר להם להסתגל לתנאים הסביבתיים ולמנוע סחף מוקדי במהלך ההדמיה עקב שיפועי טמפרטורה.הגדירו מיקרופיפט 200 מיקרוליטר ו-200 טיפים למיקרו-ליטר בטמפרטורת החדר. בחלון בקרת המיקוד של תוכנת בקרת המיקרוסקופ, הגדר את עוצמת הלייזר ל- 5% והזן ערך של 50 אלפיות השניה לזמן החשיפה. פתח את חלון הלכידה כדי להתאים את ההגדרות כדי לבצע רכישת תמונה אוטומטית של לוחות זמנים תלת-ממדיים.בחר את סוג רכישת לכידת 3D והגדר 12 עד 16 פרוסות אופטיות המופרדות באמצעות 0.4 מיקרומטר. סמן את תיבות הסימון של הטווח סביב הזרם וחזור למיקום הנוכחי לאחר הלכידה. בחלונית לכידת הזמן, הזן ערך של 120 עבור מספר נקודות הזמן ו- 30 שניות עבור מרווח הזמן.בחר את מסנן הקונפוקלי שנקבע על פי תוויות החלבון הפלואורסצנטיות המועברות כפי שצוין בכתב היד של הטקסט והגדר את זמן החשיפה עבור כל ערוץ ל- 50 אלפיות השנייה. השתמש בזרם ההגדרה עבור כוח הלייזר כדי להשתמש בערך של 5% שנבחר בחלון המוקד. בחלון פקד המוקד, עבור לחלונית המצלמה, בחר את פקד תצוגת התמונה קנה מידה ובחר בלחצן הידני כדי להגדיר טווח קבוע של עוצמות תמונה שיוצגו.בחר את התאים להדמיית timelapse תלת-ממדית של אתרי שעתוק בעת אינדוקציה של שבירת גדיל כפול DNA. מסך התאים ובחר שלושה שדות תצוגה בהתאם לתנאים המתוארים בדיון בטקסט. התמקד בכל תא שנבחר שהיה ממוקם בעבר במרכז שדה הראייה עם אתר התמלול במישור האמצעי של מחסנית Z.סמן כל מיקום XYZ במישור XY של חלון בקרת המוקד על-ידי לחיצה על נקודת ערכה. הוסף 200 מיקרוליטרים של ת"א מדולל מראש לתאים ולהתחיל את הדמיית סדרת הזמן 3D על ידי לחיצה על התחל בחלון הלכידה. שמור את נתוני ההדמיה בתבנית הנתונים של תוכנת בקרת המיקרוסקופ בכונן הקשיח של מחשב בקרת המיקרוסקופ.הוסף 0.5 מיקרוגרם למיליליטר של דוקסיציקלין למדיום הצמיחה של התאים שעה אחת לפני תחילת רכישת התמונה מיקרוסקופית. הר את צלחת התחתונה זכוכית בתוך תא הדגירה שלב מיקרוסקופ ולהכין את רכישת התמונה כפי שהודגם בעבר. השתמש באותה עוצמת לייזר והגדרות חשיפה כמו קודם.הגדר את הגדרות הלכידה לסדרת זמן 2D והגדר 120 נקודות זמן במרווחים של 500 אלפיות השניה בלוח לכידת הזמן. לרכוש עשרות סדרות זמן כיול ממיקומים מרובים על מנת ליצור ערכות נתונים לספור כמה מאות מדידות TFI תעתיק יחיד. באמצעות פרוטוקול זה, מתקבל גרף המציג את מספר תמלילי הגנים העיתונאיים המסומנים באופן פלואורסצנטי לאורך זמן עם רזולוציה זמנית של שניות על פני תקופות של עד שעות.מהלך הזמן של ערכי TFI של אתר שעתוק גנים כתב PROM שכותרתו על ידי הצטברות של חלבון מעיל MS2 המסומן עם מולקולות חלבון פלואורסצנטי ירוק על תמלילים המתהווה מוצג כאן. האינדוקציה של DSB יחיד בגנים הכתבים מאפשרת לחקור את השפעתו על תמלול הגנים העיתונאי המתמשך וניטור אירועי שעתוק העולים מאתר DSB, כלומר תמלול שנגרם על ידי שבירה. ת"א חיבור ואינדוקציה של DSB מוביל לדיכוי של תמלול גנים כתב PROM לאחר כ 11 דקות כי הוא לא משוחזר עד 60 דקות.השחזור המלא של אות PP7-RFP מראה אתחול תמלול שנגרם על-ידי שבירה. הגן כתב antisense EXON 2 מראה את סיום תמלול מונחה מקדם, אשר מוחלף לאחר מכן על ידי תעתיק פריצה נגד פרץ כפי שנחשף על ידי הצטברות של חלבון מעיל MS2 שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי אדום מחייב RNA שנוצר רצפי לולאת גזע MS2 antisense. בחירת התאים להדמיה, הגדר את הדמיית timelapse המטופל התאמת מיקום Z של אתר שעתוק שכותרתו בכל מיקום XY למרכז מחסנית Z שיש לרכוש.ולבסוף, התוספת של ת"א מדולל במדיום הצמיחה חייבת להתבצע בזהירות רבה כדי למנוע כל משמרות של עמדות שנבחרו מראש עם תאים להיות בתמונה. הדמיה של תמלילי RNA יחיד בתלת-ממד לאורך זמן בתאים חיים יכולה להיות מיושמת כדי לחקור שעתוק RNA במהלך שכפול DNA או שינויים של שעתוק במהלך התקדמות מחזור התא.

live-cell-imaging-transcriptional-activity-at-dna-double-strand

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר GFP מבוססי...

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת המיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי כדי לזהות חלבונים ספציפיים של תגובת נזק לדנ"א הממוקמים באתרים של שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאים חד-גרעיניים אנושיים. החלבונים מזוהים על ידי נוגדנים ראשוניים ספציפיים, אשר בתורם נקשרים לנוגדנים משניים המתויגים בפלואורופור הפולטים פלואורסצנט במהלך הדמיה מיקרוסקופית, ומאפשרים הדמיה של החלבונים כמוקדים פלואורסצנטיים נפרדים בתוך גרעיני התא.

מיקרוסקופ אימונופלואורסנציה לניתוח שברים דו-גדיליים של DNA

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים כיצד לדמיין כריתת קצה דו-גדילית של דנ"א במהלך שלב S/G2 של מחזור התא באמצעות שיטה מבוססת אימונופלואורסצנטיות.

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

הפרוטוקול הבא מציג זיהוי של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא תוך שימוש בסנכרון מחזור התא ואחריו צביעה אימונופלואורסצנטית RPA2.

הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא

אנו מציגים פרוטוקולים להערכת מיומנות מסלול תיקון שבר גדיל כפול בתאים באמצעות חבילה של מצעי כתב חוץ-כרומוזומליים מבוססי לומינסנציה.

הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב

למד שיטה לזיהוי תמלול בודד ברמת מולקולה בודדת בהפסקות דו-סטרנד DNA בתאים חיים. הטכניקה משתמשת במיקרוסקופיית פלואורסצנציה כדי לחקור את הקשר בין נזק DNA לתהליכי תמלול בזמן אמת.

הדמיה של תאים חיים של פעילות תמלול בהפסקות דו-סטרנד DNA

גלה סרטונים נוספים