זיהוי מקור החלבונים המופרשים בכליה על ידי הזרקת ברפלדין A

הטכניקה שלנו מאפשרת לנו לזהות את המקור ואת התרומה היחסית של תאים מייצרי ציטוקינים בכליות פגועות. שימוש בברפלדין A למניעת הפרשת חלבון מאפשר לנו לאסוף מידע נוסף על התאים המייצרים ציטוקינים באיברים מוצקים כמו סוג התא ומצבם של תאים אלה.

הפרוטוקול שלנו צריך להיות מותאם בקלות למערכות איברים רבות. מכיוון שברפלדין A היא מולקולה קטנה חדירה לתאים, היא אמורה לעכב הפרשה ברוב סוגי התאים, ולאפשר זיהוי של ציטוקינים וחלבונים מופרשים אחרים.

הזרקת עצם הזנב היא השלב המאתגר ביותר מבחינה טכנית מכיוון שעצם הזנב של העכבר קטנה למדי. אנו ממליצים לתרגל שלב זה לפני ביצוע הפרוטוקול שלנו על חיות ניסוי.

[מדריך] התחל בהנחת הכלוב חצי, חצי מכרית החימום למשך 10 דקות כדי להבטיח שהעכברים חמים. לאחר הנחת העכבר במכשיר ריסון, יש לחטא את הזנב באמצעות ספוגית יוד ואלכוהול פובידון שלוש פעמים. החזק את הזנב אופקית ודמיין את ורידי הזנב הצדדיים. לאחר מכן הכנס מחט בגודל 28, תוך שמירה על המחט והמזרק מקבילים לווריד לכיוון הראש. הזרקו 200 מיקרוליטר מתמיסת BFA של 1.25 מיליגרם למיליליטר. הווריד אמור להתבהר כאשר הדם מוחלף בתמיסת ההזרקה. לאחר מכן הסר את המחט ולחץ בעדינות על הזנב עד שהדימום ייפסק. החזירו את העכברים לכלוב ועקבו אחריהם לאיתור דימום נוסף או סימני מצוקה. השתמש במזרק של 20 מיליליטר והחדיר את העכבר עם 10 עד 20 מיליליטר PBS דרך החדר השמאלי בקצב זרימה של שניים עד ארבעה מיליליטר לדקה עד שהפרפוזה מתבהרת. הסר את הכליות על ידי החזקת עורק הכליה והווריד קרוב לפפילה וחיתוך הכלי בצד הרחק מהכליה. לאחר מכן הסר בעדינות את קפסולת הכליה על ידי קילוף ביד או עם זוג מלקחיים סטריליים עדינים. השתמש בעט סמן מחסום הידרופובי ותאר את קטעי הרקמה תוך שמירה על מרחק של לפחות חמישה מילימטרים מהרקמה למתאר המחסום ההידרופובי. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר חוסם המכיל 3% סרום חמור ו-0.1% טריטון באלבומין סרום בקר 1% TBS על גבי הקטע. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה בתא לח. לדלל את הנוגדנים העיקריים עם PBS בריכוז המתאים. כדי לזהות ציטוקינים, יש לדלל נוגדנים המכוונים כנגד TGF beta one, PDGF-D או CTGF ב-50 מיקרוליטר של PBS. הוסף נוגדן ראשוני Anti-Alpha SMA מצומד עם Cy3 לתמיסת הנוגדנים העיקרית בדילול של 1:200 כדי לסמן את המיופיברובלסטים. הסר את המאגר החוסם והוסף את הנוגדנים העיקריים לקטע, וודא שהוא לא ידלוף החוצה מהמתאר ההידרופובי המעגלי. דגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בתא לח. הסר את החדר הלח מהחממה ושטוף את השקופיות עם PBS שלוש פעמים למשך חמש דקות. לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדנים המשניים המתאימים מ-1 עד 200 עם PBS. דגרו את הדגימות עם 50 מיקרוליטר של תמיסות נוגדנים משניות למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח. הסר את השקופיות מהתא הלח ושטוף עם PBS למשך חמש דקות. לדלל לקטין לוטוס טטרגונולבוס מצומד עם פלואורסצאין ב-PBS עם סידן ומגנזיום בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן דגרו את הרקמות עם 50 מיקרוליטר תמיסת LTL למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח. הסר שקופיות מהתא הלח ושטוף אותן עם PBS עם סידן ומגנזיום למשך חמש דקות. דגרו על הרקמות עם 50 מיקרוליטר DAPI כדי לצבוע גרעיני DNA למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שטפו פעם אחת עם PBS. הוסף 20 מיקרוליטר של מגיב הרכבה נגד דהייה לרקמה כדי להרכיב את החלקות הכיסוי, ולאחר מכן הנח לאט את החלקת הכיסוי. המתן 24 שעות עד שהמגיב נגד דהייה יתמצק לפני ההדמיה. הפעל את המיקרוסקופ ההפוך עם XY אוטומטיtagה ובחר את המטרה פי 20. הנח את השקופית על במת המיקרוסקופ ואתר את קטע הרקמה. לאחר מכן פתח את תוכנת רכישת התמונות ולחץ על שידור חי כדי לפתוח את החי view חלון. מצא את קטע הרקמות וודא שהוא בפוקוס. לחץ על תפריט הרכישה ובחר סרוק תמונה גדולה. הגדר את האזור לסריקה על ידי הזזת הבמה באמצעות הג'ויסטיק לחלק השמאלי ביותר של קטע הרקמה ולאחר מכן לחץ על החץ שמאלה. חזור על פעולה זו עבור מקטעי הרקמה העליונים, הימניים והתחתונים. לחץ על תפריט הרכישה וודא שתיבת הסימון ללכידה רב-ערוצית מסומנת. כדי לצלם תמונות מרובות ערוצים, לחץ על הכרטיסייה lambda, לחץ על כל ערוץ והגדר את זמן החשיפה לרמה שבה הצביעה נראית לעין מבלי להרוות חלק כלשהו מהתמונה. חזור על פעולה זו עבור כל ערוץ שיש לאסוף. לאחר מכן לחץ על סריקה. פתח את תוכנת רכישת התמונות ולחץ על קובץ. לאחר מכן לחץ על פתח ובחר את התמונה. לחץ לחיצה ימנית על חלון התמונה ובחר ROI מצולע. תאר את החזר ה-ROI עם כלי ביד חופשית. לאחר מכן תאר את תאי הצינורית החיוביים LTL או תאי הביניים החיוביים של אלפא SMA. לחץ על לשונית המדידה ולאחר מכן על הסף. הגדר את גבולות הסף העליונים והתחתונים על ידי התאמת המחוונים לכל צד של אזור האות החיובי. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה ROI. לבסוף לחץ על סמל הייצוא כדי לשמור את הערכים. השתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי לחשב את האחוזים של אזור האות החיובי לפי אזור החזר ROI.

[מגישה] שלפוחיות TGF חיוביות לבטא ביום השלישי לאחר מתן ציספלטין או מי מלח מוצגות בתמונות המייצגות. שלפוחיות TGF חיוביות לבטא נצפות ב-PTCs המסומנים ב-LTL בכליות שטופלו בציספלטין בנוכחות BFA. עם זאת, שלפוחיות אלו לא נצפו בכליות לא פצועות או BFA לא מטופלות.

[מדריך] השינוי חשף עלייה באזור החיובי לבטא TGF עם טיפול BFA בפגיעה כלייתית חריפה הנגרמת על ידי ציספלטין. בדומה ל-TGF beta, שלפוחיות חיוביות ל-PTGF-D או CTGF חיוביות הצטברו גם עם טיפול ב-BFA ב-AKI המושרה על ידי ציספלטין. הכימות הראה כי אזורים חיוביים ל-PDGF-D ו-CTGF היו גם הם מוגברים באופן משמעותי עם BFA בתאי צינורית פרוקסימליים חיוביים ל-LTL, הזרקת BFA לא העלתה משמעותית את רמות ה-BUN בפלזמה ביום השלישי לאחר הזרקת ציספלטין. שלפוחיות חיוביות ל-TGF בטא נצפו בתאי ביניים עם תווית אלפא SMA בציספלטין AKI עם טיפול ב-BFA. השינוי גילה כי האזורים החיוביים לבטא TGF באזור החיובי לאלפא SMA גדלו באופן משמעותי עם טיפול ב-BFA בציספלטין AKI. בדומה לשלפוחיות TGF חיוביות לבטא, גם שלפוחיות חיוביות ל-CTGF עלו עם טיפול ב-BFA. כימות הראה כי טיפול ב-BFA שיפר את היחס בין האזור החיובי ל-CTGF לאזור החיובי של אלפא SMA ב-AKI המושרה על ידי ציספלטין. בהשוואה לפגיעה הנגרמת על ידי ציספלטין, שלפוחיות חיוביות ל-TGF-beta ב-PTCs היו קטנות בהרבה בשלב הכרוני של AA. היה מכתים חיוביים מינימליים ב-PTCs חיוביים ל-LTL. עם זאת, עוצמת האות של TGF beta במולקולת פגיעה בכליות 1 PTCs חיוביים עלתה עם טיפול BFA. רמת העוצמה הממוצעת של TGF beta הייתה גבוהה פי שלושה עם הזרקת BFA מאשר ללא BFA.

השלב הקריטי ביותר הוא להבטיח שהזרקת וריד הזנב מוצלחת. זריקה כושלת תביא לתוצאות. אז בבקשה חפשו את סימני ההצלחה כמו הווריד שמתבהר עם ההזרקה ובבקשה חפשו את סימני הכישלון כמו נפיחות מעל הזנבות.

ניתן לשלב את הזרקת ברפלדין A עם מספר בדיקות כולל כתם מערבי או ציטומטריית זרימה כדי להעריך את ייצור הציטוקינים בקנה מידה של איבר או תא בודד.

באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לזהות ציטוקינים חדשים המופרשים על ידי תאי אפיתל כליה שבעבר חשבו שמגיעים מסוגי תאים אחרים. ניתן להשתמש בו כדי ליישב ויכוחים ארוכי שנים לגבי תרומתם של סוגי תאים ספציפיים לפגיעה.