Name: מבחנים מבוססי כימילומינסנציה לזיהוי תחמוצת החנקן ונגזרותיה מאוטוקידציה ותרכובות ניטרוסטיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: למדו להשתמש בגלאי כימילומינסנציה לזיהוי רגיש של תחמוצת החנקן ומטבוליטים ביולוגיים. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מדויקת ללא צורך בצוות מקצועי ייעודי במקום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרוטוקולים המדווחים בכתב יד זה התאפשרו הודות לתרומתם המצטברת של עמיתים קודמים במעבדתו של ד"ר וורן זפול לחקר ההרדמה בטיפול קריטי, המחלקה להרדמה בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס. אנו מכירים בתרומתם של ד"ר אקיטו נקגאווה, פרנצ'סקו זדק, עמנואלה ואסנה, צ'ונג ליי, יאסוקו נגאסאקה, אסתר ספאגנולי ועמנואלה רזואלי.

ל.ב. מקבל תמיכה בשכר מ- K23 HL128882/NHLBI NIH כחוקר ראשי עבור עבודתו על המוליזה ותחמוצת החנקן. LB מקבל מענקים מ"מענקים מהירים למחקר COVID-19 " במרכז מרקטוס באוניברסיטת ג'ורג ' מייסון ומ- iNO Therapeutics LLC. B.Y. נתמך על ידי מענקים מ- NHLBI / #R21HL130956 ו- DOD / קרן ז'נבה (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). ב.י. קיבלה פטנטים ב-MGH על ייצור חשמלי של תחמוצת החנקן.
L.B. ו- B.Y. הגישו בקשת פטנט על אי מסירה במחלת COVID-19 מספר בקשה PCT: PCT / US2021 /036269 שהוגשה ב - 7 ביוני 2021. RWC מקבלת תמיכה בשכר מ- Unitaid כחוקרת הראשית לפיתוח טכנולוגיה שמטרתה אבחנה מבוזרת של שחפת בילדים הממוקמים במסגרות דלות משאבים.

בשל הרגישות הגבוהה, בדיקות מבוססות כימילומינסנציה לקביעת NO ותרכובות קשורות יש סיכון גבוה לזיהום NO2. כל מגיב (במיוחדפתרון חסימת NO 2) ומדלל (כולל ddH2O) המשמשים בניסוי צריכים להיבדק לתוכן NO 2 - שלו כדי לתקן את אות הרקע. ניטריט הוא תגובתי ביותר עם זמן מחצית חיים בדם שלם בסביבות 10 דקות ומייצר במהירות NO3-. הזמן שחולף בין איסוף הדם לצנטריפוגה, או חסימת NO2, עלול אפוא לגרום לטעויות פרה-אנליטיות ויש למזע...

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית</td><td>סיגמא</td><td>45754</td><td>500 מ"ל - נוזל</td></tr><tr><td>נגד קצף B תחליב</td><td>B סיגמא</td><td>A5757</td><td>250 מ"ל - נוזלי</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>קיימן</td><td>82120</td><td>10 מ"ג</td></tr><tr><td>ג'יבקו DPBS (1x) ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית 37% (1 מ')</td><td>סיגמא</td><td>258148</td><td>500 מ"ל - נוזל</td></tr><tr><td>יוד</td><td>SAFC</td><td>207772</td><td>100 גרם -</td></tr> מגיב ACS <tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Mercury (II) מוצק> 99.5%</td> <td>סיגמא</td><td>215465</td><td>100 גרם - מוצק (מומס במים)</td></tr> <tr><td>מערכת טיהור מים Mili-Q</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דגם 705 RN 50 &mu; מזרק L</td><td>המילטון</td><td>80530</td><td>מזרק מיקרוליטר</td></tr><tr><td>דגם 802 N 25 &mu; מזרק L</td><td>המילטון</td><td>84854</td><td>מזרק מיקרוליטר</td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td>25 גרם -</td></tr><tr><td>מנתח תחמוצת החנקן הגבישי + תוכנת צרור - כלי טיהור</td><td>Zysense</td><td>NOA 280i</td><td>גלאי כימילומינסנציה</td></tr><tr><td>Nonidet p-40&nbsp; (נ"פ-40)</td><td>ThermoFisher</td><td>85125</td><td>10% - 500 מ"ל</td></tr><tr><td>מגיב ACS אשלגן הקסציאנופראט (III); 99%</td> <td>סיגמא</td><td>244023</td><td>100 גרם - אבקת</td></tr><tr><td>מגיב ACS אשלגן יודי> 99%</td> <td>סיגמא</td><td>221945</td><td>100 גרם -</td></tr><tr><td>מגיב אשלגן ניטריט מוצק. לניתוח EMSURE ACS</td><td>Supelco</td><td></td><td>105067 250 גרם - גבישי</td></tr><tr><td>PowerGen 125</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>הומוגנייזר מכונאי</td></tr><tr><td>RV3 משאבת שבשבת סיבובית דו-שלבית</td><td>Edwards</td><td>A65201906</td><td>משאבת ואקום - ארוזה עם אנלייזר</td></tr><tr><td>נתרן הפרין - BD Hemogard Clo</td><td>BD Biosciences</td><td>BD367871</td><td>75 יחידות USP</td></tr><tr><td>מגיב ACS נטול מים נתרן הידרוקסיד &ge; 97%</td> <td>סיגמא</td><td>795429</td><td>1 ק"ג - כדוריות</td></tr><tr><td>נתרן חנקתי מגיב ACS &ge; 99%</td> <td>סיגמא</td><td>221341</td><td>500 גרם - אבקת</td></tr><tr><td>נתרן ניטריט &ge; 99%</td> <td>סיגמא</td><td>S2252</td><td>500 גרם -</td></tr><tr><td>סולפנילאמיד גבישי &ge; 98%</td> <td>סיגמא</td><td>S9251</td><td>100 גרם - ונדיום</td></tr><tr><td>(III) כלוריד</td><td>סיגמא</td> מוצק <td>112393</td><td>25 גרם - מוצק - זהירות (אקסותרמית)</td></tr><tr><td>Whatman 1 נייר סינון</td><td>סיגמא</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr></tbody></table>

מבחנים מבוססי כימילומינסנציה לזיהוי תחמוצת החנקן ונגזרותיה מאוטוקידציה ותרכובות ניטרוסטיות

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

פעילות תחמוצת החנקן (NO) in vivo היא התוצאות המשולבות של השפעותיה הישירות, פעולת נגזרותיה הנוצרת מ- NO autoxidation, וההשפעות של תרכובות ניטרוסטיות. מדידת מטבוליטים ללא מטבוליטים חיונית לחקר פעילות NO הן ברמות כלי הדם והן ברקמות אחרות, במיוחד במסגרות הניסוי שבהן מנוהל NO אקסוגני. מבחני כימילומינסנציה מבוססי אוזון מאפשרים מדידות מדויקות של מטבוליטים NO ו-NO הן בנוזלים (כולל פלזמה, הומוגנטים של רקמות, תרביות תאים) והן בתערובות גזים (למשל, נשימה בנשיפה). NO מגיב עם אוזון כדי לייצר חנקן דו חמצני במצב נרגש. פליטת האור כתוצאה מכך מאפשרת פוטו-דטקציה ויצירת אות חשמלי המשקף את תוכן ה-NO של הדגימה. ניתן להשתמש באליקוטים מאותה דגימה כדי למדוד מטבוליטים ספציפיים של NO, כגון חנקה, ניטריט, S-nitrosothiols וקומפלקסים של ברזל-ניטרזיל. בנוסף, NO נצרך על ידי המוגלובין ללא תאים הוא גם כימות עם ניתוח chemiluminescence. המחשה של כל הטכניקות הללו מסופקת.

ה-NO-consumption על ידי בדיקת Hb ללא תאים שימשה בדגימות שהכילו ריכוזים ידועים של oxyHb ללא תאים (איור 4). כאשר heme אחד של oxyHb משחרר באופן סטויכיומטרי מולקולת NO אחת בבדיקה, oxyHb מטוהר ללא תאים משמש לבניית עקומת הכיול עבור הבדיקה (איור משלים 3).
הקשר בין מינון לתגובה בין Hb ללא תאים (שנמדד באמצעות בדיקה קולורימטרית) לבין צריכת NO בחולים שירדו ממעקף לב-ריאה (CPB) במהלך ניתוח לב מוצג באיור 5. ניתן להניח כי לאחר CPB י...

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לאיתור תחמוצת החנקן ונגזרותיה הרלוונטיות מבחינה ביולוגית באמצעות מבחנים מבוססי כימילומינסנציה בעלי רגישות גבוהה.

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להשתמש במיומנות בגלאי chemiluminescence למדידת מטבוליטים של תחמוצת החנקן ללא הדרכה או הוצאה של העסקת כוח אדם ייעודי באתר. בדיקה מבוססת Chemiluminescence היא השיטה הרגישה ביותר לזיהוי שינויים מינימליים ברמות של תחמוצת החנקן והמטבוליטים שלה בכל מדגם ביולוגי נתון. תחמוצת החנקן בשאיפה היא גז טיפולי המשמש למגוון רחב של מחלות.חיוני שהתקדמות המחלה וההחלמה שלה יהיו מתואמות במדויק עם רמות המטבוליט של תחמוצת החנקן. תחמוצת החנקן בשאיפה, אנטי מיקרוביאלית, מראה הבטחה בטיפול בחולים עם מחלות זיהומיות בדרכי הנשימה. שיטת chemiluminescence מספקת תובנה לגבי מינון קורלציה של תחמוצת החנקן והמטבוליטים שלה עם שינויים מיקרוביולוגיים ופתופיזיולוגיים.כדי להכין את תמיסת DETA-NONOate, הוסיפו 10 מיליגרם של DETA-NONOate ל-610 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד 10 מילימולרי ב-PBS של pH 7.4 כדי לייצר 100 מילימולר של DETA-NONOate ולשמור אותו על הקרח. כדי להמשיך, חבר את קו החמצן לגלאי chemiluminescence ופתח את מיכל החמצן בלחץ על פי הוראת היצרן המופיעה בטקסט. לאחר מכן, חברו את קו המסנן הדיאלקטרי בעל השדה האינטנסיבי לגלאי הכימילומינסנציה.בממשק גלאי chemiluminescence, התחל להריץ את תוכנית הגילוי לבדיקות פאזה נוזלית, תוך הקפדה על כך שאספקת החמצן מספקת והגלאי יתחיל לדגום, המציין זיהוי על ידי אות במיליוולטים, אחרת ינחה אות אבחון שלילי. כדי להכין את כלי הטיהור, סגור את כלי הטיהור בכל שלוש היציאות על ידי הברגה מלאה של שסתום המחט ימינה וסגירת הזין של תחנת הכניסה והיציאה. הסר את המכסה מכלי הטיהור.הוסף כמות מספקת של המגיב הספציפית לבדיקה המתוכננת לתא התגובה, כך שמחט המזרק המשמשת להזרקת הדגימות תוכל להגיע לעמודת הנוזלים תוך אימות נוכחות של קו בסיס יציב ורצוי. כדי להתחיל את זרימת גז הטיהור, ודא שמיכל הדלק האינרטי מצויד בווסת דו-שלבי, וחבר את מיכל הדלק האינרטי לכניסת הגז של כלי השיט. לאחר מכן, פתח את השקע של כלי הטיהור ופתח את הגז בלחץ יציאה בווסת של אחד עד חמישה פאונד לאינץ 'מרובע.לאחר מכן, פתח את הכניסה של כלי הטיהור ופתח באיטיות את שסתום המחט של כלי הטיהור כדי לאפשר זרימת גז ולאמת את המבעבע בתוך כלי הטיהור. כדי להתאים את זרימת הגז, רשמו את לחץ התא שנמדד על ידי גלאי הכימילומינסנציה עם קו המסנן הדיאלקטרי בעל השדה האינטנסיבי המדגים את אוויר הסביבה. מקם מחדש את המכסה על כלי הטיהור וחבר את קו המסנן הדיאלקטרי בעל השדה האינטנסיבי לכלי הטיהור.השתמש בשסתום המחט כדי להגיע לאותו לחץ תאי ברמת גלאי chemiluminescence המתועדת באוויר הסביבה. כדי להתחיל את תוכנית רכישת האותות chemiluminescence, חבר את היציאה הטורית של גלאי chemiluminescence ליציאה הטורית של המחשב שלתוכה הותקנה תוכנית הרכישה. לאחר מכן, הפעל את תוכנית הניתוח.לחץ על רכוש ולאחר מכן בחר את התיקיה כדי לשמור את קובץ הנתונים, הקלד את שם הקובץ ולחץ על שמור. בעת הכנה להזרקת דגימה, התאם את סולם המתח על המסך כך שתהיה לו שליטה על קו הבסיס הממוקד על-ידי לחיצה על הלחצנים המינימליים ו/או המקסימום ולאחר מכן הזנת הערך הרצוי. כדי לבצע את הזרקת הדגימה, שטפו את המזרק לפחות פעמיים או יותר במים שעברו דה-יוניזציה וזיקוק לפני משיכת כל דגימה, והבטיחו פליטת מים ללא הפרעה על גבי מגבון משימה.לאחר מכן, הכנס את המזרק לצינור הדגימה תוך החזקת המזרק והצינור במרחק קרוב ומשוך את הבוכנה לנפח הרצוי תוך הקפדה על כך שלא נלכדו בועת אוויר או חלקים מוצקים שאינם הומוגניים. נקו את קצה המזרק באמצעות מגב משימה והכניסו את המזרק למכסה הסטר ביציאת ההזרקה. לאחר אימות כי קצה המזרק נמצא בתוך השלב הנוזלי, להזריק את הדגימה לתוך תא התגובה.כדי לסמן את ההזרקה בתוכנה, הקלד את שם הדגימה על ידי לחיצה על התיבה האפורה תחת שמות לדוגמה, ולאחר מכן לחץ על Mark Injection תוך אימות שהזריקה גורמת לשינוי כלפי מעלה באות או כלפי מטה בצריכת תחמוצת החנקן על ידי בדיקת המוגלובין ללא תאים. הקשר בין תגובת המינון בין המוגלובין ללא תאים לבין צריכת תחמוצת החנקן נמדד באמצעות כימילומינסנציה לאחר מעקף לב-ריאה. ניתן להניח כי קיים ריכוז גבוה של קבוצות heme בסטטוס המחומצן של תחמוצת החנקן.בחולים המקבלים תחמוצת החנקן במהלך מעקף לב-ריאה, במקום זאת, רוב קבוצות ההם מופחתות ואינן צורכות תחמוצת החנקן. מדידות של ריכוז המוגלובין ללא תאים הצביעו על חיסול איטי של פלזמה תוך 12 שעות לאחר מעקף לב-ריאה. עם זאת, צריכת תחמוצת החנקן הגיעה לשיא של 15 דקות ולא שיקפה את חיסול ההמוגלובין ללא תאים.עקומות הרגרסיה הליניארית של צריכת תחמוצת החנקן על ידי המוגלובין ללא תאים הראו שכיחות של המוגלובין הנצרך תחמוצת מחומצנת ותחמוצת החנקן במשך 15 דקות, לעומת המוגלובין מופחת יותר בנקודת ההתחלה 4 שעות ו-12 שעות לאחר מעקף קרדיו-פולמונרי. ההשפעות של מתן גז תחמוצת החנקן על צריכת תחמוצת החנקן היו מנוטרות. כאשר המטופלים טופלו בגז תחמוצת החנקן תוך-ניתוחי ולאחר הניתוח, העלייה הנצפית של המוגלובין חופשי לאחר מעקף הלב-ריאה לא הוצמדה לעלייה כלשהי בצריכת תחמוצת החנקן.התוצאות הצביעו על כך שתחמוצת החנקן שניתנה באופן אקסוגני הפחיתה את רוב ההמוגלובין החופשי ומנעה טיהור תחמוצת החנקן. הניסוי תקף רק אם כל התנאים נשארים זהים. אם גובה רמת הנוזל עולה על עמודת התגובה, עלינו לעצור ולבצע כיול חדש.

chemiluminescence-based-assays-for-detection-nitric-oxide-its

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן אנו מציעים שיטות פשוטות כדי לבחון ולהעריך את הנוכחות של מינים חמצן תגובתי בתאים.

הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן

ייצור אנדוגני של תחמוצת החנקן (NO) מסדיר מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים. מתברר יותר ויותר כי שיבוש או dysregulation של איתות NO מבוסס מעורב מחלות אנושיות רבות. שיטות לכמת רלוונטי מטבוליטים אינו רשאי לספק סמנים ביולוגיים מנבא אבחון או הרומן של מחלות אנושיות.

טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן

מונואמין NADPH הוא המקור העיקרי של מיני חמצן תגובתי (ROS) בphagocytes. בשל האופי הארעי של ROS, קשה למדוד ולעקוב אחר רמות ROS חי חיות. שיטה פולשנית לכימות סידורית של ROS בעכברים חיים מתוארת.

הדמית פליטת אור של פעילות מונואמין NADPH במודלים של בעלי חיים שונים

במאמר זה נתאר שיטה קלה מותאמת יחסית באמצעות צבע פלואורסצנטי diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2da) ו dihydroethidium (DHE) לגילוי סימולטני אן-פאס וויזואליזציה של תחמוצת חנקן תאית (NO) אניון סופראוקסיד (O 2 .- ) בהתאמה, טרי מבודד aortas השלם של מודל עכבר להשמנה.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה תוך-ניתוחית חדשה המשתמשת בקומפלקס רותניום כמקור לפליטת אור כימילומינסצנטי, ובכך מייצרת יחסי אות לרעש גבוהים במהלך הדמיה in vivo. הדמיה תוך ניתוחית היא תחום מתרחב שיכול לחולל מהפכה באופן ביצוע הליכים כירורגיים.

שיטה חדשנית עבור chemiluminescence יצירה וההתבוננות בסביבה ביולוגית

תחמוצת החנקן (NO) היא מולקולת איתות חשובה בהומאוסטזיס של כלי הדם. אין ייצור in vivo נמוך מדי למדידה ישירה. כימילומינסנציה מספקת תובנה שימושית לגבי מחזור NO באמצעות מדידת קודמיו ותוצרי החמצון, ניטריט וחנקה. מוסברת קביעת ניטריט / ניטראט ברקמות הגוף ובנוזלים.

מדידת הניטריט ו חנקתי, מטבוליטים במסלול תחמוצת החנקן, חומרים ביולוגיים באמצעות שיטה chemiluminescence

כתב יד זה מציג פרוטוקולים ליישום בדיקות תחמוצת החנקן (NO•) המקודדות גנטית (geNOps) לניטור תנודות NO• של תא בודד בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. היווצרות NO• המופעלת על ידי Ca2+ ברמה של תאי אנדותל בודדים הודגמה על ידי שילוב של geNOps עם חיישן Ca2+ כימי.

יישום של תחמוצת החנקן פלורסנט מקודדים גנטית (NO •) בדיקות, את geNOps, הדמיה בזמן אמת של אותות NO • ב תאים בודדים

אנו מציגים פרוטוקולים לשלוש שיטות שונות להומוגניזציה של ארבע קבוצות שרירים שונות של רקמת שריר שלד חולדה כדי למדוד ולהשוות את רמות החנקות והניטריט. יתר על כן, אנו משווים משקלים שונים של דגימות כדי לחקור אם גודל דגימת הרקמה משפיע על תוצאות ההומוגניזציה.

הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט

לכידת שינויים דינמיים בהפעלת החלבונים של תאי דם אדומים מעוררים אתגרים מתודולוגיים, כמו שימור שינויים דינמיים לגירויים חריפים לצורך הערכה מאוחרת יותר. הפרוטוקול המוצג מתאר טכניקות הכנת דגימה וצביעה המאפשרות שימור וניתוח של שינויי חלבון רלוונטיים וזיהוי לאחר מכן.

זיהוי מבוסס חיסונים של שינויים דינמיים בחלבוני תאי דם אדומים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לכימות ייצור תחמוצת החנקן (NO) בתרביות אפיתל בדרכי האוויר המובחנות בממשק אוויר-נוזל (ALI) על ידי מדידת ניטריט בהפרשות אפיקליות באמצעות בדיקת כימילומינציה מבוססת טריודיד.

מדידת ייצור תחמוצת חנקן בתרביות תאי אפיתל של קנה הנשימה בעכברים הממוינים בממשק נוזל האוויר

למדו להשתמש בגלאי כימילומינסנציה לזיהוי רגיש של תחמוצת החנקן ומטבוליטים ביולוגיים. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מדויקת ללא צורך בצוות מקצועי ייעודי במקום.

מבחנים מבוססי כימילומינסנציה לזיהוי תחמוצת החנקן ונגזרותיה מאוטוקידציה ותרכובות ניטרוסטיות

גלה סרטונים נוספים