מבחנים מבוססי כימילומינסנציה לזיהוי תחמוצת החנקן ונגזרותיה מאוטוקידציה ותרכובות ניטרוסטיות

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להשתמש במיומנות בגלאי chemiluminescence למדידת מטבוליטים של תחמוצת החנקן ללא הדרכה או הוצאה של העסקת כוח אדם ייעודי באתר. בדיקה מבוססת Chemiluminescence היא השיטה הרגישה ביותר לזיהוי שינויים מינימליים ברמות של תחמוצת החנקן והמטבוליטים שלה בכל מדגם ביולוגי נתון. תחמוצת החנקן בשאיפה היא גז טיפולי המשמש למגוון רחב של מחלות.

חיוני שהתקדמות המחלה וההחלמה שלה יהיו מתואמות במדויק עם רמות המטבוליט של תחמוצת החנקן. תחמוצת החנקן בשאיפה, אנטי מיקרוביאלית, מראה הבטחה בטיפול בחולים עם מחלות זיהומיות בדרכי הנשימה. שיטת chemiluminescence מספקת תובנה לגבי מינון קורלציה של תחמוצת החנקן והמטבוליטים שלה עם שינויים מיקרוביולוגיים ופתופיזיולוגיים.

כדי להכין את תמיסת DETA-NONOate, הוסיפו 10 מיליגרם של DETA-NONOate ל-610 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד 10 מילימולרי ב-PBS של pH 7.4 כדי לייצר 100 מילימולר של DETA-NONOate ולשמור אותו על הקרח. כדי להמשיך, חבר את קו החמצן לגלאי chemiluminescence ופתח את מיכל החמצן בלחץ על פי הוראת היצרן המופיעה בטקסט. לאחר מכן, חברו את קו המסנן הדיאלקטרי בעל השדה האינטנסיבי לגלאי הכימילומינסנציה.

בממשק גלאי chemiluminescence, התחל להריץ את תוכנית הגילוי לבדיקות פאזה נוזלית, תוך הקפדה על כך שאספקת החמצן מספקת והגלאי יתחיל לדגום, המציין זיהוי על ידי אות במיליוולטים, אחרת ינחה אות אבחון שלילי. כדי להכין את כלי הטיהור, סגור את כלי הטיהור בכל שלוש היציאות על ידי הברגה מלאה של שסתום המחט ימינה וסגירת הזין של תחנת הכניסה והיציאה. הסר את המכסה מכלי הטיהור.

הוסף כמות מספקת של המגיב הספציפית לבדיקה המתוכננת לתא התגובה, כך שמחט המזרק המשמשת להזרקת הדגימות תוכל להגיע לעמודת הנוזלים תוך אימות נוכחות של קו בסיס יציב ורצוי. כדי להתחיל את זרימת גז הטיהור, ודא שמיכל הדלק האינרטי מצויד בווסת דו-שלבי, וחבר את מיכל הדלק האינרטי לכניסת הגז של כלי השיט. לאחר מכן, פתח את השקע של כלי הטיהור ופתח את הגז בלחץ יציאה בווסת של אחד עד חמישה פאונד לאינץ 'מרובע.

לאחר מכן, פתח את הכניסה של כלי הטיהור ופתח באיטיות את שסתום המחט של כלי הטיהור כדי לאפשר זרימת גז ולאמת את המבעבע בתוך כלי הטיהור. כדי להתאים את זרימת הגז, רשמו את לחץ התא שנמדד על ידי גלאי הכימילומינסנציה עם קו המסנן הדיאלקטרי בעל השדה האינטנסיבי המדגים את אוויר הסביבה. מקם מחדש את המכסה על כלי הטיהור וחבר את קו המסנן הדיאלקטרי בעל השדה האינטנסיבי לכלי הטיהור.

השתמש בשסתום המחט כדי להגיע לאותו לחץ תאי ברמת גלאי chemiluminescence המתועדת באוויר הסביבה. כדי להתחיל את תוכנית רכישת האותות chemiluminescence, חבר את היציאה הטורית של גלאי chemiluminescence ליציאה הטורית של המחשב שלתוכה הותקנה תוכנית הרכישה. לאחר מכן, הפעל את תוכנית הניתוח.

לחץ על רכוש ולאחר מכן בחר את התיקיה כדי לשמור את קובץ הנתונים, הקלד את שם הקובץ ולחץ על שמור. בעת הכנה להזרקת דגימה, התאם את סולם המתח על המסך כך שתהיה לו שליטה על קו הבסיס הממוקד על-ידי לחיצה על הלחצנים המינימליים ו/או המקסימום ולאחר מכן הזנת הערך הרצוי. כדי לבצע את הזרקת הדגימה, שטפו את המזרק לפחות פעמיים או יותר במים שעברו דה-יוניזציה וזיקוק לפני משיכת כל דגימה, והבטיחו פליטת מים ללא הפרעה על גבי מגבון משימה.

לאחר מכן, הכנס את המזרק לצינור הדגימה תוך החזקת המזרק והצינור במרחק קרוב ומשוך את הבוכנה לנפח הרצוי תוך הקפדה על כך שלא נלכדו בועת אוויר או חלקים מוצקים שאינם הומוגניים. נקו את קצה המזרק באמצעות מגב משימה והכניסו את המזרק למכסה הסטר ביציאת ההזרקה. לאחר אימות כי קצה המזרק נמצא בתוך השלב הנוזלי, להזריק את הדגימה לתוך תא התגובה.

כדי לסמן את ההזרקה בתוכנה, הקלד את שם הדגימה על ידי לחיצה על התיבה האפורה תחת שמות לדוגמה, ולאחר מכן לחץ על Mark Injection תוך אימות שהזריקה גורמת לשינוי כלפי מעלה באות או כלפי מטה בצריכת תחמוצת החנקן על ידי בדיקת המוגלובין ללא תאים. הקשר בין תגובת המינון בין המוגלובין ללא תאים לבין צריכת תחמוצת החנקן נמדד באמצעות כימילומינסנציה לאחר מעקף לב-ריאה. ניתן להניח כי קיים ריכוז גבוה של קבוצות heme בסטטוס המחומצן של תחמוצת החנקן.

בחולים המקבלים תחמוצת החנקן במהלך מעקף לב-ריאה, במקום זאת, רוב קבוצות ההם מופחתות ואינן צורכות תחמוצת החנקן. מדידות של ריכוז המוגלובין ללא תאים הצביעו על חיסול איטי של פלזמה תוך 12 שעות לאחר מעקף לב-ריאה. עם זאת, צריכת תחמוצת החנקן הגיעה לשיא של 15 דקות ולא שיקפה את חיסול ההמוגלובין ללא תאים.

עקומות הרגרסיה הליניארית של צריכת תחמוצת החנקן על ידי המוגלובין ללא תאים הראו שכיחות של המוגלובין הנצרך תחמוצת מחומצנת ותחמוצת החנקן במשך 15 דקות, לעומת המוגלובין מופחת יותר בנקודת ההתחלה 4 שעות ו-12 שעות לאחר מעקף קרדיו-פולמונרי. ההשפעות של מתן גז תחמוצת החנקן על צריכת תחמוצת החנקן היו מנוטרות. כאשר המטופלים טופלו בגז תחמוצת החנקן תוך-ניתוחי ולאחר הניתוח, העלייה הנצפית של המוגלובין חופשי לאחר מעקף הלב-ריאה לא הוצמדה לעלייה כלשהי בצריכת תחמוצת החנקן.

התוצאות הצביעו על כך שתחמוצת החנקן שניתנה באופן אקסוגני הפחיתה את רוב ההמוגלובין החופשי ומנעה טיהור תחמוצת החנקן. הניסוי תקף רק אם כל התנאים נשארים זהים. אם גובה רמת הנוזל עולה על עמודת התגובה, עלינו לעצור ולבצע כיול חדש.